技术领域
本发明涉及食品和生物样品中含有的微生物、工业用水和自来水 等环境中含有的微生物的检测方法、以及微生物检测试剂盒。进一步 详细来说，本发明涉及能够选择性地检测食品和生物样品、工业用水 和自来水等环境中含有的微生物的活菌(生菌)的检测方法、以及微生物 检测试剂盒。
背景技术
以前采用平板培养法测定食品、生物样品、或者环境中的总活菌 数。但平板培养法需要两天左右的时间才能得到结果。
由于食品灭菌技术和加工技术的提高，对鉴别即使微量存在于被 测样品中的微生物的生死状态的需求也正在提高。特别是在食品卫生 检查和临床检查领域中，作为细菌的迅速检测方法，尝试了通过PCR 法将各细菌的特异基因扩增至视觉上可观察到的量，以鉴别各细菌是 否存在以及对其进行定量。但是，当以细菌的DNA为靶标(target)时， 被测样品中原来含有的死菌的背景(background)也被检测到，因此，用 PCR法得到阳性结果时，并不一定表明存在活菌。因此，在食品卫生、 临床检查领域，存在虽然PCR灵敏度高且迅速但并未广泛应用的现状。
最近，正在尝试以mRNA为靶标，通过逆转录酶制备cDNA后， 使用各细菌的特异引物进行PCR，仅对被测样品中的活菌进行检测和 定量的方法。但是，这种方法并不能抑制死菌本身的mRNA的逆转录， 并且当被测样品中含有104cfu/ml或104cfu/g以上的死菌时，会导致检 测到死菌的背景，因此也不能说该方法是充分地判定存活与死亡的方 法。
具体而言，专利文献1和专利文献2记载的方法中公开了利用PCR 法鉴别细菌等微生物存活与死亡的方法。然而，这些利用PCR法鉴别 细菌等微生物存活与死亡的方法存在如下所述问题。
上述专利文献1的技术列举了：在进行100℃、10～30分钟高温长 时间加热灭菌的一部分煮沸(boil)食品中对死菌的鉴别、以及在进行乙 醇灭菌或甲醛灭菌的食品中对微生物的鉴别，但尤其是对于后者，实 际上不存在进行那样灭菌处理的食品。此外，未设想以下检测：在实 施了现在食品工业上作为主流灭菌方法的低温保持灭菌(LTLT灭菌)、 高温短时间灭菌(HTST灭菌)或者超高温瞬间加热灭菌(UHT灭菌)的食 品中仅对存活微生物的检测；在接受抗生素治疗的感染症患者中的临 床样本中仅对存活的特定病原菌等的检测。另外，专利文献1的技术 中，当被测样品中死菌背景以104cfu/ml以上的浓度存在于食品或临床 样本时，则来自死菌的PCR最终扩增产物量超出检测限，导致无法鉴 别被测样品的PCR阳性反应是来自活菌还是来自死菌。
此外，上述专利文献2的技术公开了鉴别活菌和死菌的方法，该 方法利用了死细胞的RNA/DNA摩尔比与活细胞的RNA/DNA摩尔比 相比相对降低。该方法为：提取总RNA(total RNA)，利用逆转录反应 来制备互补DNA后，进行PCR并算出其Ct值，根据另外制作的标准 曲线求出RNA的摩尔浓度，另一方面，通过PCR扩增与该RNA相应 的染色体DNA区域并求出Ct值，再通过上述标准曲线算出染色体DNA 的摩尔浓度，由此求算RNA/DNA的摩尔比。也就是说，上述操作必 须进行繁杂的总RNA提取，并且需要逆转录反应-PCR两个步骤，因 此，在定量性和迅速性方面，劣于通常的以DNA为靶标的PCR。并且， 活菌中不断产生RNA，而来自死菌的RNA在早期被分解，因此稳定 性欠佳。另外，含有高浓度死菌的食品、临床样本中只能检测到其1/10 浓度的活菌。因此，很难用于要求迅速、高灵敏度及精确度的食品卫 生检查和临床检查。
专利文献1：日本特表2003-530118号公报
专利文献2：国际公开第2002/052034号公报
发明内容
本发明的课题在于提供与死菌(Dead cell)或损伤菌(损伤菌 (Injured cell)或者活而非可培养菌(Viable-but-Non Culturable cell)；“VNC cell”)相比，选择性地检测食品或生物样品中含有的微生物 的活菌(Live cell)(活且可培养菌(Viable-and-Culturable cell))的方法， 即，提供直接保留了培养法特性的迅速替代检测方法、以及用于实施 该方法的试剂盒。
本发明人对能适用于各种灭菌方法的、适合检测灵敏度高的食品 卫生检查的微生物存活死亡的鉴别法、以及能够检测医院活临床现场 中感染症患者的特定病原菌的方法进行了深入研究，结果发现，在鉴 别被测样品中微生物的活菌和损伤菌的方法中，用交联剂(该交联剂是， 通过350nm～700nm波长的光照射可使DNA交联的交联剂)处理被测样 品，再用具有350nm～700nm波长的光对所述样品进行照射，除去上述 交联剂后，添加适合培养被测样品中所含的微生物的培养基并保温一 定时间，再次用上述交联剂进行处理，并用具有350nm～700nm波长的 光进行照射，然后利用核酸扩增反应来选择性扩增微生物中的染色体 DNA，从而可以迅速地进行上述鉴别，进而完成了本发明。
即，本发明提供用于检测被测样品中微生物的活菌的方法，该方 法包括以下工序。
a)向上述被测样品中添加交联剂的工序，该交联剂利用 350nm～700nm波长的光照射使DNA交联；
b)对添加了交联剂的被测样品进行350nm～700nm波长的光照射处 理的工序；
c)除去经光照射处理的被测样品中所含的交联剂的工序；
d)向除去了交联剂的被测样品中添加培养基并保温的工序；
e)向经保温的被测样品中再次添加交联剂的工序，该交联剂利用 350nm～700nm波长的光照射使DNA交联；
f)对添加了交联剂的被测样品进行350nm～700nm波长的光照射处 理的工序；
g)从上述被测样品中提取DNA，用核酸扩增法来扩增所提取的 DNA的靶区域(target region)的工序；以及
h)解析扩增产物的工序。
上述方法优选的实施方式是，用微生物的标准样品制成表示微生 物量与扩增产物之间关系的标准曲线，使用该标准曲线对上述扩增产 物进行解析。
另外，上述方法优选的实施方式是，上述核酸扩增法为PCR法、 LAMP法、SDA法、LCR法或者DNA微阵列法。
另外，上述方法优选的实施方式是，采用实时PCR法进行上述 PCR，并且PCR与扩增产物的解析同时进行。
另外，上述方法优选的实施方式是，上述被测样品为食品、血液 样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品、胸水(pleural effusion)样品、 工业用水、自来水、地下水、河水或雨水中的任一种。
另外，上述方法优选的实施方式是，上述交联剂选自：单叠氮乙 啡啶(ethidium monoazide)、双叠氮乙啡啶(ethidium diazide)、补骨脂素 (プソラ一レン)、4，5′，8-三甲基补骨脂素、以及8-甲氧基补骨脂素。
另外，上述方法优选的实施方式是，上述靶区域是50～5000个碱 基的区域。
另外，上述方法优选的实施方式是，上述微生物是病原菌 (pathogenic bacterium)。在该实施方式中，上述靶区域优选为病原基因 (pathogenic gene)。
此外，本发明提供用于利用核酸扩增法来检测被测样品中微生物 的活菌的试剂盒，该试剂盒包括以下组分：
利用350nm～700nm波长的光照射使DNA交联的交联剂、培养基、 以及用于利用核酸扩增法来扩增检测对象的微生物DNA靶区域的引 物。
上述试剂盒优选的实施方式是，上述核酸扩增法为PCR法、LAMP 法、SDA法、LCR法或者DNA微阵列法。
另外，上述试剂盒优选的实施方式是，上述交联剂选自：单叠氮 乙啡啶、双叠氮乙啡啶、补骨脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素、以及8- 甲氧基补骨脂素。
附图说明
[图1]表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的李斯特菌 (Listeria)(活菌和损伤菌)的hylA-PCR最终扩增产物谱带(band)强度的 电泳图像。活：李斯特菌活菌；损：李斯特菌损伤菌
[图2]表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的阪崎肠杆菌 (Enterobacter sakazakii)(活菌和损伤菌)的ompA-PCR最终扩增产物谱 带强度的电泳图像。活：阪崎肠杆菌活菌；损：阪崎肠杆菌损伤菌
[图3]表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的阪崎肠杆菌 (活菌和损伤菌)的MMS-PCR最终扩增产物谱带强度的电泳图像。活： 阪崎肠杆菌活菌；损：阪崎肠杆菌损伤菌
[图4]表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的沙门氏菌 (Salmonella)(活菌和损伤菌)的invA-PCR最终扩增产物谱带强度的电 泳图像。活：沙门氏菌活菌；损：沙门氏菌损伤菌
