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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610309761.4 (22)申请日 2016.05.11 (83)生物保藏信息 CGMCC No.12169 2016.04.13 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人 郝瑞霞杨诗琴鲁安怀姜源 王明粲 (74)专利代理机构 北京万象新悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11360 代理人 李稚婷 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/66(200。
2、6.01) C02F 101/20(2006.01) (54)发明名称 一种聚多曲霉及其应用 (57)摘要 本发明公布了一种聚多曲霉及其应用， 该菌 命名为聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS- DXH， 保藏中心登记号为CGMCCNo.12169。 聚多曲 霉(Aspergillussydowii)AS-DXH能够有效附 铅， 可用于铅污染环境， 特别是含铅污染水体的 治理， 并可开发出相应的环保生物制剂。 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 105802861 A 2016.07.27 CN 105802861 A 1.一种聚多曲霉(Aspergillussydow。
3、ii)AS-DXH， 其保藏中心登记号为CGMCC No.12169。 2.保藏中心登记号为CGMCCNo.12169的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH的一 种培养方法， 用成分如下的含铅培养基进行培养： 牛肉膏1g， 蛋白胨3g， 酵母粉0.5g， 葡萄糖 3g， NaCl2g， NaNO30.5g， MgSO47H2O0.005g， NH4Cl0.1g， Pb(NO3)21.33g， 琼脂18g， 去离 子水1L。 3.如权利要求2所述的培养方法， 其特征在于， 培养温度为2535， 培养时间312 天。 4.保藏中心登记号为CGMCCNo.12169的聚多曲霉。
4、(Aspergillussydowii)AS-DXH在治 理环境污染中的应用。 5.如权利要求4所述的应用， 其特征在于， 利用聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS- DXH吸附环境中的铅。 6.一种铅污染水体的治理方法， 在铅污染水体中加入经过富集培养的聚多曲霉 (Aspergillussydowii)AS-DXH进行培养。 7.保藏中心登记号为CGMCCNo.12169的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH在制 备用于吸附铅的生物制剂中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105802861 A 2 一种聚多曲霉及其应用 技术领域 0001 本。
5、发明涉及聚多曲霉的新菌株， 包括该菌株的培养方法及该菌种在环境污染治理 中的应用， 属于微生物技术领域。 背景技术 0002 铅是一种密度大、 质地软、 熔点低、 抗张强度小的重金属元素， 用途广泛， 可用作电 缆、 蓄电池、 铸字合金、 巴氏合金、 防X射线和 射线等的材料。 水体中的铅主要来源于岩石矿 物溶出和含铅矿山开采、 铅冶炼废水排放等工业生产过程。 重金属在水体中积累到一定的 水平就会对水体-水生植物-水生动物系统产生严重危害， 并通过食物链影响到人类以及其 他动植物的健康安全。 含铅废水对生物生长、 生态发展有着严重的危害， 相比传统方法， 微 生物吸附率高、 速率快、 具有选择。
6、性、 操作简单、 来源广泛， 拥有广阔的开发前景。 0003 污染物的处理方法很多， 大致分为沉淀法、 吸附法、 离子交换法、 电解法、 生物氧化 塘法、 生物吸附法。 其中生物处理方法处理效果好、 费用低、 技术和应用简单。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种有效吸附铅的新菌株， 并将其应用于环境污染的治理， 特别是污染水体中铅的生物治理。 0005 本发明所提供的能有效吸附铅的新菌株是聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS- DXH， 已于2016年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为 CGMCC， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7、中国科学院微生物研究所)， 保藏中心登记号 为CGMCCNo.12169。 0006 本发明的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH为好氧菌， 可以用以下的含铅 培养基进行培养： 牛肉膏1g， 蛋白胨3g， 酵母粉0.5g， 葡萄糖3g， NaCl2g， NaNO30.5g， MgSO47H2O0.005g， NH4Cl0.1g， Pb(NO3)21.33g， 琼脂18g， 去离子水1L。 培养温度为2535 ， 培养时间312天。 0007 30下， 在不含铅的平板培养基上培养， 接种后第二天开始迅速生长， 可见菌落， 直径大约3mm， 正面为纯白色， 第三天开始向浅黄。
