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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811225478.9 (22)申请日 2018.10.20 (71)申请人 桂林理工大学 地址 541004 广西壮族自治区桂林市七星 区建干路12号 (72)发明人 朱文远梁晓琳周琳莹李丹 温其霖潘宏程 (51)Int.Cl. C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) (54)发明名称 一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学 检测方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于生物条形码的 microRNA-7a电化学检测。
2、方法及应用。 首先利用 磁珠标记链霉亲和素修饰的捕获探针形成MB- CP1结构， 金纳米标记巯基修饰的信号探针和条 形码形成Au-RP1-barcode结构。 在目标物的存在 下， MB-CP1,Au-RP1分别与目标物两端互补， 形成 “三明治” 结构， 利用二硫苏糖醇释放金纳米上面 的条形码。 生物传感器由连接在金电极上亚甲基 蓝修饰的信号探针RP2与捕获探针CP2杂交组成， 加入释放的条形码与捕获探针杂交， 信号探针中 修饰亚甲基蓝的一端与金电极接近， 产生了信号 电流， 从而间接定量检测了目标物。 本发明选择 性好、 灵敏度高、 在癌症标记物的检测中有着重 要的应用价值。 权利要求书2。
3、页 说明书7页 附图3页 CN 109295169 A 2019.02.01 CN 109295169 A 1.一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法， 其特征在于具体步骤为： （1） 纳米金合成制备： 移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶 中， 将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作 为还原剂， 继续加热15分钟， 观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色， 最后停止加 热冷却至室温， 并且全程处于搅拌状态下进行， 得浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液； 纳米金 的粒径为16nm； （2） 金标记。
4、识别信号探针以及条形码即Au-RP1-barcode的制备： 取2.5 L浓度为10 mol/L的信号探针RP1与50 L275 L浓度为10 mol/L的条形码混合后加入202.5 L含10 mmol/L 三(2-羧乙基)膦浓度为10 mmol/L pH 5.87.4的磷酸盐缓冲溶液中活化2小时， 活 化完毕后加入0.5 mL步骤 （1） 所得的浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液， 立即震荡均匀并迅速 裹上锡纸避光孵育16小时； 接着加入9.1 L质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠溶 液， 使最终质量百分比浓度为0.1 %； 再加入101.6 L浓度为0.1mol/L pH 7.4。
5、 磷酸盐缓冲 溶液， 使其最终浓度为10 mmol/L； 再加入53.5 L浓度为2 mol/L 的NaCl溶液， 使其最终浓 度为0.1mol/L； 在孵育24小时后使用高速离心机离心， 10000 转/分钟， 20分钟， 分散至含 0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中并重复清洗3次， 去掉上清液， 最后分散0.5 mL至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中， 震荡 均匀， 放置在4的黑暗环境中得Au-RP1-barcode溶液； 所 述 的 信 号 探 针 R P 1 为 巯 基 修 饰 的 D。
6、 N A 序 列 ， 其 碱 基 序 列 为 ： 5- S H - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTATACAAC-3 ； （3） 磁珠标记捕获探针即MB-CP1的制备： 量取1 mg磁珠置于离心管中， 经过磁性分离， 弃去上清液， 然后用100 L TTL缓冲溶液清洗1次， 接着分散至200 L TTL缓冲溶液中， 然 后往溶液中加入50 L浓度为10 mol/L捕获探针CP1， 在室温下轻微震荡孵育15分钟， 以使 生物素修饰的捕获探针CP1与链霉亲和素包被的磁珠MB轻缓而充分地结合， 最后使用100 L TT 缓冲溶液清洗2次， 磁性分离， 弃去上清液， 分散至500 L含。
7、0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中得浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液； 所 述 的 捕 获 探 针 C P 1 为 修 饰 生 物 素 的 D N A 序 列 ， 其 碱 基 序 列 为 ： 5- CTACTACCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-biotin-3 ； 所述TTL缓冲溶液包含100 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为的0.1% Tween 20以及1mol/L LiCl ； 所述TT 缓冲溶液包含250 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为0.1% Tw。