[图5]表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的沙门氏菌(活 菌和损伤菌)的肠毒素-PCR(enterotoxin-PCR)最终扩增产物谱带强度 的电泳图像。活：沙门氏菌活菌；损：沙门氏菌损伤菌
具体实施方式
接着，对本发明优选的实施方式进行详细说明。但本发明不限于 以下的优选实施方式，可以在本发明的范围内进行自由变更。另外， 本说明书中的百分率如没有特别说明则表示质量百分率。
本发明的方法中，作为检测对象，只要最终能够扩增，则可以是 所有核酸，具体可以列举：单链DNA、双链DNA、单链RNA和双链 RNA，其中，优选将DNA作为检测对象，特别优选双链DNA。
<1>本发明的方法
本发明的方法是用于检测被测样品中微生物活菌的方法，该方法 包括以下工序。
a)向上述被测样品中添加交联剂的工序，该交联剂利用 350nm～700nm波长的光照射使DNA交联；
b)对添加了交联剂的被测样品进行350nm～700nm波长的光照射处 理的工序；
c)除去经光照射处理的被测样品中所含的交联剂的工序；
d)向除去了交联剂的被测样品中添加培养基并保温的工序；
e)向经保温的被测样品中再次添加交联剂的工序，该交联剂利用 350nm～700nm波长的光照射使DNA交联；
f)对添加了交联剂的被测样品进行350nm～700nm波长的光照射处 理的工序；
g)从上述被测样品中提取DNA，用核酸扩增法来扩增所提取的 DNA的靶区域的工序；以及
h)解析扩增产物的工序。
本说明书中的“被测样品”是指，对其中存在的微生物活菌进行检 测的对象，只要通过由核酸扩增法对染色体DNA的特定区域的扩增能 够检测微生物的存在，则对被测样品没有特殊限制，可列举：食品、 血液样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品、胸水样品、工业用水、 自来水、地下水、河水或雨水等。作为食品，优选：清凉饮料、碳酸 饮料、营养饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料等饮料(包括这些饮料的浓缩 原液及配制用粉末)；冰淇淋、冰果子露(ice sherbet)、刨冰等冰制食品； 加工乳、乳饮料、发酵乳、黄油等乳制品；经肠营养食品、流体食物、 婴幼儿奶、运动饮料；特定保健用食品、健康辅助食品等功能性食品 等。本发明中，被测样品可以是上述产品或生物样品本身，也可以是 其稀释品或浓缩品，或者是经过本发明处理方法以外的前处理的样品。 上述前处理可以列举加热处理、过滤、离心分离等。
并且，可以通过酶处理等来除去或减少被测样品中存在的微生物 以外的细胞、蛋白质胶体粒子、以及脂肪等杂质。作为上述被测样品 中存在的微生物以外的细胞，当被测样品是乳、乳制品、以乳或乳制 品为原料的食品时，可以列举牛白细胞和乳腺上皮细胞(mammary epitheliocytes)等。此外，当被测样品是血液样品、尿样品、脊髓液样 品、滑液样品或胸水样品等生物样品时，上述被测样品中存在的微生 物以外的细胞可以列举：红细胞、白细胞(粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜 碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等)以及血小板等。
作为上述酶，只要可以分解上述杂质并且不损伤检测对象微生物 的活菌，则没有特殊限制，例如可以列举：脂质分解酶和蛋白分解酶。 上述酶可以单独使用一种，也可以两种以上并用，但优选同时使用脂 质分解酶和蛋白分解酶。
作为脂质分解酶，可列举脂肪酶、磷酸酶等；作为蛋白分解酶可 列举蛋白酶K、链霉蛋白酶等。
“微生物”是本发明的方法所检测的对象，只要能利用核酸扩增法 进行检测，并且交联剂对微生物的活菌与对死菌、损伤菌的作用不同， 则没有特殊限制，优选细菌、真菌、酵母等。作为细菌，包括革兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌两者。作为革兰氏阳性菌，可列举：表皮葡萄 球菌(Staphylococcus epidermidis)等葡萄球菌属细菌；链球菌属细菌； 单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等李斯特属细菌；蜡状芽孢 杆菌(Bacillus cereus)等芽孢杆菌属细菌；分枝杆菌属细菌；肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等梭菌 属细菌等。此外，作为革兰氏阴性菌，可列举：大肠杆菌(Escherichia coli) 等大肠杆菌属细菌；阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等肠杆菌属细 菌；柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)等柠檬酸杆菌属细菌；产酸克 雷伯菌(Klebsiella oxytoca)等克雷伯菌属细菌为代表的肠内细菌群；沙 门氏菌属细菌、弧菌属细菌、假单胞菌属细菌等。
本发明中的“活菌”(live cell)是指，在通常的优选培养条件下培养 时能够增殖、且为显示该微生物所具有的代谢活性的状态(活且可培养 状态，Viable-and-Culturable state)，并且是几乎没有细胞壁损伤的微 生物。另外，这里所说的代谢活性可以列举ATP活性、酯酶活性。
“死菌”(dead cell)是指，即使在优选的培养条件下培养时也不可能 增殖、为不显示代谢活性状态(Dead)的微生物。并且是虽然维持细胞壁 的结构，但细胞壁自身已高度受损，碘化丙锭(propidium iodide)之类的 弱透过性的核染剂等可透过细胞壁的状态的微生物。
“损伤菌”(injured cell或者viable-but-non culturable cell)是指，因 人为应激(stress)或者环境应激而受到损伤，因而即使在优选的培养条 件下培养时也难以增殖、且具有下列状态的微生物，即该微生物所具 有的代谢活性比活菌低，但与死菌相比，具有显著性的活性。
特别是在食品卫生检查和临床检查中，对温和加热处理或给予抗 生素而呈现损伤菌状态的细菌的检测受人关注，本发明提供微生物检 测方法，该方法不仅能进行活菌的检测，还能够将活菌与死菌或损伤 菌区别开。
另外，活菌、损伤菌以及死菌的菌数单位，通常均以细胞数(cells)/ml 表示。活菌的细胞数可以近似为在适当的平板培养基上优选的条件下 培养时的菌落形成数(cfu/ml(菌落形成单位/ml，colony forming units/ml)。此外，损伤菌的标准样品可通过例如将活菌悬浮液进行加热 处理(例如在沸水中加热处理)来配制，但此时，损伤菌的细胞数可以近 似为加热处理前的活菌悬浮液的cfu/ml。另外，用于配制损伤菌的在 沸水中的加热时间，根据微生物的种类而不同，例如，在实施例记载 的细菌中，配制损伤菌的加热时间可以为50秒左右。此外，损伤菌的 标准样品，还可以通过抗生素处理来配制，但此时，通过用抗生素处 理活菌悬浮液后，除去抗生素，测定可见光(波长600nm)的透过度即浊 度，再将该浊度与已知活菌数浓度的活菌悬浮液的浊度相比较，从而 可以将损伤菌的细胞数近似为在适当的平板培养基上优选条件下培养 时的菌落形成数(cfu/ml)。
另外，本发明的方法是以检测活菌为目的，与活菌相区别的微生 物，可以是损伤菌或死菌。
本发明中的“活菌的检测”包括，判定被测样品中有无活菌以及确 定活菌的量。并且，活菌的量不仅限于绝对量，也可以是相对于对照 样品的相对量。
以下，对本发明方法的各工序进行说明。
(1)步骤a)
用交联剂处理被测样品，该交联剂利用350nm～700nm波长的光照 射使DNA交联。
本发明使用的交联剂是指，嵌入染色体DNA，利用350nm～700nm 波长的光照射而与染色体DNA共价键合并使DNA分子间交联的交联 剂。
上述交联剂，优选对活菌与对损伤菌或死菌以及牛白细胞等体细 胞、白细胞、血小板等作用不同的交联剂，更具体地，优选对损伤菌 或死菌的细胞壁、或者牛白细胞等体细胞、白细胞、血小板等的细胞 膜的透过性比对活菌的细胞壁的透过性高的交联剂。
作为上述交联剂，可以列举单叠氮乙啡啶、双叠氮乙啡啶、补骨 脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素(PMA)、以及8-甲氧基补骨脂素等。交联 剂可以单独使用一种，也可以两种以上并用。
