一、技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种产3-羟基丙酸的转化微生物 及其构建方法和应用。
二、背景技术
现有技术：3-羟基丙酸(3-hydroxypropanoate，3-HP)是一种重要的功能有机 酸。它易溶于水、乙醇、乙醚，可以通过化学工业中一系列成熟的催化技术转化 为具有重要商业价值的化学品，如通过脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇 酯化反应生成酯，以及经还原反应生成3-羟基丙酸等；3-HP还具有潜在的生物应 用：例如在营养工业中，可使用3-HP作为食品和饲料添加剂或防腐剂，在一些植 物体内的内生真菌中存在微量的3-HP，发现其具有杀灭寄生线虫的能力；另外， 还可作为单体原料用以合成聚3-羟基丙酸[P-(3HP)]，聚3-羟基丙酸是一种新型生 物可降解高分子，它不但具有良好的生物降解性和生物相容性，而且高分子量的 [P-(3HP)]具有很高的机械强度和拉伸强度(>400MPa)以及较大的断裂伸长率等优 异性能。而我国在该领域的研究才刚刚起步，3-羟基丙酸的应用潜力有待开发。
目前微生物生产3-羟基丙酸主要有三种途径
1、微生物转化非糖基原料生产3-羟基丙酸，
2、微生物利用3-羟基丙酸循环途径微量积累3-羟基丙酸
3、以Cargill公司和威斯康星大学等研究机构为代表的构建基因工程菌生产3- 羟基丙酸，主要有两种方案：
(1)以葡萄糖为底物，在大肠杆菌中构建经乙酰-CoA的5种代谢途径
(2)以甘油为底物，在大肠杆菌中导入甘油脱水酶基因，
3-羟基丙酸是少数耐热微生物(Chloroflexus aurantiacus)胞内羟基丙酸循环 途径固定CO2过程的代谢中间物，其作为中间代谢物，通常情况难以高效率大量 积累，这是由于中间产物的积累都必将破坏微生物中CO2固定循环途径的持续进 行。迄今，在自然界中尚未发现能直接利用糖质原料或甘油高效转化生产3-HPA 的微生物，但3-羟基丙酸循环途径所涉及到的关键酶对于今后构建模式基因工程 菌生产3-羟基丙酸将有重大指导意义。
三、发明内容
技术问题：本发明针对上述技术空白，提供一种产3-羟基丙酸的转化微生 物及其构建方法和应用。
技术方案：一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码 SEQ ID NO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。
一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列 导入到宿主。
制备转化体方法中所述宿主为肺炎克雷伯氏菌。
制备转化微生物的方法为：利用PCR技术从醋酸杆菌基因组中扩增出如 SEQ ID NO.2所示含2328个碱基对的醛脱氢酶基因aldH，从质粒载体 pHY300PLK中扩增出如SEQ ID NO.3所示含1560个碱基对的四环素抗性基因 TetR，将其串联到表达载体pUC18中，得到重组质粒pUC18-aldH--TetR，重组质 粒转化筛选获得的肺炎克雷伯氏菌，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
制备转化微生物的方法，制备步骤为：
(1)基因aldH的克隆：根据Genebank公布的醋酸杆菌中aldH基因的序列设 计合成PCR所需的引物：
P1：51-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-31
P2：51-TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA-31
引物两端分别引入EcoR I，Xba I酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模 板完成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃ 30sec，52℃ 30sec， 72℃1min40sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析 确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列 测定，EcoR I，Xba I酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连 接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aldH；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计 合成PCR所需的引物：
P3：51-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31
P4：51-AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31
引物两端分别引入PstI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反 应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min20 sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经SmaI，HindIII酶 切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-aldH载体，得到重组质粒pUC18-aldH- TetR；
(3)转化微生物的获得：将重组质粒pUC18-aldH-TetR通过电击转化的方式转 化肺炎克雷伯氏菌，涂布含40μg/m L的四环素平板，挑取阳性转化子，得到重 组肺炎克雷伯氏菌。
含有重组载体的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用。
转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用，生产工艺为：种子液的培养：将接 种后的培养液在31-37℃，摇床转速120-180r/min的条件下培养12-24h；所述培 养液组成为：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10 g/L，四环素浓度20-40μg/L；发酵培养：培养条件为接种种子液的量为5-10％ (v/v)，发酵温度31-37℃，接种6-8小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓 度1.0mmol/L，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境，发酵时间30h左右； 其中培养基组成为：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5 g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25- 35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
有益效果：本发明在于提供一种转化微生物，用于发酵产3-羟基丙酸，该菌 在有氧或微氧条件下利用甘油高效发酵产3-羟基丙酸。摇瓶发酵完毕，最终3-羟 基丙酸浓度达2.6～3.3g/L，摩尔转化率在40-68％之间，经5L罐发酵实验，最终 3-羟基丙酸浓度高达8.2g/L，实现了在特定宿主细胞中生产3-羟基丙酸的过程， 为微生物发酵法工业化生产3-羟基丙酸奠定了良好的理论基础。与原始克雷伯氏 菌相比，产生了一种新代谢产物3-羟基丙酸。与目前文献所报道利用基因手段构 建重组微生物生产3-羟基丙酸方法相比，不仅质粒在宿主菌株中稳定性高，而且 生产菌株较合适，产物终浓度有竞争力(目前文献所报道的利用基因工程手段改 造大肠杆菌生产3-羟基丙酸的产量在5g/L以下)，另外还可在发酵过程中添加微 量四环素，达到抑制部分杂细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的 染杂菌现象，发酵时间也有所缩短，为微生物发酵法工业化生产3-羟基丙酸奠定 了良好的基础。
四、附图说明
图1为载体图谱示意图；
图2为外源基因在宿主细胞Klebsiella pneumoniae中成功表达的SDS-PAGE图 谱；图中Lane 1：蛋白质Marker；Lane 2：经诱导的重组菌；Lane 3：未经诱导 的重组菌；Lane 4：加入诱导剂的原始菌；Lane：未加入诱导剂的原始菌； 图3为色谱图，其中(a)标准混合液；(b)发酵液；图中1.甘油Glycerol，2.3- 羟基丙酸，3.乳酸Lactic acid，4.甲酸Formic acid，5.乙酸Acetic acid。
五、具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件如Joe Sambrook、David Russell等人，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》3rd ed(Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR的构建
(1)基因aldA的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中aldA基因 的序列(SEQ ID No.2)设计合成PCR所需的引物：
P1(SEQ ID No.4)：51-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-31
P2(SEQ ID No.5)：51-TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA-31
