技术领域
本发明属于生物技术或植物学领域，具体涉及调节块根植物淀粉组成的物 质及调节方法。
背景技术
淀粉(starch)是高等植物、藻类和一些微生物细胞的贮藏物质，是无色无 臭的白色粉末，广泛存在于各种植物中，尤以种子(如米、麦、玉米)和块根(如 木薯、甘薯、马铃薯)含量丰富，可作为工业上制取淀粉的原料，例如可由玉 米、甘薯、马铃薯、野生橡子、葛根等含淀粉的物质中提取而得。淀粉除食用 外，工业上用于制糊精、麦芽糖、葡萄糖，也用于调制印花浆、纺织品的上浆、 纸张的上胶、药物片剂的压制等。
淀粉是由许多葡萄糖分子缩合而成的多糖，有直链和支链两种。直链淀粉 由α-1，4糖苷键连接的葡萄糖分子组成，呈线状链；支链淀粉在分支处有α-1， 6糖苷键连接，其直链部分也是α-1，4连接。一般的淀粉为直链及支链淀粉的 混合物，直链淀粉和支链淀粉在淀粉中所占的比例随植物的种类而异，在多数 含有淀粉的植物中，通常含有20～30％直链淀粉、70～80％支链淀粉。在哺乳 动物的消化道中，淀粉经淀粉酶、麦芽糖酶等作用，水解为葡萄糖，被吸收利 用。
目前，以植物块根(如木薯块根)为原料的淀粉加工业占据比例突出，但 各种产品的加工对原材料的淀粉品质(如直链淀粉和直链淀粉的含量比例)提 出了多样化的需求。依靠传统育种来改变淀粉品质，耗时长，需要大量人力物 力，难以满足淀粉加工业的急切需求。
本领域人员已经尝试通过调节淀粉合成的主要基因来调节植物中淀粉的 组成和含量，然而与淀粉合成相关的基因有多种，如何找到一种合适的靶基因 是值得深入研究的课题；此外，如何找到合适的方法来调节相关基因也是值得 深入研究的。
发明内容
本发明的目的在于提供块根植物淀粉组成的物质及调节方法。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸是颗粒 结合型淀粉合成酶I(GBSSI)基因的一部分，其长度是100-500bp；较佳的是 150-250bp；更佳的约180-210bp。
在另一优选例中，所述的多核苷酸是：
(a)如SEQ ID NO：1中第(1371±10)～(1570±10)位所示的核苷酸序列；
(b)与(a)限定的序列基本上互补的序列。
在另一优选例中，所述的多核苷酸是：如SEQ ID NO：1中第(1371±5)～ (1570±5)位所示的序列。
在另一优选例中，所述的多核苷酸是：如SEQ ID NO：1中第1371～1570 位所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备降低植物中 直链淀粉含量的构建物。
在本发明的第三方面，提供一种构建物，所述构建物含有式(I)所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式(I)，
式(I)中，
Seq正向为所述的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向基本上互补的多核苷酸；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，式(I)所示的结构在转入植物细胞后，形成式(II)所示的二 级结构：
式(II)，
式(II)中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
‖表示在Seq正向和Seq反向之间的基本上互补的关系。
在另一优选例中，所述的间隔序列本身不构成互补双链结构，其长度是在 50-90b(较佳的是60-85bp；更佳的是65-75bp)。
在另一优选例中，所述的间隔序列具有SEQ ID NO：2所示的序列。
在本发明的第四方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的构建物。
在另一优选例中，所述的载体是双元载体，含有与所述的构建物操作性相 连的启动子。较佳的所述的启动子是CaMV35S启动子(组成型启动子)和/或P54 启动子(木薯维管束特异表达启动子，可调控Glutamic acid-rich protein c54基 因表达，Genbank登录号：AY217353)。
在另一优选例中，所述的载体是pCAMBIA1300载体。
在本发明的第五方面，提供所述构建物的用途，用于导入到植物中，抑制 颗粒结合型淀粉合成酶I表达，从而抑制植物中直链淀粉的合成。
在另一优选例中，所述的植物是块根植物、块茎植物或种子植物；
在一优选例中，所述的植物选自(但不限于)：木薯、甘薯、马铃薯、山药、 芋头、葛根。
在本发明的第六方面，提供一种降低植物中直链淀粉含量的方法，所述方 法包括：将所述的构建物或所述的载体转染到植物中。
在另一优选例中，所述方法包括：
(1)提供携带所述的构建物或所述的载体的农杆菌；
(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述构建 物转入到植物细胞、组织或器官；和
