技术领域
本发明涉及对真菌病菌药剂生物测定技术领域，尤其涉及一种对稻曲病菌 进行药剂抑菌活性快速测定的新方法。
背景技术
稻曲病(Ustilaginoidea virens(cooke)Tak)是世界性真菌病害，属于 子囊菌纲麦角菌科，也被称为伪黑穗病、黑球病及表粉病，又因稻曲病往往在 水稻丰收年为害严重而被称为“丰收病”。近年来随着杂交粳稻等感病品种的推 广与土壤肥力水平的提高，致使稻曲病的发生面积及发病程度都有所上升，在某 些地区甚至造成严重的经济损失。生产上长期用于防治稻曲病的几种药剂，如 井冈霉素等均因抗药性增加而防效不很理想，而多菌铜等铜制剂也较易产生药 害。目前对防治该病的药剂研究尚不多见，为此，通过对该病菌的药剂生物测 定，即对供试药剂对稻曲病菌抑菌活性的快速测定，从中筛选出新型药剂及其有 效浓度，为防治该菌的有效单剂或复配剂的制备提供科学依据。
常规的对稻曲病菌等病原真菌进行药剂抑菌活性的测定方法有孢子萌发试 验法、生长速度测定法和琼脂水平扩散法等，其中，生长速度测定法，即平皿 抑菌法，是最为常用的一种杀菌剂的生物测定方法；其原理是在含有系列浓度 药剂的培养基平面上，在适宜生长的条件下培养一定时间内测定真菌菌落直径 的大小，以不混药为对照，求出药剂抑制病菌生长的速率，再将各处理的抑制 病菌生长速率换算成机率值，浓度换算成对数，求出EC50或ED50值。但该方法主 要适用于菌丝生长迅速，且整齐平伏于培养基平面呈放射状生长的病原真菌。 然而，稻曲病菌却是一种生长缓慢，在常用的真菌富营养平皿培养基如PSA、PDA 等，需要培养30天左右才能形成3-4cm左右的菌落；而且该菌菌丝生长 呈叠加堆积，形成“馒头状”菌落。因此，利用生长速度测定法对稻曲病菌这 种生长速度慢、非平伏于培养基平面的植物病原真菌进行药剂生物测定，往往 会产生误差；同时也由于培养时间的加长，大大增加了在生物测定过程中培养 基的污染概率，从而更加延长了相应的测定周期及测定成本；由此可见，该方 法不适用于对稻曲病菌抑菌活性的快速测定及新型杀菌单剂或复配剂的筛选。
发明内容
本发明目的，是针对常规生长速度测定法用于稻曲病菌药剂生物活性测定 时所存在的速度慢、周期长、污染重、误差大等问题，提供一种对稻曲病菌进 行药剂抑菌活性的快速、高效、准确的评价测定方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现。
一种对稻曲病菌进行药剂抑菌活性的测定方法，按以下步骤进行：
(1)培养基的制备：平皿培养采用YPPSA培养基(土豆150g，蔗糖10g， 酵母粉100mg，蛋白胨100mg，琼脂18g，pH值6.5，1000ml蒸馏水，121 ℃，高压灭菌而成)；液体培养采用YPPS培养液，在配制YPPSA培养基时删去琼脂， 即为液体培养的YPPS培养液；
(2)稻曲病菌菌株的活化培养：挑取少许保存的稻曲病菌菌丝块至步骤(1) YPPSA平皿培养基中，28℃恒温暗培养，活化菌株；
(3)稻曲病菌种子液的培养：挑取少许步骤(2)培养的稻曲病菌菌块(直 径3-5mm的菌饼)，接入盛有步骤(1)YPPS培养液的三角瓶中，28℃，150rpm， 振荡培养3-5天至菌液混浊，待用；
(4)待测药剂培养液的配制：将各供试药剂称量，每一重量药剂分别与一 等量盛入三角瓶中的步骤(1)YPPS的培养液相混合，配制成具有系列浓度的含药 培养液，每处理设置3-5次重复；
(5)稻曲病菌在药剂培养液内的培养与生长量的测定：在每一盛有等量步 骤(4)系列浓度含药培养液的三角瓶中，分别等量接入步骤(3)的稻曲病菌 种子液，28℃，150rpm，振荡培养7天；抽滤稻曲病菌培养物在滤纸上，70 ℃，10小时，烘干后，分析天平测定其干物质重量；
(6)稻曲病菌药剂抑菌活性的计算：以不加药为对照，分别计算不同药剂、 不同剂量对稻曲病菌干物质量积累的抑制率，用Finney机率值法，查机率值表换 算成相应机率值，浓度换算成对数，做回归，求出EC50或ED50值。
本发明的有益效果：一是本发明方法系根据稻曲病菌生长缓慢及菌丝生长 呈叠加堆积状的特性而设计，与常规的生长速度测定法(平皿抑菌法)相比， 改PSA、PDA等真菌富营养培养基为YPPSA培养基与YPPS培养液；改平面培养为 液体培养；改测平面菌落扩展速度为菌体干物质积累速率，从而真实反应了各 供试药剂及其各浓度对稻曲病菌的抑菌活性效率，缩小了测定误差；二是由于 液体培养使整个培养过程中药剂与菌体始终密切接触，明显提高了稻曲病菌对 药剂的敏感性(见表1)与测定准确性；三是显著加快了检测速度，由平皿抑菌 法的4-6周左右，缩短为本发明的2周即可完成测定过程；四是测定期的 缩短显著减少了培养基的污染概率，从而降低了测定成本。