8、色转变， 背面为明显的黄色， 说明此时代谢 产物为黄色； 之后一直保持生长的状态， 直至菌落铺满平板， 菌体逐渐变为浅褐色， 边缘具 有浅色的菌丝体， 背面变为褐色， 质地为丝绒状至厚絮状， 致密， 黏着扩展， 表面不平整。 0008 扫描电镜下， 该聚多曲霉孢子形状不规则， 孢子头似青霉状， 呈弯曲疏松柱形或散 乱， 孢子梗一般长140-210 m， 孢子囊较小， 呈椭球形， 直径25-30 m， 孢子间相互缠绕， 错综 复杂， 并形成较大空隙。 0009 本发明的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH可以在含铅的培养基中生长。 在含有4mmol/L铅的平板培养基上， 。
9、生长明显放缓， 第三天可见大量小菌落， 直径约2mm， 正 面逐渐由白色变为绿色(覆盖在菌落上)， 背面为白色， 第五天左右生长即完全停止， 表面粗 糙， 并出现黄色的代谢产物。 说明书 1/4 页 3 CN 105802861 A 3 0010 吸附铅之后， 该聚多曲霉孢子头部更为饱满， 链状更为明显， 同时在类似于孢子梗 的部分发现了铅的富集， 局部铅含量可以达到5以上。 本发明的聚多曲霉(Aspergillus sydowii)AS-DXH可以有效附溶液中的铅离子(吸附率最高可达到100)， 因此， 可用于含铅 污染物， 特别是含铅污染水体的治理。 0011 在上述基础上， 本发明提供了。
10、一种铅污染水体的治理方法， 在铅污染水体中加入 经过富集培养的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH并培养， 直至水体中铅离子浓度 不再发生变化。 0012 本发明的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH能够有效吸附铅， 可借此开发 出相应的环保生物制剂， 在含铅污染环境的生物治理或生物修复中具有较高的研究和应用 价值。 0013 生物材料的保藏 0014 本发明的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH于2016年4月13日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1 号。
11、院3号中国科学院微生物研究所)， 保藏编号为CGMCCNo.12169。 附图说明 0015 图1.聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH的环境扫描电镜照片。 0016 图2.未吸附铅的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH的EDX能谱测量结果。 0017 图3.聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH吸附铅之后的环境扫描电镜照片 (均加倍散色)， 其中(a)放大400倍， (b)放大3000倍。 0018 图4.聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH吸附铅之后的EDX能谱测量结果。 0019 图5.聚多曲霉。
12、(Aspergillussydowii)AS-DXH吸附铅的曲线。 0020 图6.聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH吸附铅过程中溶液pH变化曲线， 其 中(a)中曲线对应的铅初始浓度分别为0、 100ppm和200ppm， (b)中曲线对应的铅初始浓度分 别为400ppm、 600ppm和800ppm。 0021 图7.聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH吸附铅过程中溶液Eh值变化曲线， 其中(a)中曲线对应的铅初始浓度分别为0、 100ppm和200ppm， (b)中曲线对应的铅初始浓度 分别为400ppm、 600ppm和800ppm。 。
13、具体实施方式 0022 下面借助实施例更详细地描述本发明， 但本领域的技术人员应该理解： 在不脱离 本发明及所附的权利要求的精神和范围内， 各种替换和修改都是可能的。 因此， 本发明不应 局限于实施例所公开的内容， 本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。 0023 下述实验方法如无特别说明均为常规方法， 所有培养基中的溶剂均为水。 0024 富集培养基： NaCl0.5g， NaNO30.5g， MgCl20.01g， NH4Cl0.1g， 牛肉浸膏1.0g， 胰 蛋白胨3.0g， 酵母粉3.0g， 葡萄糖3.0g， 去离子水1L， pH5.0。 0025 分离培养基： 牛肉浸膏1.。
14、0g， 胰蛋白胨3.0g， 酵母粉3.0g， 葡萄糖3.0g， 琼脂18g， NaCl0.5g， NaNO30.5g， MgCl20.01g， NH4Cl0.1g， Pb(NO3)21.3g， 去离子水1L， pH5.0。 0026 仪器： 振荡培养箱、 恒温培养箱 说明书 2/4 页 4 CN 105802861 A 4 0027 实施例1： 聚多曲霉的分离、 纯化和鉴定 0028 本发明的聚多曲霉菌株分离自江西省上饶德兴市德兴铜矿采矿场周边土壤， 称取 5.0g土样， 置于250mL已灭菌富集培养基中， 在温度为30， 转速为160r/min振荡培养箱中 富集培养3天。 用接种环蘸取富集培。