(3)选择出转入所述构建物的植物细胞、组织或器官，再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1显示了本发明人构建的重组载体pC-35S-GBSSI-RNAi和 pC-P54-GBSSI-RNAi的部分图谱结构。
图2显示了RT-PCR分析转基因木薯中GBSSI基因的表达。以木薯c15基因为 内参，转基因品系中GBSSI的表达受到不同程度的抑制。其中，泳道M：Marker； 泳道WT：野生型木薯GBSSI的表达情况；泳道1-8：转基因不同株系木薯GBSSI 的表达情况。这些株系分别称为TG-1，TG-2，TG-3，TG-4，TG-5，TG-6，TG-7 和TG-8。
图3显示了野生型与转基因木薯TG-7株系碘染的差异显示转基因木薯的 淀粉组成发生改变，直链淀粉含量明显下降。其中，直链淀粉遇碘呈现深蓝色， 支链淀粉呈现棕红色。
图4显示了碘染淀粉粒表明淀粉粒的组成明显发生变化。其中，左边为野 生型木薯组织的碘染结果，呈现蓝黑色；右边为GBSSI-RNAi转基因木薯TG-7 株系组织的碘染结果，呈现红棕色。放大倍数：400倍光镜。
图5显示了作图法选择淀粉的测定波长。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，找到了一种可良好地调节块根植物淀粉组成的 新方法。通过在植物中形成小分子RNA来干扰颗粒结合型淀粉合成酶 I(Granule-Bound Starch Synthase I，GBSSI)，可有效地调节直连淀粉或支链淀粉 的生物合成水平，且获得的转基因植物遗传性状稳定。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的 物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多 肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其 他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的“操作性连接”或“操作性相连”或“可操作地连 接”可互换使用，指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。 例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列 的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“操作性连接”到该 核酸序列上。
如本文所用，所述的“植物”是指含有GBSSI基因的植物，通常是块根植 物或植物种子，所述的植物包括但不限于：薯类植物、块茎类植物、种子类植 物。例如所述植物可选自：木薯(Manihot esculenta)、甘薯(Ipomoea batatas)、 马铃薯(Solanum tuberosum)、山药(Dioscorea sp.)。更特别的，所述的植物是 木薯(Manihot esculenta)。
如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3-5 方向的序列(如5ATCG3→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5CGAT 3)。“基本上互补”是指两段核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预 见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上 互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少 有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一 步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如96％、98％、99％或100％。
如本文所用，“茎环”结构是指一种核酸构建物，其可形成一种包括双链 区域(茎部，含有本发明的多核苷酸)的二级结构，所述的双链区域由该构建物 的两个区域(位于同一条多聚核甘酸链上)形成，两个区域分列双链部分的两 侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。 即使该构建物的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状 态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形 成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在 可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域 技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后， 本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主 要由构成”、“基本上由构成”、和“由构成”；“主要由 构成”、“基本上由构成”和“由构成”属于“含有”、“具有”或 “包括”的下位概念。