8、een 20； （4） 探针杂交以及条形码释放： 移取10 L步骤 （2） 所得浓度为5.8 nmol/mL Au-RP1- barcode溶液、 10 L步骤 （3） 所得浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液和10 L浓度范围为1fmol/L 1pmol/L的目标物， 震荡混匀后置于PCR仪中在30 下孵育45分钟， 磁性分离， 用含 0.1mol/L NaCl、 0.1% 十二烷基硫酸钠10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液， 振荡清洗三次 后， 将收集的磁珠分散至10 uL浓度为 0.5 mol/L的二硫苏糖醇溶液中， 在50下反应15 分钟， 再在25下保持45分钟， 最后。
9、经过磁性分离， 取上清液， 得条形码， 4冷藏备用； （5） 生物传感器的组装以及目标物检测： 取4 L浓度为10 umol/L 捕获探针CP2与72 uL浓度为10 mmol/L pH 5.87.4磷酸盐缓冲溶液混合,然后加入4 uL含10 mmol/L三(2-羧 权利要求书 1/2 页 2 CN 109295169 A 2 乙基)膦浓度为10 mmol/L pH 5.87.4 磷酸盐缓冲溶液， 振荡均匀， 室温下活化2小时； 在 已经处理好的金电极表面滴加10 uL活化后的捕获探针CP2， 在室温下孵育反应16小时； 用 浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液对金电极浸洗3次，。
10、 除去未连接捕获探针CP2， 然后用氮 气吹干金电极表面， 滴加10 uL含1 mmol/L巯基己醇浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲 溶液， 封闭时间为1小时； 用浓度为200 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液对金电极浸洗3次， 除去未连接的巯基乙醇， 氮气吹干金电极表面； 在金电极表面滴加10 uL浓度为2.5 umol/L 的信号探针 RP2， 杂交时间为6小时； 用含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸 盐缓冲溶液对金电极进行浸洗3次， 用氮气吹干金电极表面； 往金电极表面滴加10 uL步骤 （4） 所得条形码， 杂交5 小。
11、时； 用含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲 溶液对金电极进行浸洗3次， 以除去游离的条形码， 用氮气吹干金电极表面； 利用三电极体 系， 以含0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液为电解质， 用差分脉冲伏安法 对金电极表面的电活性物质亚甲基蓝进行扫描， 由此间接得到不同浓度目标物的电化学信 号； 所述捕获探针CP2 为巯基修饰的DNA序列， 其碱基序列为： 5 -SH-GCGAGTTAGACCGATC CCCCCCCTTCGTCCAGTCTTTT -3 ; 所述 信号探针R P2为亚甲 基蓝MB修饰的 DNA序。
12、列 ， 其碱基序列为 ： 5-MB- GACTGGACGCCCCCCCATCGGTCTAACTCGC -3 。 2.根据权利要求1所述基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法的应用， 其特征 在于所述基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法能应用于癌症标记物的检测。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109295169 A 3 一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法及应用， 属于分 子生物学和核酸化学领域。 背景技术 0002 MicroRNA （miRNA）。
13、 作为一种非常重要的非编码蛋白的RNA， 广泛存在于植物、 病毒、 哺乳动物当中。 在细胞增殖、 细胞死亡、 肿瘤发生和哺乳动物细胞生长中起着重要的调节功 能， miRNA序列短序列相似性高， 含量低， 因此发展灵敏选择性好的miRNA检测方法十分有 必要， 也为疾病的早期诊断提供新思路。 0003 生物条形码技术 （BCA） 以纳米颗粒为基础的扩增技术， 由于经过多次信号放大， 检 测灵敏度非常高， 其高灵敏度主要来自两个方面：（1） 数以万计的条形码DNA 修饰于金纳米 颗粒上， 从而使针对每个捕获目标的检测灵敏度放大了2 4 个数量级；（2） 每个条形码 DNA 均可使用核酸检测方法完成。
14、另一个信号放大。 因此， 随着相关技术的进一步发展， BCA 技术必将在人类肿瘤或其他疾病的诊断中得到广泛应用。 0004 生物传感器是传感器的一个分支， 以生物活性材料 （蛋白质、 抗体、 核酸等） 作为敏 感元件与目标物分析反应， 以电极作为转换装置， 输出与目标物浓度相关的电信号作为检 测信号， 由于其具有高灵敏度和高选择性， 被广泛应用到生物分析化学领域中。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种基于生物条形码的miRNA-7a电化学检测方法及应用。 0006 具体步骤为： （1） 纳米金合成制备： 移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶 中， 将其放置。
