表皮葡萄球菌在合成异丁酸中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811266841.1 (22)申请日 2018.10.29 (83)生物保藏信息 GDMCC No： 60458 2018.10.08 (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南 路1023号 (72)发明人 张国霞方舒婷吴继国叶菊风 任悄悄吴镇东 (74)专利代理机构 广州市天河庐阳专利事务所 (普通合伙) 44244 代理人 胡济元 (51)Int.Cl. C12P 7/40(2006.01) C12R 1/44(2006.01) (5。

2、4)发明名称 表皮葡萄球菌在合成异丁酸中的应用 (57)摘要 本发明涉及表皮葡萄球菌在合成异丁酸中 的应用， 其中所述的表皮葡萄球菌保藏于广东省 微生物菌种保藏中心， 其保藏号为GDMCCNo： 60458。 本发明所述的表皮葡萄球菌具有较强的 快速产异丁酸能力， 每克干菌8小时可产异丁酸 358.59436.56g。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 CN 109295114 A 2019.02.01 CN 109295114 A 1.表皮葡萄球菌在合成异丁酸中的应用， 其中所述的表皮葡萄球菌保藏于广东省微生 物菌种保藏中心， 其保藏号为GDMCC No： 60458。 2.根据权利要。

3、求1所述的应用， 其特征在于， 所述的表皮葡萄球菌的培养方法如下： 取健康人的粪便加入PBS溶液溶解并使得粪便在溶液中的浓度为10g/L， 静置， 取上清 液2ml， 加入100mlECY液体培养基， 在37条件下密闭厌氧静止培养， 观察到有明显的浑浊 后转至ECY固体培养基中继续培养1天， 挑取快速生长的菌落在所述ECY固体培养基上进行 纯化， 得到单菌落， 即所述表皮葡萄球菌菌株； 将得到的菌株保存在体积浓度为15的甘油 水溶液中， 备用； 其中， 所述的ECY固体培养基常温下每1000ml由以下原料组成： 水苏糖2.4-4.4g， 胰酪胨5.8-7.8g， 酵母粉3.2-5.2g， 氯化。

4、钠3.7-5.3g， KH2PO4 0.5- 0.7g， MgSO47H2O 3.0-4.5g， 无水乙醇3.8-4.0ml， 琼脂粉15.3g-19.6g， 其余为蒸馏水； 所述ECY固体培养基的pH值为6.17.5； 所述的ECY液体培养基每1000ml由以下原料组成： 水苏糖2.4-4.4g， 胰酪胨5.8-7.8g， 酵母粉3.2-5.2g， 氯化钠3.7-5.3g， KH2PO4 0.5- 0.7g， MgSO47H2O 3.0-4.5g， 无水乙醇3.8-4.0ml， 其余为蒸馏水； 所述ECY液体培养基的pH值为7.20.1。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的。

5、异丁酸的合成方法如下： 吸取上述保存有表皮葡萄球菌菌株的甘油水溶液100微升和CFJ液体培养基10ml， 在37 条件下发酵培养8小时； 然后， 取1ml发酵培养液、 0.5ml体积浓度为50的H2SO4和2ml乙醚 置于Eppendorf管内离心2min， 取上清液移至另一只Eppendorf管内3000r/min 10min， 取上 清液， 0.22 m的滤膜过滤， 即得含异丁酸的上清液。 所述的CFJ液体培养基每1000ml由以下原料组成： 玉米粉10.5g， 食用级红糖4.2g， 氯化钠0.12g， 氯化钙0.09g， 硫酸镁0.008g， 磷酸氢二 钾0.04g， 碳酸氢钙0.4g，。