引物两端分别引入EcoR I，Xba I酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完 成PCR反应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec， 72℃1min40sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析 确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列 测定，EcoR I，Xba I酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连 接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aldH；
(2)基因TetR的克隆：根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列(SEQ ID No.3)设计合成PCR所需的引物：
P3(SEQ ID No.6)：51-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31
P4(SEQ ID No.7)：51-AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31
引物两端分别引入PstI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反 应：PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min20 sec 30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经SmaI，Hind III酶 切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-aldH载体，得到重组质粒pUC18-aldH- TetR。
实施例2：重组质粒pUC18-aldH-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae 25955(从ATCC获得，菌种号：Klebsiella pneumoniae ATCC25955)
利用电击穿孔仪将重组质粒pUC18-aldH-TetR转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae 25955，电转化条件参数为：电压2.5kV，阻值200Ω，脉冲时间4.5 msec。电击转化完毕，将经过电击处理过的Klebsiella pneumoniae ATCC25955涂 布于含有40μg/mL四环素的LB培养基上，得到阳性克隆Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR。
实施例3：工程菌Klebsiella pneumoniae 25955-3-pUC18-aldH-TetR的质粒稳定性 考察
考察方法：从新鲜转化平板上挑取单菌落接种至3mL不含四环素的LB培养 基中，37℃培养种子12h作种子，转种培养24h，即为传种20代，转种培养5 次，即为100代，将上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上，从中挑选100个单 菌落分别点在添加和不添加四环素的平板上，37℃培养12-16h，比较在添加和 不添加四环素的平板上的菌落数即得其稳定性。
考察结果：传种100代之后其质粒稳定性为99％。
实施例4：工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR利用甘 油在摇瓶中发酵产3-羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L， NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转 速120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5 g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
培养条件：接种量为占培养基体积的10％，发酵温度31-37℃，接种6小时 好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0mmol/l，此后，控制氧气的通入 量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵时间30h左右。
发酵结果：30g底物甘油经转化得到2.6g/L 3-羟基丙酸。
对比例1：原始菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955利用甘油在摇瓶中发酵产3- 羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L， NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转 速120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5 g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
发酵培养条件：250mL摇瓶，装液量100mL，接种量10％(占培养基体 积)，发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度 1.0mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发 酵时间30h左右。
发酵结果：30g底物甘油消耗完毕，未检测到3-羟基丙酸生成。
实施例5：工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR利用甘 油在3L发酵罐中产3-羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955-3-pUC18-aldH-TetR；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L， NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转 速120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5 g/L，NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25-35mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
培养条件：3L发酵罐(New Brunswick Scientific，NJ)接种量10％(v/v)， 发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0 mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵 时间30h左右。
发酵结果：80g底物甘油经转化得到8.2g/L 3-羟基丙酸。
对比例2：原始菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955利用甘油在3L发酵罐中产 3-羟基丙酸
(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae ATCC25955；
(2)种子培养基：酵母膏4-5g/L，麦芽3.0-4.0g/L，蛋白胨4-5g/L，NaCl 10g/L，四环素浓度20-40μg/L；
种子培养：250mL三角瓶，装液量35mL，培养温度31-37℃，摇床转速 120-180r/min，培养12-24h。
(3)发酵培养：
培养基组成：酵母膏4-5g/L，K2HPO4·3H2O 8-10g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L， NH4Cl 0.8-1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 25-35 mg/L，CoCl2·6H2O 4-6mg/L，VitaminB12 5mg/L，glycerol 30g/L。
培养条件：3L发酵罐(New Brunswick Scientific，NJ)接种量10％(v/v)， 发酵温度31-37℃，接种6小时好氧发酵，加入IPTG，IPTG的最终浓度1.0 mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵 时间30h左右。
发酵结果：80g底物甘油消耗完毕，未检测到3-羟基丙酸生成。
序列表
<110>南京工业大学
<120>产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用
<160>7
<210>1
<211>2714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(2714)
<400>1
<210>2
<211>2328
<212>DNA
<213>aldH
<400>2
<210>3
<211>386
<212>DNA
<213>Zeocin
<400>3
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>合成引物
<400>4
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>合成引物
<400>5
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>合成引物
<400>6
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>合成引物
<400>7