用交联剂进行处理的条件可以适当设定，例如，通过向检测对象 微生物的活菌和死菌或者损伤菌的悬浮液中添加各种浓度的交联剂， 放置不同时间后，用离心分离等分离菌体，再用核酸扩增法进行分析， 从而可以确定容易地区别活菌与死菌或损伤菌的条件。此外，通过向 检测对象微生物的活菌、以及牛白细胞等体细胞或血小板等的悬浮液 中添加各种浓度的交联剂，放置所定时间后，用离心分离等分离菌体 及上述各种细胞，利用核酸扩增法进行分析，从而可以确定容易地区 别活菌与各种细胞的条件。作为这些条件，具体可列举：用单叠氮乙 啡啶处理的条件为：终浓度1～100μg/ml、4～10℃、5分钟～48小时；用 双叠氮乙啡啶处理的条件为：终浓度1～100μg/ml、4～10℃、5分钟～48 小时；用补骨脂素处理的条件为：终浓度1×10-5～10μg/ml、25～37℃、5 分钟～48小时；用4，5′，8-三甲基补骨脂素处理的条件为：终浓度 1×10-5～10μg/ml、25～37℃、5分钟～48小时；用8-甲氧基补骨脂素处理 的条件为：终浓度1×10-5～10μg/ml、25～37℃、5分钟～48小时。
(2)步骤b)
接着，对添加了交联剂的被测样品进行350nm～700nm波长的光照 射处理。
上述交联剂，比起活菌的细胞壁更易透过死菌和损伤菌的细胞壁。 因此，只要在如上所示的时间内，则可认为未实质透过活菌的细胞壁， 而透过了损伤菌或死菌的细胞壁、或透过了死体细胞(dead somatic cell) 的细胞膜。并且，存活的体细胞仅具有细胞膜，不具有细胞壁，因此 认为上述交联剂可透过。结果推测，交联剂进入体细胞的死细胞以及 死菌和损伤菌的细胞内，接着与染色体DNA随机形成共价键，或者嵌 入染色体DNA，通过进行350nm～700nm波长的光照射，使DNA分子 间交联，导致染色体DNA内产生变形，造成染色体DNA破裂(片段化、 断裂)。
350nm～700nm波长的光可以至少含有350nm～700nm波长的光， 可以是单波长光，也可以是复合光。此外，所有的成分可以在 350nm～700nm的范围内，也可以含有短于350nm波长的光、和/或 700nm以上的长波长的光，但优选强度分布中的峰在350nm～700nm的 范围内。另外，优选不含仅通过光照射而使微生物染色体DNA断裂程 度的短波长的成分。
如果损伤菌或死菌的染色体DNA与活菌相比优先被破坏，则活菌 中染色体DNA的靶区域通过核酸扩增法被扩增，而损伤菌和死菌中的 靶区域被破坏(断裂)，导致核酸扩增反应被抑制，从而与损伤菌或死菌 相比，可以选择性地检测活菌。
本发明优选的实施方式是，上述交联剂为单叠氮乙啡啶，以及包 括对添加了单叠氮乙啡啶的被测样品照射350nm～700nm波长的光线的 工序。比起微生物活菌的细胞壁，单叠氮乙啡啶(EMA)更易透过损伤 菌或死菌的细胞壁。因此认为，EMA实质上不透过活菌的细胞壁，而 透过损伤菌或死菌的细胞壁、或透过死体细胞的细胞膜。另外，血液 中的白细胞、血小板为活细胞时，EMA在灭菌水或低渗盐溶液下更易 透过上述细胞的细胞膜。EMA进入体细胞的死细胞、损伤菌和死菌的 细胞内，并随机嵌入核内DNA后，通过350nm～700nm波长的光照射， 仅嵌入的EMA转变为氮烯(nitrene)，并与核内DNA共价键合，使DNA 分子之间交联。接着，推测由于EMA与染色体DNA的各碱基以及脱 氧核糖在各处形成共价键，而在染色体DNA内产生较大变形，结果导 致染色体DNA破裂(片段化)。
即使单叠氮乙啡啶以外的交联剂，只要是比起微生物活菌的细胞 壁更易透过损伤菌或死菌的细胞壁、并且通过照射350nm～700nm波长 的光线(长波长紫外线、或可见光)使DNA交联，从而破坏染色体DNA 的交联剂，都可用于本发明。
EMA的处理条件可以适当设定，例如，通过向检测对象微生物的 活菌、以及损伤菌或死菌的悬浮液中加入各种浓度的EMA，放置不同 时间后，照射可见光，根据需要用离心分离等分离菌体，再用核酸扩 增法进行分析，可以确定容易地区别活菌与死菌及损伤菌的条件。并 且，通过改变光照射的条件、照射时间进行上述实验，可以确定优选 的条件。作为光照射的条件，具体可列举：从距离被测样品10～50cm 处照射100～750W的上述波长的光5分钟～2小时的条件。光照射优选 在低温下进行，例如将样品在冰冷却下进行。
(3)步骤c)
从进行了光照射处理的被测样品中除去被测样品中所含的未反应 的交联剂。
该工序优选在步骤b)之后迅速进行。作为除去交联剂的方法，可 列举离心分离被测样品，分离含有微生物的沉淀和含有交联剂的上清 液，再除去上清液的方法。此时，除去了交联剂之后，可以适当增加 用洗涤剂洗涤微生物的工序。
(4)步骤d)
接着，向除去了交联剂的被测样品中添加培养基并保温(incubate)。
培养基优选适合培养被测样品中所含的微生物的培养基，特别优 选使用液体培养基。具体可列举：肉汁培养基、蛋白胨培养基、脑心 浸液(BHI)液体培养基(brain heart infusion broth)等。保温优选适合对 象微生物增殖的温度，例如该微生物的最佳培养温度或者以此为标准 的温度。对象微生物的最佳培养温度，可以通过例如在各种温度下培 养对象微生物，选择微生物最易增殖的温度来确定。例如，在上述示 例的细菌中，通常为20℃～43℃、优选为25℃～37℃、更优选为 30℃～37℃。此外，只要被测样品中的微生物增殖则对保温时间没有特 殊限制，具体可列举：0.5～48小时、优选为1～24小时、更优选为2～3 小时。通过将含有微生物的被测样品在培养基中保温，那么不含交联 剂且染色体DNA未被破坏的活菌在培养基中被保温培养而增殖，从而 可以期待在鉴别被测样品中有无活菌以及确定活菌量方面，提高检测 灵敏度。
(5)步骤e)、f)
步骤e)、f)分别与上述步骤a)、b)相同。
通过进行上述步骤d)，可以期待被测样品中活菌的增殖，因此， 通过在步骤d)之后进一步实施步骤e)、f)，可以增加活菌与活菌以外的 菌之间的检测灵敏度的差距。由此，在鉴别被测样品中有无活菌、损 伤菌或死菌以及确定活菌量方面，可以大幅提高检测灵敏度。步骤e) 中添加的交联剂可以与步骤a)中添加的交联剂相同，也可以不同。
本发明特别优选的实施方式是，对被测样品连续进行以下处理： 添加交联剂和进行光照射处理、通过离心分离等除去交联剂、添加培 养基及保温、再次添加交联剂和进行光照射处理。在进行上述一系列 处理后，通过再进行多次除去交联剂、添加培养基及保温、再次添加 交联剂和进行光照射处理，可以进一步提高检测灵敏度。具体而言， 最好在步骤a)及b)之后，反复进行两次或者两次以上步骤c)、d)、e) 和f)。
在后述的实施例和比较例中包括：只进行步骤a)、b)，不进行步 骤e)、f)的“单次处理”；以及除了步骤a)、b)外，还进行步骤e)、f)的“多 步处理”。
(6)步骤g)
从经步骤a～f)处理的被测样品中提取DNA，利用核酸扩增法扩增 所提取的DNA的靶区域。作为核酸扩增法，分别可以列举：PCR法 (White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))、LAMP法 (Loop-Mediated Isothermal Amplification：新型基因扩增法(LAMP法) 的原理和应用，纳富继宣、长谷哲，BIO INDUSTRY，Vol.18，No.2，15-23， 2001)、SDA法(链置换扩增，Strand Displacement Amplification：Edward L.Chan，Ken Brandt，Karen Olienus，Nick Antonishyn，Greg B. Horsman.，Performance characteristics of the Becton Dickinson ProbeTec System for direct detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in male and female urine specimens in comparison with the Roche Cobas system.Arch.Pathol.Lab.Med.， 124：1649-1652，2000)、LCR法(连接酶链反应，Ligase Chain Reaction：Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.88，p.189-193， 1991)、DNA微序列法(Validation of Virulence and Epidemiology DNA Microarray for Identification and Characterization of Staphylococcus aureus Isolates：Richard P.Spence，et al.，J.Clin.Microbiol.，Vol.46， No.5，p.1620-1627，2008)等。另外，本发明中特别优选使用PCR法，但 并非仅限于此。
从被测样品中提取DNA，只要提取的DNA能作为核酸扩增反应 中的模板而发挥作用，则没有特殊限制，可以按照通常使用的微生物 DNA提取方法进行。
DNA提取法例如记载于Maniatis T.，Fritsch E.F.，Sambrook，J.： Molecular Cloning：A Laboratory Manual.3rd edn.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001。