6、 其余为蒸馏水； 所述CFJ液体培养基的pH值为7.20.1。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109295114 A 2 表皮葡萄球菌在合成异丁酸中的应用 技术领域 0001 本发明 涉 及微生 物 ， 具 体涉 及葡萄球菌 属 ， 特 别是涉 及表皮 葡萄球 菌 (Staphylococcus epidermidis)及其代谢物。 背景技术 0002 异丁酸4个碳原子的支链脂肪酸,主要来源于脯氨酸、 精氨酸、 赖氨酸的降解终产 物， 同时也是合成支链缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸和脯氨酸等重要氨基酸的原料。 异丁酸是 消化道内产琥珀酸丝状杆菌等纤维降解菌的生长因子.能提高纤维分解菌的数量和。

7、对植物 细胞壁的消化能力， 从而提高纤维的消化率。 还可以削弱它的前体氨基酸在乳腺组织的分 解代谢。 过剩的支链氨基酸可用于非必需氨基酸的生物合成或参与其它生物合成反应， 从 而增加氮沉积。 使微生物蛋白的合成增加， 提供营养。 可见， 异丁酸在人体和动物肠道中都 是较必需的有益因子。 但是异丁酸的含量决定着其功能的发挥， 所以寻找能够产生异丁酸 的资源非常重要。 目前绝大多数研究成果都是菌群和肠组织的功效， 高效产异丁酸的单一 自然菌种资源非常少。 0003 现有文献报道中， 产异丁酸的主要微生物有大肠杆菌、 芽孢杆菌、 酿酒酵母、 恶臭 假单胞菌、 梭杆菌属的细菌、 拟杆菌属、 产黑色素类。

8、杆菌、 消化链球菌、 链球菌科的部分细菌 和乳酸乳球菌等， 这些资源中有一些是重组微生物。 它们产生异丁酸的时间需要24-96小时 不等， 所产的异丁酸的量约为几十毫摩尔。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题的是提供表皮葡萄球菌的用途。 0005 上述表皮葡萄球菌的用途具体是： 0006 表皮葡萄球菌在合成异丁酸中的应用， 其中所述的表皮葡萄球菌保藏于广东省微 生物菌种保藏中心， 其保藏号为GDMCC No： 60458。 0007 上述应用中， 所述的表皮葡萄球菌的培养方法如下： 0008 取健康人的粪便加入PBS溶液溶解并使得粪便在溶液中的浓度为10g/L， 静置， 取 上清液2。

9、ml， 加入100mlECY液体培养基， 在37条件下密闭厌氧静止培养， 观察到有明显的 浑浊后转至ECY固体培养基中继续培养1天， 挑取快速生长的菌落在所述ECY固体培养基上 进行纯化， 得到单菌落， 即所述表皮葡萄球菌菌株； 将得到的菌株保存在体积浓度为15的 甘油水溶液中， 备用； 其中， 0009 所述的ECY固体培养基常温下每1000ml由以下原料组成： 0010 水苏糖2.4-4.4g， 胰酪胨5.8-7.8g， 酵母粉3.2-5.2g， 氯化钠3.7-5.3g， KH2PO4 0.5-0.7g， MgSO47H2O 3.0-4.5g， 无水乙醇3.8-4.0ml， 琼脂粉15.3。

10、g-19.6g， 其余为蒸馏 水； 0011 所述ECY固体培养基的pH值为6.17.5； 0012 所述的ECY液体培养基每1000ml由以下原料组成： 说明书 1/4 页 3 CN 109295114 A 3 0013 水苏糖2.4-4.4g， 胰酪胨5.8-7.8g， 酵母粉3.2-5.2g， 氯化钠3.7-5.3g， KH2PO4 0.5-0.7g， MgSO47H2O 3.0-4.5g， 无水乙醇3.8-4.0ml， 其余为蒸馏水； 0014 所述ECY液体培养基的pH值为7.20.1。 0015 上述应用中， 所述的异丁酸的合成方法如下： 0016 吸取上述保存有表皮葡萄球菌菌株的。