本发明人针对多种淀粉合成涉及的主要基因进行了研究，研究发现抑制 GBSSI的表达可良好地调节植物中淀粉的组成，可非常有效地降低淀粉中直链 淀粉的含量，提高淀粉中支链淀粉的含量。所述的GBSSI基因的序列可与SEQ ID NO：1所示的序列基本上相同，SEQ ID NO：1中，第75-1901位为开放阅读 框(ORF)序列。
并且，本发明人在反复比较的基础上确定了一种对于干扰植物中GBSSI 表达异常有效的多核苷酸，其通过在导入植物后被植物细胞剪切或加工形成 小分子RNA而有效地干扰GBSSI的表达。目前已知的小分子干扰方式有以下几 种：miRNA调控的基因沉默，正义RNA引起的共抑制(Cosuppression)，反义 RNA抑制，病毒介导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)，发卡 式RNA(hairpinRNA，hpRNA)介导的基因沉默。植物中正义RNA，反义RNA 介导的基因沉默的效率比较低，成功转基因的报道很少见，microRNA对于植 物的调控机理研究所知更少，目前停留在基础研究阶段，利用miRNA进行转 基因的应用研究甚少。本发明人意外地发现，当用于干扰GBSSI表达时，采用 hpRNA技术与基于miRNA等原理的干扰方式相比，具有显著的优势，干扰效 果非常好。
因此，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸是颗粒结合型淀 粉合成酶I(GBSSI)编码基因的一部分，其长度是100-500bp；较佳的是 150-250bp；更佳的约180-210bp。所述的多核苷酸可用于制备降低植物中直链 淀粉含量的构建物。优选地，所述的多核苷酸具有：(a)如SEQ ID NO：1中第 (1371±10)～(1570±10)所示的核苷酸序列；或(b)与(a)限定的序列基本上互 补的序列；基于该多核苷酸设计的构建物在导入到植物细胞内后形成的小分子 RNA可特别有效地抑制植物细胞内GBSSI的表达。
所述的“(1371±10)～(1570±10)所示的核苷酸序列”指定了一系列的序列， 即“1371～1570位所示的核苷酸序列或其邻近序列”，所述序列可起始于SEQ ID NO：1中第1361位至第1381位中的任一位的碱基，终止于SEQ ID NO：1 中第1560至第1580位任一位的碱基。
根据本发明所提供的多核苷酸序列，可设计出在被导入植物中后可被植物 加工成干扰GBSSI表达的多核苷酸构建物，从而通过影响GBSSI表达调节植物 中淀粉的组成。因此，本发明提供了一种分离的或人工构建的多核苷酸构建 物，所述的多核苷酸构建物可被植物细胞转录且在细胞内表达成所述的小分 子RNA。作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式(I)所 示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式(I)，
式(I)中，Seq正向为本发明所述的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向基本上互补的 多核苷酸；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，并且间隔序列本身也不构成互补双链结构。
式(I)所示的结构在转入植物细胞后，形成式(II)所示的二级结构(“茎环” 结构)：
式(II)，
‖表示在Seq正向和Seq反向之间的基本上互补的关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种 载体，它含有所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复 制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需 的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术 等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、氨苄青霉素抗性。
作为本发明的优选方式，所述的载体是双元载体，含有与所述的构建物操 作性相连的双启动子。较佳的所述的双启动子是CaMV35S启动子(组成型启动 子)和P54启动子(维管束特异表达启动子)。较佳的，所述的载体是 pCAMBIA1300载体。