本发明中的“靶区域”是指，在染色体DNA中，只要是可通过使用 了本发明所用的引物的核酸扩增法来进行扩增而得到的区域，且可以 检测检测对象微生物，则没有特殊限制，可以根据不同目的适当设定。 例如，当被测样品中含有与检测对象的微生物不同种类的细胞时，靶 区域优选具有对检测对象微生物特异(specific to the microorganism as an object of the detection)的序列。并且，根据不同目的可以具有对多 种微生物通用的序列。此外，靶区域可以是一个，也可以是多个。如 果使用与检测对象微生物的特异的靶区域对应的引物组(primer set)、 以及与广泛的微生物的染色体DNA对应的引物组，则可以同时测定检 测对象微生物的活菌量、以及多种微生物的活菌量。作为靶区域的长 度，例如，通常为50～5000个碱基、优选为50～2000个碱基、特别优选 为50～500个碱基。
核酸扩增中使用的引物，基于各种核酸扩增法的原理可以适当设 定，只要可以特异地扩增上述靶区域即可，没有特殊限制。
并且，当检测对象微生物为病原性细菌时，作为靶区域可以列举 病原基因。作为病原基因，可列举：李斯特菌属的李斯特菌溶胞素 O(hlyA)基因；沙门氏菌属细菌的肠毒素(enterotoxin)基因、侵入 (invasion)(invA)基因；病原性大肠杆菌O-157的vero细胞毒素 (verotoxin)基因；肠杆菌属(Enterobacter)细菌的外膜蛋白A (outer-membrane-protein A)(ompA)基因(阪崎肠杆菌)以及大分子合成 (macromolecular synthesis)(MMS)操纵子(阪崎肠杆菌)；金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)肠毒素基因；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 的呕吐毒素(cereulide)基因、肠毒素基因；肉毒杆菌(Clostridium botulinum)的各种毒素基因等。此外，作为与病原基因对应的引物，例 如可以列举：与李斯特菌的hlyA基因对应的以序列号1和2表示的引 物组；与阪崎肠杆菌的ompA基因对应的以序列号3和4表示的引物 组；以及与阪崎肠杆菌的MMS操纵子对应的以序列号5和6表示的引 物组。
如果使用多种微生物通用的引物，则可以检测被测样品中多种微 生物的活菌。并且，如果使用对特定细菌特异的引物，则可以检测被 测样品中特定菌种的活菌。
核酸扩增反应的条件，只要根据各核酸扩增法(PCR法、LAMP法、 SDA法、LCR法等)的原理能引起特异的扩增则没有特殊限制，可以适 当设定。
(7)步骤h)
接着，对利用核酸扩增法扩增的扩增产物进行解析。
只要是能够检测或定量核酸扩增产物的解析法，则没有特殊限制， 例如电泳法等。另外，核酸扩增法使用PCR法时，可以使用实时PCR 法(Nogva et al./Application of 5′-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures，water，skim milk， and unpasteurized whole milk.Appl.Environ.Microbiol.，vol.66，2000， pp.4266-4271，Nogva et al./Application of the 5′-nuclease PCR assay in evaluation and development of methods for quantitative detection of campylobacter jejuni.Appl.Environ.Microbiol.，vol.66，2000， pp.4029-4036)。
根据电泳法，可以评价核酸扩增产物的量及其大小。并且根据实 时PCR法，可以对PCR扩增产物进行迅速定量。
采用实时PCR法时，通常在扩增循环数为1～10期间，荧光强度 的变化在噪音水平并且等于0，因此，将其看作是扩增产物为0的空白 样品，算出它们的标准偏差SD，将该SD值乘以10的值作为阈值，将 初次超出该阈值的PCR循环数称作循环阈值(Ct值)。因此，PCR反应 溶液中初始的DNA模板量越多，Ct值越小；模板DNA量越少，Ct 值越大。并且，即使模板DNA量相同，该模板内PCR靶区域产生断 裂的比例越多，则同区域的PCR反应的Ct值越大。
此外，可以通过解析扩增产物的熔解温度(TM)图(pattern)来判断 扩增产物的有无。
上述各方法可以在本发明方法中各条件最佳化时使用。
根据本发明的方法检测活菌时，如果核酸扩增产物的解析，使用 表示微生物量与扩增产物之间关系的标准曲线，则可以提高微生物活 菌有无的鉴别或定量的精密度，该标准曲线是使用已鉴定的微生物的 标准样品制作的。可以使用预先制作的标准曲线，但优选使用标准样 品与被测样品同时进行本发明的各个步骤而制作的标准曲线。并且， 如果预先考察了微生物量与DNA量之间的关系，则可以使用从该微生 物中分离的DNA作为标准样品。
另外，当本发明的活菌检测包括活菌量的确定时，由于步骤d)中 活菌增殖，因此关于确定被测样品中活菌的量，有必要考虑其增殖的 程度。因此，例如，最好使用如上所述微生物的标准样品预先制作表 示微生物量与扩增产物之间关系的标准曲线。
<2>本发明的试剂盒
本发明的试剂盒是用于利用核酸扩增法检测被测样品中微生物的 活菌的试剂盒，包括交联剂、培养基、以及引物，该引物用于利用核 酸扩增法扩增检测对象微生物的DNA靶区域。
上述核酸扩增反应，优选PCR法、LAMP法、SDA法、或者LCR 法。另外，上述试剂盒中，交联剂、培养基与本发明方法中说明的相 同。
本发明试剂盒优选的实施方式是，交联剂优选选自单叠氮乙啡啶、 双叠氮乙啡啶、补骨脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素、以及8-甲氧基补骨 脂素，特别优选使用单叠氮乙啡啶。
本发明的试剂盒可以进一步包含稀释液、交联剂反应用的反应液、 记载有本发明方法的说明书等。
实施例
以下列举实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并非仅限 于以下实施例。
[实施例1]
1.样品的配制-单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) (活菌和损伤菌)悬浮液的配制
30℃下使用脑心浸液(BHI)液体培养基培养革兰氏阳性菌即单核 细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes JCM 2873；以下简称“李斯 特菌”)，将40ml对数生长期的培养液在4℃下进行8000×g、15分钟的 冷冻离心分离，除去上清液。向菌体中加入40ml生理盐水并充分搅拌， 再进行同样的冷冻离心分离，除去上清液后，向菌体中加入10ml生理 盐水，制成活菌悬浮液。利用标准琼脂平板培养基测定该活菌悬浮液 的活菌数，结果为1.3×108cfu/ml。
并且，将1ml上述活菌悬浮液放入1.5ml微型管中，在沸水中浸渍 50秒后，用冰水快速冷却，配制损伤菌悬浮液。另外，虽然该悬浮液 的细胞中包含一部分少量的活菌和死菌，但主要包含损伤菌，因此仅 记载为“损伤菌”。另外，本发明的方法原本是检测微生物活菌的方法， 与活菌相区别的微生物细胞，可以是损伤菌或者死菌。
2.试验方法
2-1)多步处理(本发明的方法)
向上述配制的李斯特菌的活菌悬浮液及损伤菌悬浮液中，以0或 者100μg/ml的终浓度添加单叠氮乙啡啶(EMA)，避光下4℃放置5分 钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置的500W的 可见光(FLOOD PFR：100V、500W，岩崎电气公司制，波长：500～700nm) 照射5分钟。然后，4℃下进行15000×g、10分钟的冷冻离心分离，除 去上清液，加入同体积的生理盐水搅拌后，4℃下进行15000×g、10分 钟的冷冻离心分离，除去上清液后，加入同体积的脑心浸液(BHI)液体 培养基，30℃保温(incubation)两小时。
第一次EMA处理时，不向EMA浓度为0的活菌及损伤菌悬浮液 中再次加入EMA，而向EMA浓度为100μg/ml的活菌及损伤菌悬浮液 中以终浓度10μg/ml或者25μg/ml再次添加EMA，避光下4℃放置5 分钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置的500W 的可见光照射5分钟。
2-2)单次处理(比较例1)