11、甘油水溶液100微升和CFJ液体培养基10ml， 在37条件下发酵培养8小时； 然后， 取1ml发酵培养液、 0.5ml体积浓度为50的H2SO4和2ml 乙醚置于Eppendorf管内离心2min， 取上清液移至另一只Eppendorf管内3000r/min 10min， 取上清液， 0.22 m的滤膜过滤， 即得含异丁酸的上清液。 0017 所述的CFJ液体培养基每1000ml由以下原料组成： 0018 玉米粉10.5g， 食用级红糖4.2g， 氯化钠0.12g， 氯化钙0.09g， 硫酸镁0.008g， 磷酸 氢二钾0.04g， 碳酸氢钙0.4g， 其余为蒸馏水； 0019 所述CFJ液。

12、体培养基的pH值为7.20.1。 0020 本发明所述的表皮葡萄球菌具有较强的快速产异丁酸能力， 经验证， 每克干菌8小 时可产异丁酸358.59436.56 g。 具体实施方式 0021 实施例1 0022 一、 表皮葡萄球菌菌株的分离与纯化 0023 1.制备培养基 0024 制备ECY固体培养基： 常温下， 取水苏糖2.4g、 胰酪胨7.8g、 酵母粉3.2g、 氯化钠 5.3g、 KH2PO4 0.5g、 MgSO47H2O 3g、 无水乙醇4.0mL和琼脂粉18.5g混均， 加入蒸馏水定容 至1000ml， 调pH至6.1。 121,102KPa条件下灭菌20min， 待冷却至60摄。

13、氏度时分装到灭菌好 的9cm培养皿中， 每个培养皿25ml。 0025 制备ECY液体培养基： 取水苏糖2.4g、 胰酪胨7.8g、 酵母粉3.2g、 氯化钠5.3g、 KH2PO40.5g、 MgSO47H2O 3g和无水乙醇4.0mL混均， 加入蒸馏水定容至1000ml， 调pH至7.2 0.1。 121,102KPa条件下灭菌20min。 0026 2.制备表皮葡萄球菌菌株 0027 取健康人的新鲜粪便1g放入盛有100mlPBS溶液的三角瓶中， 在混匀器上混匀30 秒； 静止10分钟后， 取2ml上清液加入到盛有100ml的ECY液体筛选培养基的瓶子中密闭富集 培养。 富集培养是先在3。

14、7， 厌氧静止培养直至观察到有明显的浑浊后， 转接到新配置好的 ECY固体筛选培养基中继续培养； 然后挑取快速生长的菌落在ECY固体培养基上进行纯化， 直至得到单菌落， 即所述表皮葡萄球菌菌株； 随机挑取一环纯菌落保存在体积浓度为15 甘油水溶液中， 备用。 其中， 所述的PBS溶液的制备方法为： 取NaCl 8.0g、 KCl0.2g、 Na2HPO4 1.44g和KH2PO40.24g,加入蒸馏水定溶至1000ml,用HCl调节溶液的pH值为7.4。 0028 二、 菌株的鉴定 0029 取步骤一所得到的表皮葡萄球菌菌株的单菌落， 按照天根的细菌基因组DNA提取 试剂盒的方法提取总DNA，。

15、 然后送去测序公司进行16S rRNA基因测序， 测序引物是27f和 1492r， 得到的序列拼接后得到的表皮葡萄球菌16SrRNA基因序列如SEQ NO.1所示； 将该序 列在NCBI数 据库中 进行Blast比 对 ， 得到与其最 相近的 菌株是表皮葡萄球菌 说明书 2/4 页 4 CN 109295114 A 4 (Staphylococcus epidermidis)。 搜索模式菌株为表皮葡萄球菌ATCC12600T的16S rRNA基 因序列， 然后通过比对软件GeneDoc 2.0进行两个菌株的比对， 相似性结果为99.1。 0030 上述表皮葡萄球菌菌种已于2018年10月08日。