包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用 于转化适当的宿主。所述的宿主通常是含有GBSSI基因的植物细胞(较佳的 是木薯细胞)，或也可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载 体传递给植物细胞的细胞；优选的，所述的宿主为农杆菌。对于发生转化的 植物细胞、组织、或器官可以用本领域已知的常规方法再生成植株，从而获 得所需的转基因的植物。
本发明还涉及一种通过调节植物中淀粉组成(即降低直链淀粉的含量，提 高支链淀粉的含量)改良植物的方法，该方法包括：抑制(干扰)植物中GBSSI 基因的表达。优选地，基于本发明的多核苷酸来制备在导入植物细胞后可特异 性干扰GBSSI表达的多核苷酸构建物，将该构建物导入到植物细胞，从而调节 植物中淀粉的组成。
作为本发明的优选方式，一种制备直链淀粉含量低的植物的方法包括：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的导入植物细 胞后可特异性干扰GBSSI表达的多核苷酸构建物；
(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述构建 物转入植物细胞；
(3)选择出转入所述构建物的植物细胞、组织或器官，再生成植株。
所述植物细胞、组织或器官再生成植株后，该转基因植物中相应的GBSSI 基因的表达与野生型植物不同。
在本发明的具体实施方式中，改变了木薯中的GBSSI表达，从而有效地调 节了木薯中淀粉组成，得到了直链淀粉与支链淀粉含量比例变化的木薯转基因 新品种。木薯的淀粉组成是影响其应用的重要因素，常规木薯淀粉直链淀粉含 量在22％-32％之间，培育淀粉组成不同的木薯新品种可扩展木薯淀粉的应用范 围，特别在新材料开发方面。本发明人通过表达与木薯淀粉合成相关基因的小 分子RNA干扰了木薯储藏根中控制直链淀粉和支链淀粉合成的主要基因 GBSSI的表达，利用RT-PCR比较了转GBSSI-RNAi木薯中GBSSI基因的表达 量的变化及贮藏根碘染试验说明直链淀粉含量确实与野生型相比发生了较大 的变化。
定性或定量测定植物中淀粉的含量以及淀粉组成(即直链淀粉与支链淀粉 的含量或比例)的方法是本领域人员熟知的。一种经典的定性方法是颜色分析方 法，基于的原理是淀粉可与碘形成碘-淀粉复合物并具有特殊的颜色反应，直链 淀粉遇碘呈现深蓝色(或蓝黑色)，支链淀粉呈现棕红色。另外，还可采用双波 长比色法来定量地进行鉴定，该方法有相对更高的精密度。此外，在分子水平 上鉴定淀粉中直链和支链淀粉含量及比例，以及淀粉在工业生产中的各项指标 (如黏度，糊化温度等)的方法也是本领域已知的。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明基于小分子RNA干扰技术来干扰GBSSI基因的表达，从而达 到调节植物中淀粉组成的目的，且获得的转基因植物遗传性状稳定，为改变植 物淀粉品质提供了全新的可行的思路。
(2)可以在短时间内得到不同于野生型淀粉品质的新植株，克服了传统选 育技术耗时长、受偶然因素影响的缺陷。
(3)当用于食品工业时，淀粉中直链淀粉含量的降低有效地提高淀粉食品 的口感。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、载体构建
根据已公布的GBSSI基因序列(NCBI登录号：X74160)，获得GBSSI中适 当的区域(也即SEQ ID NO：1中第1371-1570位)，通过一个人工合成的内含子 (SEQ ID NO：2)作为间隔序列进行正反向连接，插入到CaMV35S(常规的组成 型启动子)或P54(木薯维管束特异表达启动子，Genbank登录号：AY217353， 采用起始密码子上游的1080bp序列(即-1～-1080位))启动子驱动的 pCAMBIA1300双元载体的EcoRI和XbaI位点中，分别获得重组载体 pC-35S-GBSSI-RNAi和pC-P54-GBSSI-RNAi(图1)，用于转化木薯制备转基因 植物。
所用的内含子序列为(SEQ ID NO：2)：
5-GTACTATAGTATTTTGGTACCTTTTACAATCGGTTTTTTTACCTTTT CTTCTTTATTTATTAAATTTATAG-3。
实施例2、转基因木薯、甘薯的制备与植株再生
将含有上述pC-35S-GBSSI-RNAi与pC-P54-GBSSI-RNAi的两种重组双 元载体的农杆菌分别转化木薯脆性愈伤，利用胚胎发生和器官发生途径再生 得到转基因植株。具体方法如下：
1.用灭菌牙签从平板上挑取含重组双元载体的农杆菌单一克隆，将其置于 抗性YEB培养基上，在28℃，240rpm下振荡培养过夜。