向“1.”中配制的李斯特菌的活菌悬浮液及损伤菌悬浮液中，以0、 10或者25μg/ml的终浓度添加单叠氮乙啡啶(EMA)，避光下4℃放置 5分钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置的500W 的可见光(FLOOD PFR：100V、500W，岩崎电气公司制，波长： 500～700nm)照射5分钟。
2-3)用于PCR试验的各细菌悬浮液的配制
将经上述2-1)及2-2)处理后的李斯特活菌及损伤菌的各悬浮液放 入微型管(microtube)，将该微型管在4℃下进行15000×g、10分钟的冷 冻离心分离。除去上清液液后，加入1ml生理盐水并充分搅拌，再进 行同样的冷冻离心分离(洗涤处理)。再进行一次同样的洗涤处理后，向 沉淀(pellet)中加入10μl的TE缓冲液(10mM Tris盐酸缓冲液，1mM EDTA·2Na)并充分搅拌。
3.以李斯特菌的病原基因(短DNA，short DNA)为靶标的PCR
3-1)病原基因李斯特菌、李斯特菌溶胞素O(hlyA)基因扩增
使用能够连续且自动地进行染色体DNA从细菌中的洗脱(elution) 以及PCR反应的直接缓冲混合液(Direct Buffer Mix)(G&g SCIENCE CO.，LTD.，神奈川县横浜市)，来配制PCR主要混合液(PCR Master Mix)(总量：50.5μl)。该缓冲混合液中含有：阻止来自细菌的蛋白质吸 附在来自PCR反应所使用的细菌的模板DNA上的成分(表面活性剂)、 以及阻止来自细菌的多糖吸附在DNA多聚酶上的成分(表面活性剂)， 还含有除此之外的实时PCR反应所必须的组分。PCR主要混合液的详 细内容如下所述。
·G&g SCIENCE CO.，LTD.制的直接缓冲混合液：42μl
·(5U/μl)Ex-Taq(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：0.5μl
·(10pmol/μl)序列号1(hlyA-F)DNA：4μl
·(10pmol/μl)序列号2(hlyA-R)DNA：4μl
另外，上述试剂全部加在一起总量为50.5μl，在G&g SCIENCE CO.，LTD.制造的直接缓冲混合液中，预先将总量为50.5μl的PCR主要 混合液中的必要成分配制成以下终浓度。
·Ex-Taq缓冲液(Ex-Taq Buffer)(宝酒造公司制、目录编号： RR001B)：1×
·dNTP混合物(dNTP mixture)(宝酒造公司制、目录编 号：RR001B)：各0.2mM
·SYBA Green(BMA公司制、目录编号：50513)：0.4× 3-2)hlyA基因扩增用PCR热循环谱(Thermal cycle profile)
表1 hlyA基因扩增用PCR热循环谱
3-3)PCR反应
向上述3-1)中配制的PCR主要混合液(50.5μl)中添加上述2-3)中配 制的各试验悬浮液5μl。使用5μl TE缓冲液作为阴性对照。
按照3-2)所示的PCR热循环谱，使用实时PCR装置i Cycler(Bio-Rad公司制，机种编号：iQ)进行PCR反应。
4.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
使用3％琼脂糖凝胶对上述3-3)的PCR扩增产物进行电泳。电泳 结束后，将琼脂糖凝胶浸渍在1μg/ml溴乙啡啶水溶液中20分钟，接 着用离子交换水洗涤两次，通过UV透照仪(波长254nm)观察hlyA基 因扩增产物的扩增程度。
5.试验结果
对李斯特活菌及损伤菌进行多步处理后，进行靶向hlyA基因的 PCR，并进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图1(多步处理泳道)所示，将 该PCR最终扩增产物的谱带强度数值化的结果如表2所示。并且，对 李斯特活菌及损伤菌进行单次处理后，进行靶向hlyA基因的PCR，并 进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图1(单次处理泳道)所示，将该PCR 最终扩增产物的谱带强度数值化的结果如表3所示。表中谱带强度是 使用Bio-Rad公司制GS-700图像光密度仪(光密度仪：测定波长600nm) 扫描电泳方向的谱带时测定谱带色彩强度所得的值。
表2
表3
当多步处理中未添加EMA时，被推测为hlyA基因扩增产物的谱 带在李斯特活菌和损伤菌中均被检测到，从而不能仅对活菌进行特异 性检测。但是在多步处理中添加了EMA时(EMA 100μg/ml-保温-EMA 25或10μg/ml)，活菌的谱带被清晰地检测到，而损伤菌的谱带几乎 或者完全检测不到。因此，通过多步处理利用PCR可以仅选择性地检 测活菌。同样如表2所示，从谱带强度数值化的数据来看，即使在将 113bp这样的短基因作为靶标的PCR中，通过多步处理也能够清晰地 鉴别活菌和损伤菌。
另一方面，在单次处理中未添加EMA时，通过PCR被推测为hlyA 基因扩增产物的谱带在李斯特活菌和损伤菌中均被检测到，而不能仅 选择性地检测活菌。此外，单次处理中添加了EMA 10μg/ml时，被推 测为hlyA基因扩增产物的谱带在活菌和损伤菌中均被检测到，从而不 能仅对活菌进行特异性检测。单次处理中添加了EMA 25μg/ml时，被 推测为hlyA基因扩增产物的谱带在活菌和损伤菌中都几乎消失并减少 至相似的状态，因而不可能仅对活菌进行特异性检测。在将113bp这 样的短基因(hlyA)作为靶标的PCR中，通过单次处理不可能清晰地鉴 别活菌与损伤菌。
6.讨论
对以特定病原菌为核心的活菌与损伤菌(也包含死菌)进行迅速鉴 别时，为了仅特异性地检测病原菌，以及为了通过定量的实时PCR来 进一步定量试验液中的细菌数，倾向于将80～200碱基的短基因区域作 为靶标。比较例1所示的单次处理的情况中，如果使用高于10μg/ml 的高浓度的EMA进行处理，则EMA不仅透过损伤菌的细胞壁也透过 活菌的细胞壁，活菌及损伤菌的染色体DNA双链在各处不依赖细菌内 酶而直接断裂，因此认为不能仅特异性检测活菌。并且，单次处理中 使EMA在10μg/ml及以下的浓度作用时，EMA难以透过损伤菌的细 胞壁，染色体DNA受到高频率断裂的可能性较低。因此，当PCR靶 区域较短时，并非所有的损伤菌细胞的染色体DNA的靶区域断裂，导 致PCR没有被完全抑制。
另一方面，多步处理中，使EMA作用一次后，即使EMA透过一 些活菌使活菌数减少，但通过在适合培养的培养基中保温，可以使活 菌数恢复到原来的数值、或者使活菌的扩散泵(diffusion pump)恢复、 或者能够将未反应的EMA排出菌体外，因此，第一次作用的EMA的 浓度可以为100μg/ml等高浓度，损伤菌的染色体DNA各处受到高浓 度EMA的剧烈作用而断裂，即使之后在培养基中进行保温也与活菌不 同，不可能增加细胞数。在这种情况下，只要在5分钟等短时间内用 几乎不透过活菌的细胞壁的浓度，例如10μg/ml使EMA再次作用，则 EMA仅透过损伤菌的细胞壁，促使染色体DNA进一步断裂，从而不 会仅检测损伤菌的PCR最终扩增产物的谱带。
[实施例2]
1.样品的配制——阪崎肠杆菌(活菌和损伤菌)悬浮液的配制
37℃下使用脑心浸液(BHI)液体培养基培养革兰氏阴性菌即阪崎 肠杆菌(Enterobacter sakazakii ATCC 6538P；以下简称“阪崎菌”)，将 5ml对数生长期的培养液在4℃下进行8000×g、15分钟的冷冻离心分 离，除去上清液。向菌体中加入5ml生理盐水并充分搅拌，再进行同 样的冷冻离心分离，除去上清液后，向菌体中加入5ml生理盐水再稀 释10倍，制成活菌悬浮液。利用标准琼脂平板培养基测定该活菌悬浮 液的活菌数，结果为8.38±0.25log10cfu/ml。
并且，将1ml上述活菌悬浮液放入1.5ml微型管中，在沸水中浸渍 2分钟后，用冰水快速冷却，配制损伤菌悬浮液。另外，虽然该悬浮液 的细胞中包含一部分少量的活菌和死菌，但主要包含损伤菌，因此仅 记载为“损伤菌”。另外，本发明的方法原本是检查活菌的方法，与活 菌相区别的微生物，可以是损伤菌或者死菌。
2.试验方法
2-1)多步处理(本发明的方法)
向上述配制的阪崎菌的活菌悬浮液及损伤菌悬浮液中，以0、10、 25或者100μg/ml的终浓度添加单叠氮乙啡啶(EMA)，避光下4℃放置 10分钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置的500W 的可见光(FLOOD PFR：100V、500W，岩崎电气公司制，波长： 500～700nm)照射5分钟。然后，4℃下进行15000×g、10分钟的冷冻离 心分离，除去上清液，加入同体积的生理盐水搅拌后，4℃下进行 15000×g、10分钟的冷冻离心分离，除去上清液后，加入同体积的脑心 浸液(BHI)液体培养基，37℃保温两小时。
第一次处理EMA时，不向EMA浓度为0的活菌及损伤菌悬浮液 中再次加入EMA，而向EMA浓度为10、25、或100μg/ml的活菌及损 伤菌悬浮液中以终浓度为10μg/ml再次添加EMA，避光下4℃放置10 分钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置的500W 的可见光照射5分钟。