15、油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作 为还原剂， 继续加热15分钟， 观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色， 最后停止加 热冷却至室温， 并且全程处于搅拌状态下进行， 得浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液； 通过扫 描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm。 0007 （2） 金标记识别信号探针以及条形码 （Au-RP1-barcode） 的制备： 取2.5 L浓度为10 mol/L的信号探针RP1与50 L275 L浓度为10 mol/L的条形码混合后加入202.5 L含10 mmol/L 三(2-羧乙基)膦 （TCEP） 浓度为10 mmol。
16、/L pH 5.87.4的磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中 活化2小时， 活化完毕后加入0.5 mL步骤 （1） 所得的浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液， 立即震 荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时； 接着加入9.1 L质量百分比浓度为10% 的十二烷 基硫酸钠 （SDS） 溶液， 使最终质量百分比浓度为0.1 %； 再加入101.6 L浓度为0.1mol/L pH 7.4 PBS溶液， 使其最终浓度为10 mmol/L； 再加入53.5 L浓度为2 mol/L 的NaCl溶液， 使其 最终浓度为0.1mol/L。 在孵育24小时后使用高速离心机离心 （10000 转/分钟， 20分钟）。
17、 ， 分 散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中并重复清洗3次， 去掉上清液， 最后分散0.5 mL至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中， 震荡均匀， 放 说明书 1/7 页 4 CN 109295169 A 4 置在4的黑暗环境中得Au-RP1-barcode溶液。 0008 所 述的 信号 探针R P1 为 巯基修 饰的 DN A 序列 ， 其 碱基 序 列为 ： 5- SH- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTATACAAC-3 。 0009 （3） 磁珠标记捕获探针 （MB-CP。
18、1） 的制备： 量取1 mg磁珠置于离心管中， 经过磁性分 离， 弃去上清液， 然后用100 L TTL缓冲溶液清洗1次， 接着分散至200 L TTL缓冲溶液中， 然后往溶液中加入50 L浓度为10 mol/L捕获探针CP1， 在室温下轻微震荡孵育15分钟， 以 使生物素修饰的捕获探针CP1与链霉亲和素包被的磁珠MB轻缓而充分地结合， 最后使用100 L TT 缓冲溶液清洗2次， 磁性分离， 弃去上清液， 分散至500 L含0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中得浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液。 0010 所 述的 捕获 探 针 C P1 为 。
19、修 饰 生 物素的 DN A 序 列 ， 其 碱 基 序 列为 ： 5- CTACTACCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-biotin-3 。 0011 所述TTL缓冲溶液包含100 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为的0.1% Tween 20以及1mol/L LiCl 。 0012 所述TT 缓冲溶液包含250 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为0.1% Tween 20。 0013 （4） 探针杂交以及条形码释放： 移取10 L步骤 （2） 所得浓度为5.8 nmol/mL Au- RP1-barcode溶液。
20、、 10 L步骤 （3） 所得浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液和10 L浓度范围为 1fmol/L1pmol/L的目标物， 震荡混匀后置于PCR仪中在30 下孵育45分钟， 磁性分离， 用 10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液 （含0.1mol/L NaCl、 0.1% 十二烷基硫酸钠） 振荡清洗三次后， 将收集的磁珠分散至10 uL浓度为 0.5 mol/L的二硫苏糖醇 （DTT） 溶液中， 在50下反应 15 分钟， 再在25下保持45分钟， 最后经过磁性分离， 取上清液， 得条形码， 4冷藏备用。 0014 （5） 生物传感器的组装以及目标物检测： 取4 L浓度为10 um。