2.取25μl菌液，加到50ml新鲜的YEB培养基中，培养12-20小时至OD600为0.5-1.0。
3.6000rpm，4℃离心菌液10min，用50ml液体MS培养基(PH5.3)悬浮冲 洗，再离心一次。将菌液重悬于包含200μM乙酰丁香酮的液体MS培养基中， OD600为1.0。
4.吸取2ml破碎过滤的悬浮培养液到10ml农杆菌菌液中，共培养45min。 移走多余的菌液，将愈伤放到无菌滤纸上吸干残留菌液，置于包含100μm乙 酰丁香酮的SH固体培养基上，25℃共培养3天。
5.从滤纸上将转化的愈伤转移到30ml SH培养基中。
6.反复吸打清洗数次，倒掉培养基，反复清洗数次。
7.将愈伤转到含12.5mg/l潮霉素和500mg/l羧苄青霉素的SH培养基中， 137rpm，连续光照(约50μmol m-2s-1)培养3天。
8.将愈伤继代到含25mg/l潮霉素和500mg/l羧苄青霉素的SH培养基中， 108rpm，连续光照(约50μmol m-2s-1)培养，每3天继代一次。
9.2周后，抗性愈伤长出与未加筛选剂的对照同样的鲜黄的，脆性的胚性 愈伤。
10.将筛选了2-3周的悬浮培养的抗性愈伤转到包含10mg/l潮霉素的体细 胞胚胎发生固体培养基(MSN)上，26℃，16小时光照培养。
11.2-4周后，抗性胚愈伤形成，将抗性愈伤转移到包含12.5mg/l潮霉素的 胚成熟培养基(CMM)上培养，使其长出子叶胚。
12.将成熟胚转移到茎伸长培养基(CEM)上，2-4周后可以从子叶形胚发育 出新茎条。
13.将新茎段转移到MS基本培养基(CBM)上，3周后，切下1cm左右的 从侧芽长出的茎段转移到含8mg/l潮霉素的基本培养基(CBM)上观察根的生成， 使用未转基因的植株做阴性对照。
14.1周后观察根的生长情况，能生根的植株用于分子检测。
采用如上述同样的方法，还制备了甘薯转基因植物，并且经鉴定获得了转 基因阳性的植株。
实施例3、转基因植株检测
利用RT-PCR从分子水平检测转基因木薯中GBSSI基因表达的情况。用 TIANGEN公司的TRIZOL(DP421)试剂，从野生型和转基因的木薯离体苗叶片 中提取总RNA，以oligo(dT)为第一链引物，M-MLV逆转录酶(TIANGEN ER104-03)反转录成cDNA，以GBSSI，c15基因的各自特异性的引物进行双重 PCR扩增，得出结果。
结果见图2，表明8个转基因木薯株系中GBSSI基因的表达受到较大程度 的干扰。
同样，利用RT-PCR从分子水平可检测转基因甘薯中GBSSI基因表达的情 况，结果发现，转基因植株中GBSSI基因的表达受到极大干扰。
实施例4、木薯淀粉组成的变化
一.碘染色镜检
取野生型和转基因木薯TG-7株系的叶片、茎及储藏根分别进行1％碘液染 色。具体染色方法如下：
叶片：以75％乙醇脱色30分钟，蒸馏水冲洗一次，加入1毫升1％碘液， 染色过夜，除去碘液，蒸馏水冲洗多余碘液，镜检。
茎段，储藏根：将材料切成薄片，根据薄片大小，将适量碘液滴加至薄片 上，显色后，立即镜检。
结果见图3，证明转基因木薯中淀粉的组成发生显著变化。
二.双波长比色法测定木薯中淀粉的组成
采用双波长比色法测定木薯中淀粉的组成，根据双波长比色原理，如果溶 液中某溶质在两个波长下均有吸收，则两个波长的吸收差值与溶质浓度成正 比。直链淀粉与碘作用产生纯蓝色，支链淀粉与碘作用生成紫红色或红棕色。 用两种淀粉的标准溶液分别与碘反应，然后在同一个坐标系里进行扫描(400- 960mm)或做吸收曲线，得到图5所示结果。图中，1为直链淀粉的吸收曲线， 2为支链淀粉的吸收曲线。对含有直链淀粉和支链淀粉的未知样品，与碘显色 后，只要在选定的波长入λ1，λ2，λ3，λ4，处作4次比色，利用直链淀粉和支 链淀粉标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。
操作步骤：
1.选择直链、支链淀粉测定波长、参比波长
直链淀粉：取1mg/ml直链淀粉标准液1ml，放入50ml容量瓶中，加蒸 馏水30ml，以0.1mol/L HCl溶液调至pH3.5左右，加入碘试剂0.5ml， 并以蒸馏水定容。静置20min，以蒸馏水为空白，用双光束分光光度计进行可 见光全波段扫描或用普通比色法绘出直链淀粉吸收曲线。
支链淀粉：取1mg/ml支链淀粉标准液1ml，放入50ml容量瓶中，以 下操作同直链淀粉。在同一坐标内获得支链淀粉可见光波段吸收曲线。
根据原理部分介绍的方法，确定直链淀粉和支链淀粉的测定波长、参比波 长λ2、λ1、λ4和λ3。
2.制作双波长直链淀粉标准曲线
吸取1mg/ml直链淀粉标准溶液0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 ml分别放入6只不同的50ml容量瓶中，加入蒸馏水30ml，以0.1mol/L HCl溶液调至pH3.5左右，加入碘试剂0.5ml，并用蒸馏水定容。静置 20min，以蒸馏水为空白，用1cm比色杯在λ1、λ2两波长下分别测定Aλ1， Aλ2即得△A直＝Aλ2_Aλ1以△A直为纵坐标，直链淀粉含量(mg) 为横坐标，制备双波长直链淀粉标准曲线。