2-2)单次处理(比较例2)
向“1.”中配制的阪崎菌的活菌悬浮液及损伤菌悬浮液中，以0、 10、25或者100μg/ml的终浓度添加单叠氮乙啡啶(EMA)，避光下4℃ 放置10分钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置 的500W的可见光(FLOOD PFR：100V、500W，岩崎电气公司制，波 长：500～700nm)照射5分钟。
2-3)用于PCR试验的各细菌悬浮液的配制
将经上述2-1)及2-2)处理后的阪崎菌的活菌及损伤菌的各悬浮液 放入微型管，将该微型管在4℃下进行15000×g、10分钟的冷冻离心分 离。除去上清液液后，加入1ml生理盐水并充分搅拌，再进行同样的 冷冻离心分离(洗涤处理)。再进行一次同样的洗涤处理后，向沉淀中加 入与初始体积同体积的灭菌水并充分搅拌。
3.以阪崎菌的外膜蛋白A(ompA)基因以及大分子合成(MMS)操纵 子(短DNA)为靶标的PCR
3-1)ompA基因和MMS基因扩增
使用能够连续且自动地进行染色体DNA从细菌中的洗脱和PCR 反应的G&g SCIENCE CO.，LTD.(神奈川县横浜市)制直接缓冲混合液， 来配制PCR主要混合液(PCR Master Mix)(总量：25.25μl)。该缓冲混 合液中含有：阻止来自细菌的蛋白质吸附到PCR反应所使用的来自细 菌的模板DNA上的成分(表面活性剂)、以及阻止来自细菌的多糖吸附 到DNA多聚酶上的成分(表面活性剂)，还含有除此之外的实时PCR反 应所必须的组分。PCR主要混合液的详细内容如下所述。
ompA基因检测用PCR主要混合液的各成分如下所述。
·G&g SCIENCE CO.，LTD.制的直接缓冲混合液：21μl
·(5U/μl)Ex-Taq(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：0.25μl
·(10pmol/μl)序列号3(ompA-F)DNA：2μl
·(10pmol/μl)序列号4(ompA-R)DNA：2μl
MMS基因检测用PCR主要混合液的各成分如下所述。
·G&g SCIENCE CO.，LTD.制的直接缓冲混合液：21μl
·(5U/μl)Ex-Taq(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：0.25μl
·(10pmol/μl)序列号5(MMS-F)DNA：2μl
·(10pmol/μl)序列号6(MMS-R)DNA：2μl
另外，上述试剂全部加在一起总量为25.25μl，在G&g SCIENCE CO.，LTD.制的直接缓冲混合液中，预先将总量为25.25μl的PCR主要 混合液中的必要成分配制成以下终浓度。
·Ex-Taq Buffer(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：1×
·dNTP mixture(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：各0.2mM
·SYBA Green(BMA公司制、目录编号：50513)：0.4× 3-2)ompA基因及MMS基因扩增用PCR热循环谱
表4 ompA基因及MMS基因扩增用PCR热循环谱
3-3)PCR反应
向上述3-1)中配制的PCR主要混合液(25.25μl)中添加上述2-3)中 配制的各试验悬浮液2μl。使用2.5μl灭菌水作为阴性对照。
按照3-2)所示的PCR热循环谱，使用实时PCR装置i Cycler (Bio-Rad公司制，机种编号：iQ)进行PCR反应。
4.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
使用2％琼脂糖凝胶对上述3-3)的PCR扩增产物进行电泳。电泳 结束后，将琼脂糖凝胶浸渍在1μg/ml溴乙啡啶水溶液中20分钟，接 着用离子交换水洗涤两次，通过UV透照仪(波长254nm)观察hlyA基 因扩增产物的扩增程度。
5.试验结果
对阪崎菌的活菌及损伤菌进行多步处理后，进行以ompA基因为 靶标的PCR并进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图2(多步处理泳道)所 示，将该PCR最终扩增产物的谱带强度数值化的结果如表5所示。并 且，对阪崎菌的活菌及损伤菌进行单次处理后，进行以ompA基因为 靶标的PCR并进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图2(单次处理泳道)所 示，将该PCR最终扩增产物的谱带强度数值化的结果如表6所示。表 中谱带强度是使用Bio-Rad公司制GS-700图像光密度仪(光密度计： 测定波长600nm)扫描电泳方向的谱带时测定谱带色彩强度所得的值。 此外，多步处理及单次处理的各实时PCR曲线的初始上升(initial rising) 循环数(Ct值)如表7所示。
同样，对于MMS基因，对多步处理后PCR最终扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳的结果如图3(多步处理泳道)所示，将该PCR谱带强度数 值化的结果如表8所示；单次处理的电泳结果如图3(单次处理泳道)所 示，将该PCR谱带强度数值化的结果如表9所示。此外，多步处理及 单次处理的各实时PCR曲线的初始上升循环数(Ct值)如表10所示。
表5
表6
表7
a)Ct值(平均值±SD(mean±SD)，N＝2)
b)(i/2)表示进行两次PCR显示阳性反应的次数。
c)ND表示PCR最终扩增产物为阴性。
d)36.3、ND表示第一次的Ct值为36.3，第二次的Ct值为ND。
e)EMA i/jμg/ml：表示进行两步EMA处理，第一次EMA处理的浓度为iμg/ml，第二次 EMA处理的浓度为jμg/ml。
表8
表9
表10
a)Ct值(平均值±SD，N＝2)
b)(i/2)表示进行两次PCR显示阳性反应的次数。
c)EMA i/jμg/ml：表示进行两步EMA处理，第一次EMA处理的浓度为iμg/ml，第二次 EMA处理的浓度为jμg/ml。
d)ND表示PCR最终扩增产物为阴性。
e)27.3、ND表示第一次的Ct值为27.3，第二次的Ct值为ND。
当多步处理中未添加EMA时，被推测为ompA基因及MMS基因 扩增产物的谱带在阪崎菌的活菌和损伤菌中均被检测到，从而不能仅 对活菌进行特异性检测。另一方面，在多步处理中添加了EMA时(EMA 10μg/ml-保温-EMA 10μg/ml)，活菌的谱带被清晰地检测到，而损伤菌 的谱带完全检测不到(损伤菌的情况中，存在短于靶标基因的短谱带， 这是引物二聚体)。因此，通过多步处理利用PCR可以仅选择性地检测 活菌。同样如表5及表8所示，从谱带强度数值化的数据来看，即使 在以较短基因和极短基因(469bp及78bp)为靶标的PCR中，通过多步 处理也能够清晰地鉴别活菌和损伤菌。
另外，如果还考虑表7的各Ct值，即使单次处理EMA为25μg/ml， 也能鉴别活菌和损伤菌，但活菌的Ct值为20.9±0.6，与多步处理(EMA 10/10μg/ml)的活菌的Ct值为15.9±0.4相比，增加了5.0左右，也就 是说，即使单次处理时能够鉴别活菌与死菌，由于活菌的检测限比多 步处理低了约2log10细胞/ml，因此不能检测低浓度的阪崎菌。
6.讨论
以MMS基因(78bp)这样的极短基因为靶标的PCR的情况下，在 比较例2所示的单次处理中，使用10μg/ml的EMA进行处理时，EMA 仅选择性透过损伤菌，损伤菌的染色体DNA的双链各处不依赖细菌内 酶而直接被EMA切断。但是，如果损伤菌数为108cfu/ml水平的高浓 度，则并不是所有损伤菌的靶标MMS基因区域被切断，因此即使EMA 浓度高，单次处理中损伤菌的PCR最终扩增产物也不会为阴性。并且， 但单次处理中使EMA在10μg/ml及其以下的浓度作用时，EMA难以 透过损伤菌的细胞壁，染色体DNA受到高频率断裂的可能性较低。因 此，当PCR靶区域较短时，并非所有的损伤菌细胞的染色体DNA的 靶区域断裂，导致PCR没有被完全抑制。
另一方面，在多步处理中，使EMA作用一次后，即使EMA透过 一些活菌使活菌数减少，但通过在适合培养的培养基中保温，可以使 活菌数恢复到原来的数值、或者使活菌的扩散泵恢复、或者能够将未 反应的EMA排出菌体外。另一方面，损伤菌的染色体DNA各处受到 EMA的剧烈作用而断裂，但PCR扩增对象基因较短时，并非所有的 染色体DNA的原区域断裂，并且即使之后在培养基中进行保温也与活 菌不同，不可能增加细胞数。在这种情况下，如果例如使10μg/ml EMA 再次作用，则EMA仅透过损伤菌的细胞壁，促使染色体DNA进一步 断裂，从而不能仅检测损伤菌的PCR最终扩增产物的谱带。