21、ol/L 捕获探针CP2与 72 uL浓度为10 mmol/L pH 5.87.4 PBS溶液混合,然后加入4 uL含10 mmol/L三(2-羧乙 基)膦浓度为10 mmol/L pH 5.87.4 PBS溶液， 振荡均匀， 室温下活化2小时； 在已经处理好 的金电极表面滴加10 uL活化后的捕获探针CP2， 在室温下孵育反应16小时； 用浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液对金电极浸洗3次， 除去未连接捕获探针CP2， 然后用氮气吹干金电 极表面， 滴加10 uL含1 mmol/L巯基己醇浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液， 封闭时间为1 小时； 用浓度为20。
22、0 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极浸洗3次， 除去未连接的巯基乙醇， 氮 气吹干金电极表面； 在金电极表面滴加10 uL浓度为2.5 umol/L的信号探针 RP2， 杂交时间 为6小时； 用含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极进行浸洗3次， 用氮气吹干金电极表面； 往金电极表面滴加10 uL步骤 （4） 所得条形码， 杂交5 小时； 用含 0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极进行浸洗3次， 以除去游离的 条形码， 用氮气吹干金电极表面； 利用三电极体系， 以含0.1 mol/。
23、L NaCl 10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液为电解质， 用差分脉冲伏安法对金电极表面的电活性物质 （亚甲基蓝） 进行扫 描， 由此间接得到不同浓度目标物的电化学信号。 0015 所述捕获探针CP2 为巯基修饰的DNA序列， 其碱基序列为： 5 -SH-GCGAGTTAGACC GATCCCCCCCCTTCGTCCAGTCTTTT -3 ; 信号探针RP2为亚甲基蓝MB修饰的DNA序列， 其碱基 序列为： 5 -MB-GACTGGACGCCCCCCCATCGGTCTAACTCGC -3 。 0016 本发明能应用于癌症标记物的检测。 说明书 2/7 页 5 CN 109295169。
24、 A 5 0017 本发明方法的优点如下： 1、 生物条形码的引用， 间接放大了检测的信号， 提高了检测的灵敏度， 实现了对目标物 miRNA-7a的超灵敏检测。 0018 2、 利用探针的特异性识别， 可实现对目标物的高特异性检测。 0019 3、 制备方法比较简单， 操作简单， 性能稳定。 0020 4、 该方法的反应条件温和， 环保绿色。 0021 5、 本发明在癌症标记物的检测中有着重要的应用价值。 附图说明 0022 图1为本发明的原理图。 0023 图2为本发明施例1实施例纳米金的透射电镜图 图3为本发明施例1生物传感器的组装阻抗图。 0024 图4为本发明施例1金纳米与条形码的数。
25、量比例优化图。 0025 图5为本发明施例2活化探针溶液的pH值优化凝胶电泳图。 0026 图6为本发明实施例3目标物电化学响应图和线性曲线图。 具体实施方式 0027 以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做详细说明。 0028 实施例1： （1） 纳米金合成制备： 移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶 中， 将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作 为还原剂， 继续加热15分钟， 观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色， 最后停止加 热冷却至室温， 并且全程处于搅拌状态下进行， 得浓度为5.8 nmol/mL金纳米。
26、溶液； 通过扫 描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm。 0029 （2） 金标记识别信号探针以及条形码 （Au-RP1-barcode） 的制备： 取2.5 L浓度为10 mol/L的信号探针RP1与体积分别为50 L、 125 L、 200 L浓度为10 mol/L的条形码混合后 加入202.5 L含10 mmol/L 三(2-羧乙基)膦 （TCEP） 浓度为10 mmol/L pH 5.8的磷酸盐缓 冲溶液 （PBS） 中活化2小时， 活化完毕后加入0.5 mL步骤 （1） 所得的浓度为5.8 nmol/mL金纳 米溶液， 立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时； 接着加入9.1。
27、 L质量百分比浓度 为10% 的十二烷基硫酸钠 （SDS） 溶液， 使最终质量百分比浓度为0.1 %； 再加入101.6 L浓度 为0.1mol/L pH 7.4 PBS溶液， 使其最终浓度为10 mmol/L； 再加入53.5 L浓度为2 mol/L 的NaCl溶液， 使其最终浓度为0.1mol/L。 在孵育24小时后使用高速离心机离心 （10000 转/ 分钟， 20分钟） ， 分散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中并重复清洗 3次， 去掉上清液， 最后分散0.5 mL至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 。