16、保藏于地址在中国广州市先烈中路 100号省微生物所实验楼五楼的广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)， 其保藏号为 GDMCC No： 60458。 所述保藏号为GDMCC No： 60458的表皮葡萄球菌菌种的鉴别特征为 Staphylococcus epidermidisCF211， 分类学名称为Staphylococcus epidermidis。 0031 三、 异丁酸的合成及效果验证 0032 (1)异丁酸合成方法： 0033 吸取步骤一得到的保存有表皮葡萄球菌菌株的甘油水溶液100微升和CFJ液体培 养基10ml， 在37条件下发酵培养8小时； 然后， 取1ml发酵培养液、 0。

17、.5ml体积浓度为50的 H2SO4和2ml乙醚置于Eppendorf管内离心2min， 取上清液移至另一只Eppendorf管内3000r/ min10min， 取上清液， 0.22 m的滤膜过滤， 即得含异丁酸的上清液； 其中所述的CFJ液体培养 基的制备方法为： 取玉米粉10.5g， 食用级红糖4.2g， 氯化钠0.12g， 氯化钙0.09g， 硫酸镁 0.008g， 磷酸氢二钾0.04g， 碳酸氢钙0.4g， 加入蒸馏水定溶至1000ml， 调pH值至7.20.1。 0034 (2)效果验证方法： 0035 (2.1)检测仪器： 安捷伦气相色-谱质谱联用系统5977B GC/MSD、 。

18、质量选择性检测 器和HP-FFAP(30m*0.25mm*0.25 m)色谱柱均购自安捷伦公司。 0036 (2.2)样品： 上述异丁酸合成方法所得到的含异丁酸的上清液1ml。 0037 (2.3)异丁酸标准品： 购于sigma公司， 纯度为99.9， 密度是0.95g/mL。 0038 (2.4)内标物： 浓度为10mg/ml的2-乙基丁酸。 0039 (2 .5)建立标准曲线方程： 取异丁酸标准品53L， 加乙醚定容至5ml， 制备成 10.026mg/mL的浓溶液； 用乙醚溶剂把浓溶液稀释成浓度分别为10 g/mL、 20 g/mL、 40 g/ mL、 60 g/mL、 80 g/mL。

19、、 100 g/mL的标准溶液1mL； 每1ml标准溶液中加入内标5 l浓度为 10mg/ml的2-乙基丁酸并放入进样瓶中加样上气相色-谱质谱联用系统进检测， 具体检测方 法和条件为： 用氦气作为载气； 控制气流流速为1.0ml/min， 柱分流比为30： 1； 采用； 程序升 温： 将柱温初始温度设为90， 维持1min， 然后以15/min的速率将温度上升至180， 保持 1min， 后运行温度为230， 维持0 .5min； 然后， 采用常规方法得到标准曲线方程Y 0.393866*X+0.024749(R20.99619966)， 标准曲线方程中Y为相对响应值， X为异丁酸浓 度。 0。

20、040 (2.6)样品的检测： 往1ml样品中加入内标5 l浓度为10mg/ml的2-乙基丁酸并放入 进样瓶中加样上气相色-谱质谱联用系统进检测， 具体检测方法和条件与上述标准品的检 测方法橡相同； 将得到的相对响应值代入上述建立标准曲线方程中便得到对应的浓度值， 然后根据异丁酸合成方法中所得到的所述含异丁酸的上清液的体积即可计算出1ml发酵培 养液产异丁酸的量。 更进一步地， 可采用常规烘干称重的方法测算出每克干菌产异丁酸的 能力。 本例所得到的表皮葡萄球菌， 每克干菌8小时可产异丁酸423.539 g。 0041 实施例2 0042 本例中， 除所采用的ECY固体培养基和ECY液体培养基中。