3.制作双波长支链淀粉标准曲线
吸取1mg/ml支链淀粉标准溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、 5.0ml分别放入6只不同的50ml容量瓶中。以下操作同直链淀粉。以蒸馏 水为空白，用1cm比色杯在λ3，λ4两波长下分别测定其Aλ3，Aλ4即得 △A支＝Aλ4-Aλ3。以△A支为纵坐标，支链淀粉含量(mg)为横坐标， 制备双波长支链淀粉标准曲线。
4.样品中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的测定
样品粉碎过60目筛，用乙醚脱脂，称取脱脂样品0.1g左右(精确至1 mg)，置于50ml容量瓶中。加0.5mol/L KOH溶液10ml，在沸水浴中加 热10min，取出，以蒸馏水定容至50ml若有泡沫采用乙醇消除)，静置。吸 取样品液2.5ml两份(即样品测定液和空白液)，均加蒸馏水30ml，以 0.1mol/LHCI溶液调至pH3.5左右，样品中加入碘试剂0.5ml，空白液不加 碘试剂，然后均定容至50ml。静置20min，以样品空白液为对照，用1cm比 色杯，分别测定λ2，λ1，λ4，λ3的吸收值Aλ2，Aλ1，Aλ4，Aλ3.得 到△A直＝Aλ2-Aλ1△A支＝Aλ4-Aλ3.分别查两类淀粉的双波长 标准曲线，即可计算出脱脂样品中直链淀粉和支链淀粉含量。二者之和等于 总淀粉含量。
结果处理，采用如下公式：
式中，
X1：查双波长直链淀粉标准曲线得样品液中直链淀粉含量(mg)；
X2：查双波长支链淀粉标准曲线得样品液中支链淀粉含量(mg)；
m：样品质量(g)；
总淀粉(％)＝直链淀粉(％)+支链淀粉(％)。
试剂配制如下：
碘试剂：称取碘化钾2.0g，溶于少量蒸馏水，再加碘0.2g，待溶解后用 蒸馏水稀释定容至100ml。
直链淀粉标准液：称取直链淀粉纯品0.1000g，放在100ml容量瓶中， 加入0.5mol/L KOH10ml，在热水中待溶解后，取出加蒸馏水定容至100ml， 即为1mg/ml直链淀粉标准溶液。
支链淀粉标准液：用0.1000g支链淀粉按同样方法制备成1mg/ml支链 淀粉标准溶液。
经测定，转基因木薯TG-7株系中直链淀粉的含量占淀粉总含量的1％，支 链淀粉的含量占淀粉总含量的99％。
用同样的方法检测转基因甘薯的淀粉含量，经测定，转基因甘薯株系中直 链淀粉的含量占淀粉总含量的2.5％，支链淀粉的含量占淀粉总含量的97.5％。
实施例5、转基因木薯淀粉粒碘染观察
对野生型和转基因木薯TG-7株系的淀粉粒进行碘染观察，方法如下：
1：提取木薯块根中提取淀粉：组织捣碎机研磨，100μm滤膜过滤，离心 收集沉淀，40℃烘两天即可。
2：取适量淀粉加入足量1％碘液显色，立即镜检。
结果如图4所示，证实转基因木薯株系储藏根中的淀粉粒直链淀粉含量明 显下降。
实施例6、SEQ ID NO：1中1371～1570位邻近片段的干扰能力
通过常规PCR方法，本发明人还获得了对应于SEQ ID NO：1中第 1367-1567位序列的核酸片段，如前述实施例1的方法，通过人工合成的内含 子(序列如SEQ ID NO：2)进行正反向连接，将该核酸构建物克隆入 pCAMBIA1300双元载体中P54/35S启动子后面使之与启动子可操作性连接， 并将重组载体转入到农杆菌中，转化木薯植物的愈伤组织。获得的转基因植 物在成熟后，如实施例4的方法检测其中直链淀粉和直链淀粉的组成，结果 发现直链淀粉的含量占淀粉总含量的2％以下，支链淀粉的含量占淀粉总含量 的98％以上。
通过常规PCR方法，本发明人还获得了对应于SEQ ID NO：1中第 1375-1573位序列的核酸片段，如前述实施例1的方法，通过人工合成的内含 子(序列如SEQ ID NO：2)进行正反向连接，将该核酸构建物克隆入 pCAMBIA1300双元载体中P54/35S启动子后面使之与启动子可操作性连接， 并将重组载体转入到农杆菌中，转化木薯植物的愈伤组织。获得的转基因植物 在成熟后，如实施例4的方法检测其中直链淀粉和直链淀粉的组成，结果发现 直链淀粉的含量占淀粉总含量的2％以下。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>调节块根植物淀粉组成的方法
<130>083966
<160>2
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>2168
<212>DNA
<213>木薯(Manihot esculenta Crantz)
<400>1
<210>2
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>寡核苷酸
<400>2