28、PBS溶液 中， 震荡均匀， 放置在4的黑暗环境中得Au-RP1-barcode溶液。 0030 所 述的 信号 探针R P1 为 巯基修 饰的 DN A 序列 ， 其 碱基 序 列为 ： 5- SH- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTATACAAC-3 。 0031 （3） 磁珠标记捕获探针 （MB-CP1） 的制备： 量取1 mg磁珠置于离心管中， 经过磁性分 离， 弃去上清液， 然后用100 L TTL缓冲溶液清洗1次， 接着分散至200 L TTL缓冲溶液中， 说明书 3/7 页 6 CN 109295169 A 6 然后往溶液中加入50 L浓度为10 mol/L捕获探针。
29、CP1， 在室温下轻微震荡孵育15分钟， 以 使生物素修饰的捕获探针CP1与链霉亲和素包被的磁珠MB轻缓而充分地结合， 最后使用100 L TT 缓冲溶液清洗2次， 磁性分离， 弃去上清液， 分散至500 L含0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中得浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液。 0032 所 述的 捕获 探 针 C P1 为 修 饰 生 物素的 DN A 序 列 ， 其 碱 基 序 列为 ： 5- CTACTACCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-biotin-3 ； TTL缓冲溶液包含100 mmol/L Tris-HCl、 。
30、pH 8.0， 体积百分比浓度为的0.1% Tween 20以及1mol/L LiCl ； TT 缓冲溶液包含250 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为0.1% Tween 20。 0033 （4） 探针杂交以及条形码释放： 移取10 L步骤 （2） 中浓度为5.8 nmol/mL Au-RP1- barcode溶液、 10 L步骤 （3） 中浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液、 10 L浓度为100 fmol/L的目 标物， 震荡混匀后置于PCR仪中在30 下孵育45分钟， 磁性分离， 用 10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液 （含0.1mol/L。
31、 NaCl、 0.1%SDS） 振荡清洗三次后， 将收集的磁珠分散至10 uL浓度为 0.5 mol/L的二硫苏糖醇 （DTT） 溶液中， 在50下反应15 分钟， 再在25下保持45 分钟， 最后经过磁性分离， 取上清液得到10uL的条形码溶液， 4冷藏备用。 0034 （5） 生物传感器的组装以及目标物检测： 取4 uL浓度为10 umol/L 捕获探针CP2与 72 uL浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液混合,然后加入4 uL 含10 mmol/L 三(2-羧乙基) 膦浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液， 振荡均匀， 室温下活化2小时； 在已经处理好的金电。
32、 极表面滴加10 uL活化后的捕获探针CP2， 在室温下孵育反应16小时； 用浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液对金电极浸洗3次， 除去未连接捕获探针CP2， 然后用氮气吹干金电极表面， 滴加10 uL含1 mmol/L巯基己醇浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液， 封闭时间为1小时； 用 浓度为200 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极浸洗3次， 除去未连接的巯基乙醇， 氮气吹干 金电极表面； 在金电极表面滴加10 uL浓度为2.5 umol/L的信号探针 RP2， 杂交时间为6小 时； 用含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH。
33、 7.4 PBS溶液对金电极进行浸洗3次， 用氮气 吹干金电极表面； 往金电极表面滴加10 uL步骤 （4） 所得条形码， 杂交5 小时； 用含0.1 mol/ L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极进行浸洗3次， 以除去游离的条形码， 用 氮气吹干金电极表面； 利用三电极体系， 以含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液作为电解质， 用差分脉冲伏安法对金电极表面的电活性物质 （亚甲基蓝） 进行扫描， 由此间接得到浓度为100 fmol/L目标物的电化学信号。 0035 所述捕获探针CP2 为巯基修饰的DNA序列， 其碱基。
34、序列为： 5 -SH-GCGAGTTAGACC GATCCCCCCCCTTCGTCCAGTCTTTT -3 ; 信号探针RP2为亚甲基蓝MB修饰的DNA序列， 其碱基 序列为： 5 -MB-GACTGGACGCCCCCCCATCGGTCTAACTCGC -3 。 0036 实施例2： （1） 纳米金合成制备： 移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶 中， 将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作 为还原剂， 继续加热15分钟， 观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色， 最后停止加 热冷却至室温， 并且全程处于搅拌状态下进行。