21、各种原料的用量不同， 所 得到的表皮葡萄球菌菌株的产异丁酸的能力略有差异之外， 其它实施方法均与实施例1相 同。 说明书 3/4 页 5 CN 109295114 A 5 0043 1、 常温下， 取水苏糖3.0g、 胰酪胨5.8g、 酵母粉4.5g、 氯化钠3.7g、 KH2PO4 0.6g、 MgSO47H2O 3.5g、 无水乙醇3.9mL和琼脂粉19.6g混均， 加入蒸馏水定容至1000ml， 调pH至 6.70.1。 121,102KPa条件下灭菌20min， 待冷却至60摄氏度时分装到灭菌好的9cm培养 皿中， 每个培养皿25ml 0044 2、 制备ECY液体培养基： 取水苏糖3。

22、.0g、 胰酪胨5.8g、 酵母粉4.5g、 氯化钠3.7g、 KH2PO4 0.6g、 MgSO47H2O 3.5g和无水乙醇3.9mL混均， 加入蒸馏水定容至1000ml， 调pH值 至6.70.1。 121,102KPa条件下灭菌20min。 0045 3、 本例所得到的表皮葡萄球菌菌株， 每克干菌8小时可产异丁酸436.56 g。 0046 实施例3 0047 本例中， 除所采用的ECY固体培养基和ECY液体培养基中各种原料的用量不同， 所 得到的表皮葡萄球菌菌株的产异丁酸的能力略有差异之外， 其它实施方法均与实施例1相 同。 0048 1、 制备ECY固体培养基： 常温下， 取水苏糖。

23、4.4g、 胰酪胨6.4g、 酵母粉5.2g、 氯化钠 4.2g、 KH2PO4 0.7g、 MgSO47H2O 4.5g、 无水乙醇3.8mL和琼脂粉15.3g混均， 加入蒸馏水定 容至1000ml， 调pH至7.20.1。 121,102KPa条件下灭菌20min， 待冷却至60摄氏度时分装 到灭菌好的9cm培养皿中， 每个培养皿25ml 0049 2、 制备ECY液体培养基： 取水苏糖4.4g、 胰酪胨6.4g、 酵母粉5.2g、 氯化钠4.2g、 KH2PO4 0.7g、 MgSO47H2O 4.5g、 无水乙醇3.8mL混匀， 加入蒸馏水定容至1000ml， 调pH至 7.20.1。。

24、 121,102KPa条件下灭菌20min。 0050 3、 本例所得到的表皮葡萄球菌菌株， 每克干菌8小时可产异丁酸358.59 g。 说明书 4/4 页 6 CN 109295114 A 6 序列表 南方医科大学 表皮葡萄球菌在合成异丁酸中的应用 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 1444 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 tgcagtcgag cgacagacga ggagcttgct cctctgacgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtggat aacctaccta taagactggg ataactt。

25、cgg gaaaccggag ctaataccgg 120 ataatatatt gaaccgcatg gttcaatagt gaaagacggt tttgctgtca cttatagatg 180 gatccgcgcc gcattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcaac gatgcgtagc 240 cgacctgaga gggtgatcgg ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag 300 gcagcagtag ggaatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaacgc cgcgt。

26、gagtg 360 atgaaaggtt cttcgggatc gtaaaactct gttattaggg aagaacaaat gtgttaagta 420 aactatgcac gtcttgacgg tacctaatca gaaagcccac ggctaaacta cgtgccagca 480 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccgggaatt attgggcgta aagcgcgcgt 540 aggcggtttt tttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa 600 actggaaaac。

27、 ttgagtgcag aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgc 660 agagatatgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacgctgatg 720 tgcgaaagcg tggggatcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780 agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc 840 gcctggggag tacgaccgca aggttgaa。

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29、ctgccg gtgacaaacc 1140 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgatttgggc tacacacgtg 1200 ctacaatgga caatacaaag ggtagcgaaa ccgcgaggtc aagcaaatcc cataaagttg 1260 ttctcagttc ggattgtagt ctgcaactcg actatatgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320 tagatcagca tgctacggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380 cgagagtttg taacacccga agccggtgga gtaaccattg gagctagccg tcgaagtgac 1440 tttg 1444 序列表 1/1 页 7 CN 109295114 A 7 。