[实施例3]
1.样品的配制——肠炎沙门氏菌(活菌和损伤菌)悬浮液的配制
37℃下使用脑心浸液(BHI)液体培养基培养革兰氏阴性菌即肠炎 沙门氏菌(Salmonella enteritidis IIP 604；以下简称“沙门氏菌”)，将5ml 对数生长期的培养液在4℃下进行8000×g、15分钟的冷冻离心分离， 除去上清液。向菌体中加入5ml生理盐水并充分搅拌，再进行同样的 冷冻离心分离，除去上清液后，向菌体中加入5ml生理盐水再稀释10 倍制成活菌悬浮液。利用标准琼脂平板培养基测定该活菌悬浮液的活 菌数，结果为8.06±0.02log10cfu/ml。
并且，将1ml上述活菌悬浮液放入1.5ml微型管中，在沸水中浸渍 2分钟后，用冰水快速冷却，配制损伤菌悬浮液。另外，虽然该悬浮液 的细胞中包含一部分少量的活菌和死菌，但主要包含损伤菌，因此仅 记载为“损伤菌”。另外，本发明的方法原本是检查活菌的方法，与活 菌相区别的微生物，可以是损伤菌或者死菌。
2.试验方法
2-1)多步处理(本发明的方法)
向上述配制的沙门氏菌的活菌悬浮液及损伤菌悬浮液中，以0、10、 25或者100μg/ml的终浓度添加单叠氮乙啡啶(EMA)，避光下4℃放置 10分钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置的500W 的可见光(FLOOD PFR：100V、500W，岩崎电气公司制，波长： 500～700nm)照射5分钟。然后，4℃下进行15000×g、10分钟的冷冻离 心分离，除去上清液，加入同体积的生理盐水搅拌后，4℃下进行 15000×g、10分钟的冷冻离心分离，除去上清液后，加入同体积的脑心 浸液(BHI)液体培养基，37℃保温两小时。
第一次处理EMA时，不向EMA浓度为0的活菌及损伤菌悬浮液 中再次加入EMA，而向EMA浓度为10、25、或100μg/ml的活菌及损 伤菌悬浮液中以终浓度10μg/ml再次添加EMA，避光下4℃放置10分 钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置的500W的 可见光照射5分钟。
2-2)单次处理(比较例3)
向“1.”中配制的沙门氏菌的活菌悬浮液及损伤菌悬浮液中，以0、 10、25或者100μg/ml的终浓度添加单叠氮乙啡啶(EMA)，避光下4℃ 放置10分钟后，将各悬浮液放置在冰上，用距离悬浮液20cm处设置 的500W的可见光(FLOOD PFR：100V、500W，岩崎电气公司制，波 长：500～700nm)照射5分钟。
2-3)用于PCR试验的各细菌悬浮液的配制
将经上述2-1)及2-2)处理后的沙门氏菌的活菌及损伤菌的各悬浮 液放入微型管，将该微型管在4℃下进行15000×g、10分钟的冷冻离心 分离。除去上清液液后，加入1ml生理盐水并充分搅拌，再进行同样 的冷冻离心分离(洗涤处理)。再进行一次同样的洗涤处理后，向沉淀中 加入与初始体积同体积的灭菌水并充分搅拌。
3.以沙门氏菌的侵入基因(invasion gene)(invA)基因以及肠毒素基 因(均为短DNA)为靶标的PCR
3-1)invA基因及肠毒素基因扩增
使用能够连续且自动地进行染色体DNA从细菌中的洗脱和PCR 反应的G&g SCIENCE CO.，LTD.(神奈川县横浜市)制的直接缓冲混合 液，来配制PCR主要混合液(PCR Master Mix)(总量：25.25μl)。该缓 冲混合液中含有：阻止来自细菌的蛋白质吸附在PCR反应所使用的来 自细菌的模板DNA上的成分(表面活性剂)、以及阻止来自细菌的多糖 吸附到DNA多聚酶上的成分(表面活性剂)，还含有除此之外的实时 PCR反应所必须的组分。PCR主要混合液的详细内容如下所述。
invA基因检测用PCR主要混合液的各成分如下所述。
·G&g SCIENCE CO.，LTD.制的直接缓冲混合液：21μl
·(5U/μl)Ex-Taq(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：0.25μl
·(10pmol/μl)invA-F DNA：2μl
·(10pmol/μl)invA-R DNA：2μl
invA-F：沙门氏菌invA基因检测用引物组SIN-1(产品代码：S018； TakaraBio)
invA-R：沙门氏菌invA基因检测用引物组SIN-2(产品代码：S018； TakaraBio)
MMS基因检测用PCR主要混合液的各成分如下所述。
·G&g SCIENCE CO.，LTD.制直接缓冲混合液：21μl
·(5U/μl)Ex-Taq(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：0.25μl
·(10pmol/μl)肠毒素-F DNA：2μl
·(10pmol/μl)肠毒素-R DNA：2μl
肠毒素-F：沙门氏菌肠毒素基因检测用引物组STN-1(产品代 码：S019；TakaraBio)
肠毒素-R：沙门氏菌肠毒素基因检测用引物组STN-2(产品代 码：S019；TakaraBio)
另外，上述试剂全部加在一起总量为25.25μl，在G&g SCIENCE CO.，LTD.制的直接缓冲混合液中，预先将总量为25.25μl的PCR主要 混合液中的必要成分配制成以下终浓度。
·Ex-Taq Buffer(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：1×
·dNTP mixture(宝酒造公司制、目录编号：RR001B)：各0.2mM
·SYBA Green(BMA公司制、目录编号：50513)：0.4× 3-2)invA基因及肠毒素基因扩增用PCR热循环谱
表11 invA基因及肠毒素基因扩增用PCR热循环谱
3-3)PCR反应
向上述3-1)中配制的PCR主要混合液(25.25μl)中添加上述2-3)中 配制的各试验悬浮液2μl。使用2.5μl灭菌水作为阴性对照。
按照3-2)所示的PCR热循环谱，使用实时PCR装置i Cycler (Bio-Rad公司制，机种编号：iQ)进行PCR反应。
4.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
使用2％琼脂糖凝胶对上述3-3)的PCR扩增产物进行电泳。电泳 结束后，将琼脂糖凝胶浸渍在1μg/ml溴乙啡啶水溶液中20分钟，接 着用离子交换水洗涤两次后，通过UV透照仪(波长254nm)观察hlyA 基因扩增产物的扩增程度。
5.试验结果
对沙门氏菌的活菌及损伤菌进行多步处理后，进行以invA基因为 靶标的PCR，并进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图4(多步处理泳道) 所示，将该PCR最终扩增产物的谱带强度数值化的结果如表12所示。 并且，对沙门氏菌的活菌及损伤菌进行单次处理后，进行以invA基因 为靶标的PCR，并进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图4(单次处理泳道) 所示，将该PCR最终扩增产物的谱带强度数值化的结果如表13所示。 表中谱带强度是使用Bio-Rad公司制GS-700图像光密度仪(光密度仪： 测定波长600nm)扫描电泳方向的谱带时测定谱带色彩强度所得的值。 此外，多步处理及单次处理的各实时PCR曲线的初始上升循环数(Ct 值)如表14所示。
同样，对于肠毒素基因，对多步处理后PCR最终扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳的结果如图5(多步处理泳道)所示，将该PCR谱带强度数 值化的结果如表15所示；单次处理的电泳结果如图5(单次处理泳道) 所示，将该PCR谱带数值化的结果如表16所示。此外，多步处理及 单次处理的各实时PCR曲线的初始上升循环数(Ct值)如表17所示。
表12
表13
表14
a)Ct值(平均值±SD，N＝2)
b)(i/2)表示进行两次PCR显示阳性反应的次数。
c)ND表示PCR最终扩增产物为阴性。
d)ND、ND表示第一次和第二次的PCR最终扩增产物均为阴性。
e)EMA i/jμg/ml：表示进行两步EMA处理，第一次EMA处理的浓度为iμg/ml，第二次 EMA处理的浓度为jμg/ml。
表15
表16
表17
a)Ct值(平均值±SD，N＝2)
b)(i/2)表示进行两次PCR显示阳性反应的次数。
c)ND表示PCR最终扩增产物为阴性。
d)ND、35.1表示第一次的Ct值为ND，第二次的Ct值为35.1。
e)EMA i/jμg/ml：表示进行两步EMA处理，第一次EMA处理的浓度为iμg/ml，第二次 EMA处理的浓度为jμg/ml。