35、， 得浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液； 通过扫 描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm。 0037 （2） 金标记识别信号探针以及条形码 （Au-RP1-barcode） 的制备： 取2.5 L浓度为10 mol/L的信号探针RP1与体积分别为200 L浓度为10 mol/L的条形码混合后加入202.5 L 说明书 4/7 页 7 CN 109295169 A 7 含10 mmol/L 三(2-羧乙基)膦 （TCEP） 浓度为10 mmol/L pH 为5.8、 7.4的磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中活化2小时， 活化完毕后加入0.5 mL步骤 （1） 所得的浓度为5.8 nmol。
36、/mL金纳米溶 液， 立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时； 接着加入9.1 L质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠 （SDS） 溶液， 使最终质量百分比浓度为0.1 %； 再加入101.6 L浓度为 0.1mol/L pH 7.4 PBS溶液， 使其最终浓度为10 mmol/L； 再加入53.5 L浓度为2 mol/L 的 NaCl溶液， 使其最终浓度为0.1mol/L。 在孵育24小时后使用高速离心机离心 （10000 转/分 钟， 20分钟） ， 分散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中并重复清洗3 次， 去掉上清液， 最后分散0。
37、.5 mL至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液 中， 震荡均匀， 放置在4的黑暗环境中得Au-RP1-barcode溶液。 0038 所 述的 信号 探针R P1 为 巯基修 饰的 DN A 序列 ， 其 碱基 序 列为 ： 5- SH- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTATACAAC-3 。 0039 （3） 磁珠标记捕获探针 （MB-CP1） 的制备： 量取1 mg磁珠置于离心管中， 经过磁性分 离， 弃去上清液， 然后用100 L TTL缓冲溶液清洗1次， 接着分散至200 L TTL缓冲溶液中， 然后往溶液中加入50 L浓度为。
38、10 mol/L捕获探针CP1， 在室温下轻微震荡孵育15分钟， 以 使生物素修饰的捕获探针CP1与链霉亲和素包被的磁珠MB轻缓而充分地结合， 最后使用100 L TT 缓冲溶液清洗2次， 磁性分离， 弃去上清液， 分散至500 L含0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中得浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液。 0040 所 述的 捕获 探 针 C P1 为 修 饰 生 物素的 DN A 序 列 ， 其 碱 基 序 列为 ： 5- CTACTACCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-biotin-3 ； TTL缓冲溶液包含100 mmol/。
39、L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为的0.1% Tween 20以及1mol/L LiCl ； TT 缓冲溶液包含250 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为0.1% Tween 20。 0041 （4） 探针杂交以及条形码释放： 移取10 L步骤 （2） 中浓度为5.8 nmol/mL Au-RP1- barcode溶液、 10 L步骤 （3） 中浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液、 10 L浓度为100 fmol/L的目 标物， 震荡混匀后置于PCR仪中在30 下孵育45分钟， 磁性分离， 用 10 mmol/L pH 7.4 PBS溶。
40、液 （含0.1mol/L NaCl、 0.1%SDS） 振荡清洗三次后， 将收集的磁珠分散至10 uL浓度为 0.5 mol/L的二硫苏糖醇 （DTT） 溶液中， 在50下反应15 分钟， 再在25下保持45 分钟， 最后经过磁性分离， 取上清液得到10uL的条形码溶液， 4冷藏备用。 0042 （5） 生物传感器的组装以及目标物检测： 取4 uL浓度为10 umol/L 捕获探针CP2与 72 uL浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液混合,然后加入4 uL 含10 mmol/L 三(2-羧乙基) 膦浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液， 振荡均匀， 室温下活化2小。
41、时； 在已经处理好的金电 极表面滴加10 uL活化后的捕获探针CP2， 在室温下孵育反应16小时； 用浓度为10 mmol/L pH 5.8 PBS溶液对金电极浸洗3次， 除去未连接捕获探针CP2， 然后用氮气吹干金电极表面， 滴加10 uL含1 mmol/L巯基己醇浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液， 封闭时间为1小时； 用 浓度为200 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极浸洗3次， 除去未连接的巯基乙醇， 氮气吹干 金电极表面； 在金电极表面滴加10 uL浓度为2.5 umol/L的信号探针 RP2， 杂交时间为6小 时； 用含0.1 mol/L NaCl浓度为。