具体实施方式
通过以下实施例将对本发明作进一步的详细说明，但这并不构成对本发明 的任何意义的限定。
供试材料：
20％三唑酮乳油：江苏建农农药化工有限公司生产，有效成份含量为20％；
45％咪酰胺微乳剂：深圳市诺普信农化有限公司生产，有效成份含量为 45％；
12.5％唏唑醇可湿性粉剂：江苏剑牌农药化工有限公司生产，有效成份含 量为12.5％；
稻曲病菌(Ustilaginoidea virens(cooke)Tak)：采用由浙江省农业科 学院植物保护与微生物研究所真菌病害室保存之菌种。
实施例1：(一种对稻曲病菌进行药剂抑菌活性的快速测定方法)
具体按以下步骤进行：
(1)培养基的配制：根据稻曲病菌在适用于真菌培养的培养基中生长速度 的快慢，筛选了本方法用于稻曲病菌药剂抑菌活性测定的YPPSA培养基。其中， 平皿培养的培养基(YPPSA)：为土豆150g，蔗糖10g，酵母粉100mg，蛋白 胨100mg，琼脂18g，pH值6.5，1000ml蒸馏水，121℃，高压灭菌而成； 液体培养的培养液(YPPS)：为土豆150g，蔗糖10g，酵母粉100mg，蛋白 胨100mg，pH值6.5，1000ml蒸馏水，50ml分装，121℃，高压灭菌而成；
(2)稻曲病菌株的活化培养：挑取保存的稻曲病菌少许菌丝块至YPPSA平 皿培养基中，28℃恒温暗培养，活化菌株；
(3)稻曲病菌种子液的培养：取在平板YPPSA培养基上新鲜活化的稻曲病 菌菌落，用打孔器切取3-5mm菌块，接入盛有50ml YPPS培养液的100ml 三角瓶中，28℃，150rpm，振荡培养3-5天，至菌液混浊，制成稻曲病菌种 子液，待用；
(4)待测药剂培养液的配制：以20％三唑酮乳油、45％咪酰胺微乳油和 12.5％唏唑醇可湿性粉剂为待测药剂，各药剂按系列浓度的设计逐一称量， 每一重量药剂分别与一等量盛入三角瓶中的步骤(1)50ml YPPS培养液相混合， 三种药剂分别配制成从低到高系列浓度(至少5个浓度)的含药培养液，其中， 20％三唑酮乳油的浓度梯度为1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL； 45％咪酰胺微乳剂的浓度梯度为50μg/L、75μg/L、100μg/L、150μg/L、250μg/L； 12.5％唏唑醇可湿性粉剂的浓度梯度为50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L、 250μg/L；并以不加药为对照，每处理4次重复；
(5)稻曲病菌在药剂培养液内的培养与生长量的测定：在每只盛有步骤(4) 药剂系列浓度培养液之一的三角瓶中，分别接入步骤(3)稻曲病菌种子液0.5ml， 28℃，150rpm，振荡培养7天；再抽滤稻曲病菌培养物在滤纸上，70℃， 10小时，烘干后，在分析天平上测定其干物质重量；
(6)稻曲病菌药剂抑菌活性的计算：以不加药为对照，分别计算不同药剂 与不同剂量对稻曲病菌干物质量积累的抑制率；用Finney机率值法，查机率值 表换算成相应机率值，浓度换算成对数，做回归，求出EC50或ED50值。
试验例：(稻曲病菌药剂抑菌活性不同测定方法的效果对比试验)
1、本发明与常规平皿抑菌法进行对比试验，均以20％三唑酮乳油、45％咪 酰胺微乳油和12.5％唏唑醇可湿性粉剂为供试药剂，均以空白为对照。
2、本发明方案具体步骤参照实验例1；常规平皿抑菌法方案具体参照陈年 春主编的《农药生物测定技术》(1991年，北京农业大学出版社)。
3、试验结果：
1)采用本发明方法约在2周内即可完成测定过程，而平皿抑菌法需在4- 6周左右才能完成；
2)本方法与平皿抑菌法都能明确供试药剂对稻曲病菌抑菌活性的效果排序 为：45％咪酰胺微乳剂＞12.5％唏唑醇可湿性粉剂＞20％三唑酮乳油；
3)根据EC50值显示，两方法测定的抑菌效果有较大差异，本发明各供试药 剂对稻曲病菌抑菌活性明显高于平皿抑菌法(表1)，显著提高了稻曲病菌对药 剂的敏感性，也即提高了药剂生物测定的准确性。
表1本发明方法与平皿抑制法进行稻曲病菌药剂生物测定效果比较 药剂 测定方法 回归方程 回归系 数 EC50 三唑酮 咪酰胺 唏唑醇 本发明方法 平皿抑制法 本发明方法 平皿抑制法 本发明方法 平皿抑制法 y＝1.5575x+4.2862 y＝1.612x+3.4189 y＝1.9815x+1.1012 y＝1.111x+2.1643 y＝2.773x-0.733 y＝2.2566x-0.9894 0.906 0.932 0.998 0.958 0.981 0.915 2.87μg/mL 9.57μg/mL 92.81μg/L 356.77μg/L 116.80μg/L 450.99μg/L