15、养3天的菌液， 运用分区划线分离法， 后利用分离培养基 中Pb2+对菌种的选择作用， 对菌液中的菌种进行分离、 筛选。 连续分离、 纯化数次后可得到能 够耐受浓度约4mmol/L的Pb2+的菌株。 0029 配制250mL富集培养基， 0.4mol/LPb(NO3)2溶液20mL。 共同高压灭菌后， 在超净工 作台中， 在富集培养基中缓慢添加2.5mL0.4mol/LPb(NO3)2溶液， 则其Pb2+浓度约为 4mmol/L。 将分离得到的菌株接种于其中， 在温度为30， 转速为160r/min振荡培养箱中培 养。 每2天从中取一次样， 用原子吸收分光光度法测溶液中剩余铅浓度， 每次测3遍，。
16、 取平均 值， 连续培养、 测量2周， 以判断所分离到的菌株是否能够固定培养基中的Pb2+。 其中编号为H 的菌株能够在铅浓度为4mmol/L的培养基中生长， 且可以固定培养基中的Pb2+， 经18SrRNA基 因的部分序列比对分析， 将该菌株鉴定为聚多曲霉(Aspergillussydowii)， 将其命名为聚 多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH。 该菌株已于2016年4月13日保藏于中国普通微生 物菌种保藏管理中心(简称为CGMCC， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所)， 保藏编号为CGMCCNo.12169。 0030 扫描电镜下， 。
17、如图1所示， 该聚多曲霉孢子形状不规则， 孢子头似青霉状， 呈弯曲疏 松柱形或散乱， 孢子梗一般长140-210 m， 孢子囊较小， 呈椭球形， 直径25-30 m， 孢子间相互 缠绕， 错综复杂， 并形成较大空隙。 0031 吸附铅之后， 如图3所示， 该聚多曲霉孢子头部更为饱满， 链状更为明显， 同时在类 似于孢子梗的部分发现了铅的富集， 局部铅含量可以达到5以上。 0032 图2显示了未吸附铅的聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH的EDX能谱测量结 果， 图4显示了聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH吸附铅之后的EDX能谱测量结果， 对 比。
18、两图， 可以看出， 聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH能够在铅浓度较高的环境下存 活， 并具有吸附铅的能力。 0033 实施例2： 铅吸附 0034 将已经在富集液体培养基中培养四天的实验用菌体取出， 分别加入至不同铅离子 浓度的溶液中， 置于振荡培养箱中培养(30， 150r/min)， 每天同一时间在超净工作台中对 各个溶液进行取样， 分别测其pH及铅离子浓度， 直至吸附完成， 溶液中铅离子浓度不再发生 变化。 0035 计算菌种对铅的吸附率并绘制吸附曲线， 进而探究不同的初始铅离子浓度对真菌 吸附的影响。 绘制吸附过程的pH变化曲线， 分析变化趋势。 结果如下表。
19、1， 以及图5至图7所 示。 0036 表1中， 在溶液初始铅浓度分别为100ppm、 200ppm、 400ppm、 600ppm和800ppm下， 聚 多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH对溶液中铅离子完成吸附的时间及吸附率， 可以看 到， 即使在高达800ppm的铅离子浓度下， 聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH的吸附率 仍在80以上。 0037 表1.聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH对铅的吸附效果 说明书 3/4 页 5 CN 105802861 A 5 0038 铅初始浓度 吸附天数 吸附率 100ppm 7。
20、 100 200ppm 8 90 400ppm 11 70 600ppm 11 73 800ppm 12 80 0039 图5表现了铅初始浓度为100ppm、 200ppm、 400ppm、 600ppm和800ppm的溶液在聚多 曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH的作用下， 分别完成吸附的速率和时间， 从图中看到， 在聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH生长的初期吸附速率相对较快， 这是因为生活 环境营养充足， 聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH在快速生长繁殖， 到中期， 有一个 微小的速率升高， 但很快减缓， 并进入吸。
21、附速率慢的阶段， 此时， 聚多曲霉(Aspergillus sydowii)AS-DXH基本到达环境可容最大值。 0040 图6为在聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH进行铅吸附过程中， 溶液的pH随 时间的变化曲线。 溶液的pH经历了先下降后上升的过程， 溶液pH在最低时可达4左右， 之后 迅速上升并立刻达到平稳水平， 最终溶液pH在8.5左右， 说明聚多曲霉(Aspergillus sydowii)AS-DXH最终代谢产物为碱性。 0041 图7为在聚多曲霉(Aspergillussydowii)AS-DXH进行铅吸附过程中， 溶液的Eh随 时间的变化曲线。 与pH相对应， 溶液的Eh为先升后降， 由初始的氧化环境最后变为还原环 境。 说明书 4/4 页 6 CN 105802861 A 6 图1 图2 说明书附图 1/5 页 7 CN 105802861 A 7 图3 图4 说明书附图 2/5 页 8 CN 105802861 A 8 图5 说明书附图 3/5 页 9 CN 105802861 A 9 图6 说明书附图 4/5 页 10 CN 105802861 A 10 图7 说明书附图 5/5 页 11 CN 105802861 A 11 。