当多步处理中未添加EMA时，被推测为invA基因及肠毒素基因 扩增产物的谱带在沙门氏菌的活菌和损伤菌中均被检测到，从而不能 仅对活菌进行特异性检测。但是，在多步处理中添加了EMA时(EMA 10 μg/ml-保温-EMA10μg/ml)，活菌的谱带被清晰地检测到，而损伤菌的 谱带完全检测不到。因此，通过多步处理利用PCR可以仅选择性地检 测活菌。同样如表12及表15所示，从谱带强度数值化的数据来看， 即使在以378bp及264bp这样的较短基因为靶标的PCR中，通过多步 处理也能够清晰地鉴别活菌和损伤菌。
另外，如果也考虑表14的各Ct值，在单次处理EMA为25μg/ml 和100μg/ml，也能鉴别活菌和损伤菌，但活菌的Ct值分别为18.2±0.3、 27.7±3.8，与多步处理(EMA 10/10μg/ml)的活菌的Ct值为16.0±3.5相 比，增加了2.2和11.7左右，也就是说，即使单次处理时能够鉴别活 菌与死菌，由于活菌的检测限比多步处理低了约1log10细胞/ml (cells/ml)或者4log10细胞/ml，因此不能检测低浓度的阪崎菌。
6.讨论
以invA和肠毒素基因(378bp和284bp)这样的短基因为靶标的PCR 的情况下，在比较例3所示的单次处理中，使用10μg/ml的EMA处理 时，损伤菌的染色体DNA的双链各处不依赖细菌内酶而直接被EMA 切断，从而抑制了PCR。但是，如果活菌中EMA浓度增加则Ct值升 高，导致活菌的检测限降低。
另一方面，多步处理中，使EMA作用一次后，即使EMA透过一 些活菌使活菌数减少，通过在适合培养的培养基中保温，可以使活菌 数恢复到原来的数值、或者使活菌的扩散泵恢复、或者能够将未反应 的EMA排出菌体外。另一方面，损伤菌的染色体DNA各处受到EMA 的剧烈作用而断裂，但PCR扩增对象基因较短时，并非所有的染色体 DNA的原区域断裂，并且即使之后在培养基中进行保温也与活菌不同， 不可能增加细胞数。在这种情况下，如果使10μg/ml EMA再次作用， 则EMA仅透过损伤菌的细胞壁，促使染色体DNA进一步断裂，从而 不能仅检测损伤菌的PCR最终扩增产物的谱带。此外，根据表14和 17的Ct值的评价可以得出结论：由于多步处理过程中包括在培养基中 进行保温，从而使活菌的检测限提高，由此能够仅检测低浓度的活菌。
综上所述，本发明的方法(多步处理)中，当进行以革兰氏阴性菌的 阪崎肠杆菌、沙门氏菌、以及革兰氏阳性菌的李斯特菌的约80～500个 碱基总计五种短基因为靶标的PCR时，任何一种情况均不能检测出108细胞的损伤菌(包括死菌)的PCR最终扩增产物，而可以检测出活菌的 PCR最终扩增产物，因此，即使在含有最大105～107细胞/ml的各种病 原菌、损伤菌、死菌的牛奶中，也可以特异性地检测活菌。并且，即 使使用本实施例2所示的MMS基因(该MMS基因特异存在于阪崎菌 但并不一定与病原性有直接关系)，在利用多步处理以短基因为靶标的 PCR中，仍可以鉴别活菌和损伤菌，提示本申请不仅适用于病原菌， 还可适用于腐败细菌等普通细菌。因此，可以广泛用于食品卫生检查 的O-157、沙门氏菌、李斯特菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、金黄色 葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、肉毒杆菌、魏氏梭状芽胞杆菌等革兰氏阴 性菌和革兰氏阳性菌的检查。
并且，因菌血症而具有肝功能障碍的患者的情况中，血液中的病 原菌的活菌和抗生素损伤菌有可能以104细胞/ml以上的高浓度存在， 即使在这种情况下根据本发明也可以仅对病原菌的活菌进行检测。并 且，当适用于结核患者的抗结核剂的治愈经过观察时，主要以痰液为 检查材料，多数情况下结核患者在治疗前结核菌的活菌数为108～109细 胞/g，这些患者在治疗后期因抗结核剂导致损伤结核菌以107～108细胞 /g的浓度存在。在这种情况下，可以期待对能够培养的结核菌活菌进 行定量来作为培养法的迅速替代法，根据本发明可将PCR应用于结核 患者的治疗过程中的诊断。
[参考例1]来自食品的被测样品的配制
作为本发明被测样品之一的食品，假定牛奶中混入了微生物时的 被测样品的配制法如下所示。
向牛奶中分别添加EDTA溶液至终浓度为1～5mM(特别优选 2Mm)、以及Tween80至终浓度为0.1～0.5％(特别优选为0.1％)，在4℃ 下，进行10000×g、10分钟的冷冻离心分离。另外，优选添加终浓度 为10～20U/ml的脂肪酶(Sigma公司制E.C.3.1.1.3)，在30～37℃下处理 30分钟～1小时后，添加蛋白酶K(Sigma公司制E.C.3.4.21.64)至终浓度 为20U/ml，放置30分钟～1小时。除去液体表面的脂肪层和中间部的 水层，回收残渣。该残渣中含有细菌、乳腺上皮细胞、牛白细胞等体 细胞，以10000×g以上进行离心分离时，还包含蛋白酶K不完全分解 的胶束蛋白质(micellar protein)分解物(酪蛋白胶束不完全分解物、 incompletely-degraded micellar casein product)。其中，酪蛋白胶束不 完全分解物是高疏水性的α、β-酪蛋白的逊胶束。
向上述残渣中添加与初始体积相同的生理盐水并混悬后，在4℃下 进行100×g、5分钟的冷冻离心分离，回收存在微生物等的上清液。
[参考例2]来自血液的被测样品的配制(1)
向肝素化血液中添加同体积的生理盐水，在4℃下进行10000×g、 5分钟的离心分离，除去上清液，回收残渣。该残渣中含有细菌、血小 板、单核细胞和淋巴细胞等单核的细胞、粒细胞、以及红细胞。
[参考例3]来自血液的被测样品的配制(2)
向肝素化血液中添加同体积的生理盐水，在4℃下进行100×g、5 分钟的冷冻离心分离，分离为血浆和血细胞成分(单核细胞和淋巴细胞 等单核的细胞、粒细胞、以及红细胞)，回收存在微生物的血浆。
[参考例4]来自血液的被测样品的配制(3)
向肝素化血液中添加同体积的生理盐水。首先向灭菌试管中，填 充稀释了两倍的肝素化血液和同体积的菲可帕克 (Ficoll-Paque)[Amersham Biosciences K.K.；菲可400为5.7g/100ml、 泛影酸钠为9g/100ml。比重1.077g/ml]，然后，一边倾斜试管一边使上 述稀释了两倍的肝素化血液缓慢分层(重，layered)。接着，在4℃下 进行100×g、5分钟的冷冻离心分离，回收存在微生物的上清液。另外， 优选在菲可帕克中使稀释了两倍的肝素化血液分层前，添加终浓度为 10～20U/ml的脂肪酶(Sigma公司制E.C.3.1.1.3)溶液，然后再添加 10～50U/ml的去氧核糖核酸酶I(Sigma公司制、EC 3.1.21.1)溶液，在 30～37℃下处理30分钟～1小时后，添加蛋白酶K(Sigma公司制 E.C.3.4.21.64)至终浓度为10～20U/ml，在30～37℃下处理30分钟～1小 时。
[参考例5]来自血液的被测样品的配制(4)
向灭菌试管中，添加MonopolyTM[Amersham Biosciences K.K.；菲 可与甲基三元影酸(Metrizoate)的混合液、比重1.115g/ml]至肝素化血 液的1/2体积，一边倾斜试管一边使肝素化血液缓慢分层。接着，在4℃ 下进行100×g、5分钟的冷冻离心分离，回收存在细菌的上清液。
工业适用性
根据本发明，可以利用核酸扩增法简单且迅速地鉴别食品和生物 样品、工业用水、自来水等环境中的活菌、损伤菌、死菌。本发明的 方法及试剂盒能够用于自主检查，并且经济性优异。
序列表
<110>国立大学法人九州大学(KYUSHU UNIVERSITY)
<120>微生物检测方法及试剂盒
<130>FP186-C7308
<150>JP2007-212366
<151>2007-08-16
<160>6
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物hlyA-F
<400>1
tgcaagtcct aagacgcca 19
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物hlyA-R
<400>2
cactgcatct ccgtggtata ctaa 24
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ompA-F
<400>3
ggatttaacc gtgaactttt cc 22
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ompA-R
<400>4
cgccagcgat gttagaaga 19
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物MMS-F
<400>5
gggatattgt cccctgaaac ag 22
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物MMS-R
<400>6
cgagaataag ccgcgcatt 19