42、10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极进行浸洗3次， 用氮气 吹干金电极表面； 往金电极表面滴加10 uL步骤 （4） 所得条形码， 杂交5 小时； 用含0.1 mol/ L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液对金电极进行浸洗3次， 以除去游离的条形码， 用 氮气吹干金电极表面； 利用三电极体系， 以含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 说明书 5/7 页 8 CN 109295169 A 8 PBS溶液作为电解质， 用差分脉冲伏安法对金电极表面的电活性物质 （亚甲基蓝） 进行扫描， 由此间接得到浓度为100 fmol/L目。
43、标物的电化学信号。 0043 所述捕获探针CP2 为巯基修饰的DNA序列， 其碱基序列为： 5 -SH-GCGAGTTAGACC GATCCCCCCCCTTCGTCCAGTCTTTT -3 ; 信号探针RP2为亚甲基蓝MB修饰的DNA序列， 其碱基 序列为： 5 -MB-GACTGGACGCCCCCCCATCGGTCTAACTCGC -3 。 0044 实施例3： （1） 纳米金合成制备： 移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶 中， 将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作 为还原剂， 继续加热15分钟， 观察溶液的颜色从最。
44、初的淡黄色逐渐变成酒红色， 最后停止加 热冷却至室温， 并且全程处于搅拌状态下进行， 得浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液； 通过扫 描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm。 0045 （2） 金标记识别信号探针以及条形码 （Au-RP1-barcode） 的制备： 取2.5 L浓度为10 mol/L的信号探针RP1与200 L浓度为10 mol/L的条形码混合后加入202.5 L含10 mmol/ L 三(2-羧乙基)膦 （TCEP） 浓度为10 mmol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中活化2小时， 活化完毕后加入0.5 mL步骤 （1） 所得的浓度为5.8 nmo。
45、l/mL金纳米溶液， 立即震荡均匀并迅 速裹上锡纸避光孵育16小时； 接着加入9.1 L质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠 （SDS） 溶液， 使最终质量百分比浓度为0.1 %； 再加入101.6 L浓度为0.1mol/L pH 7.4 PBS 溶液， 使其最终浓度为10 mmol/L； 再加入53.5 L浓度为2 mol/L 的NaCl溶液， 使其最终浓 度为0.1mol/L。 在孵育24小时后使用高速离心机离心 （10000 转/分钟， 20分钟） ， 分散至含 0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中并重复清洗3次， 去掉上清液， 最后分 散。
46、0.5 mL至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中， 震荡均匀， 放置在4 的黑暗环境中得Au-RP1-barcode溶液。 0046 所 述的 信号 探针R P1 为 巯基修 饰的 DN A 序列 ， 其 碱基 序 列为 ： 5- SH- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTATACAAC-3 。 0047 （3） 磁珠标记捕获探针 （MB-CP1） 的制备： 量取1 mg磁珠置于离心管中， 经过磁性分 离， 弃去上清液， 然后用100 L TTL缓冲溶液清洗1次， 接着分散至200 L TTL缓冲溶液中， 然后往溶液中加入50 L浓度。
47、为10 mol/L捕获探针CP1， 在室温下轻微震荡孵育15分钟， 以 使生物素修饰的捕获探针CP1与链霉亲和素包被的磁珠MB轻缓而充分地结合， 最后使用100 L TT 缓冲溶液清洗2次， 磁性分离， 弃去上清液， 分散至500 L含0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中得浓度为10mg/mL的MB-CP1溶液。 0048 所 述的 捕获 探 针 C P1 为 修 饰 生 物素的 DN A 序 列 ， 其 碱 基 序 列为 ： 5- CTACTACCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-biotin-3 ； TTL缓冲溶液包含100 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为的0.1% Tween 20以及1mol/L LiCl ； TT 缓冲溶液包含250 mmol/L Tris-HCl、 pH 8.0， 体积百分比浓度为0.1% Tween 20。 0049 （4） 探针杂交以及条形码释放： 移取10 L步骤 （2） 中浓度为5.8 nmol/mL Au-RP1- barcode溶液、 10。