发明领域
本发明涉及用于促进皮肤增白的方法，该方法使用包括类胡萝卜素八 氢番茄红素(phytoene)和六氢番茄红素(phytofluene)以及任选地，另外 的类胡萝卜素，尤其是无高浓色(highly intense color)的类胡萝卜素的组 合物。
发明背景
肤色主要由存在于黑色素细胞中的黑色素的量来确定，黑色素细胞是 存在于皮肤的表皮基层内的细胞。黑色素的生成发生在黑色素细胞内的独 特的细胞器(称为黑素体)中，并保护皮肤免受UV光的有害影响。某些 种族的较深的皮肤色调源于黑色素生成量的自然增大，且高的生成量响应 UV光的刺激导致众所周知的皮肤的晒黑效果。老化、阳光照射、荷尔蒙 异常以及各种皮肤疾病增大了皮肤内黑色素的沉积，从而导致黑斑和雀 斑。在许多种族看来，这种黑斑不但被认为是不美的，而且还被认为是不 健康的且因此是不希望有的。
对那些有兴趣消除皮肤上存在的黑斑或想要更浅的皮肤色调的人来 说，增白组合物或漂白组合物是有用的。许多现代的皮肤漂白组合物或者 破坏黑色素(通常通过破坏黑色素微粒或使其破裂)、抑制黑色素形成(通 常通过抑制酪氨酸酶(一种黑色素生物合成酶)或通过抑制黑色素细胞活 性和增殖)，或者以两种方式进行。这些漂白组合物中的许多种含有对身 体不适宜的化学品，如过氧化物、酸或甲醛，或硫醇化物质如谷胱甘肽、 半胱氨酸、巯基琥珀酸、巯基右旋糖苷和巯基乙醇。这些化学品除了对皮 肤具有紧致效果之外，也存在令人不悦的气味，这使得含有它们的产品不 受消费者欢迎。
较不紧致的疗法存在其他不足之处。例如，因为氢醌通过抑制黑色素 细胞活性而起作用，所以被用作增白剂。然而，氢醌会被空气、光以及自 身的酪氨酸酶氧化。氢醌的氧化产物与皮肤刺激和发炎(以及可能的细胞 毒性)以及色素沉着回弹(即，开始变浅，后来又变深)有牵连。此外， 由于这些氧化过程，含有氢醌的制剂的适用期以及其使用时的生物利用度 都是相对短的。
化妆品制剂中常用的增白剂是曲酸、熊果苷、甘草提取物和维生素C。 这些都是有效的酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂，但通常都是不稳定的，因为 它们易于被氧化和降解。
欧洲专利第EP0467795号公开了用于将活性分子输送过细胞膜的少层 微泡脂质体载体(paucilamellar liposomal carriers)的用途，包括由于酶活 性转移导致形成的黑素体减少的分子，从而造成黑色素降解酶的活化过 度。此专利还公开了基于这些载体的皮肤病组合物或化妆品组合物和它们 在消除或缓解皮肤色变(dyschromia)以及治疗因日光照射引起的黑色素 瘤方面的用途。
最近，已经提议使用源自天然的材料，使用这些材料更使人愉悦，其 中在过去的疗法中已经知道一些材料具有增白效果。这些疗法包括使用柠 檬、橙子、黄瓜、银杏(ginko)、长豆角、玫瑰果实、老鹳草、桂皮、甜 马郁兰、迷迭香、丁香、桑葚、甘草、熊果以及针叶樱桃提取物，单独使 用或与其他增白剂一起使用(例如，参见美国专利第5,747,006；5,980,904； 6,994,874以及7,029,709号以及其他专利)。这些天然产物中的活性成分的 易变性有时限制了它们的实用性，尤其是不同的受实验者的皮肤类型、颜 色、年龄和状态变化非常大时，使得所建议的剂量和方式难以形成。
包括具有增白效果的类胡萝卜素的化妆品组合物也已经被公开了。日 本专利第JP2004300117号公开了一种包括类胡萝卜素和苹果属植物的提 取物，尤其是果实或果汁提取物的化妆品组合物，其中提取物优选含有多 酚且类胡萝卜素优选含有番茄红素。
日本专利第6279257号公开了属于大戟科类的、对黑色素生物合成具 有抑制活性的类胡萝卜素或佛肚树的氯仿提取物以及用于美容和增白皮 肤的包括它们的化妆品组合物。
然而，含有类胡萝卜素的组合物通常是浓色的，这是由于β-胡萝卜 素和番茄红素的橙红色。β-胡萝卜素和番茄红素对光和氧化敏感，此性 质明显限制了它们的用途并缩短了含有其的产品的适用期(在此文献中： Carotenoids，Chemistry and Biology，Krinski，N.I.，MAtthews-Roth， M.M.，Taylor，R.F.编辑，Plenum Press，New York，London，1989)。此外，β- 胡萝卜素和番茄红素具有与众不同的橙色且此颜色在各种化妆品应用或 营养制剂应用中的有效使用浓度具有严格的限制。而且，当包括类似番茄 红素、β-胡萝卜素、鸡油菌素以及类似物的有色的类胡萝卜素的组合物 被局部施用时，且此外当口服时已知使皮肤着色，如例如美国专利第 6,110,478号所公开的。这种组合物用于实现皮肤的晒黑效果且基于此目的 的商品可以在市场上获得。
因而，认识到需要有害副作用最少的可选择的、有效的类胡萝卜素制 剂，而且这也是非常有益的，此制剂有增白皮肤的功效且适于局部形式以 及口服形式的化妆品业。
发明概述
本发明提供了用于增白皮肤的方法，以及用于增白皮肤的包括类胡萝 卜素的组合物和相关的化妆品应用。特别地，本发明的组合物包括有效增 白皮肤的类胡萝卜素的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合以及一种或 多种另外的类胡萝卜素，该组合物不包括浓度高于八氢番茄红素和六氢番 茄红素的组合总量的浓度的浓色类胡萝卜素。
本发明的方法和组合物用于使肤色变浅、使皮肤色调和/或肤色均匀或 一致、减少色素沉着、减少UV照射后的色素沉着、减少太阳斑(老年斑) 或斑点(ephilide)(雀斑)的出现、减少黑斑(melasma)、减少黄褐斑、 减少炎症后的色素沉着过度以及减少有色的角质物。
本发明部分基于意外发现了类胡萝卜素的八氢番茄红素和六氢番茄 红素在控制黑色素生成方面是有效的。本发明的一些发明人先前已经表明 八氢番茄红素和六氢番茄红素具有抗氧化性的特性且能够吸收紫外(UV) 光，因此，尤其在防止因UV光照射和氧化过程而导致的皮肤损伤方面是 有效的。本发明现在公开了八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合通过减少 皮肤细胞内的黑色素含量而对皮肤色素沉着具有直接的影响，这是令人惊 奇的。
本发明的教导相比先前已知的用于增白皮肤的组合物和方法是有优 势的，因为八氢番茄红素和六氢番茄红素是天然的类胡萝卜素，已知天然 的类胡萝卜素当涂敷到皮肤或当口服时并不会造成任何有害影响，同时依 然非常有效。与已知的增白皮肤的成分，如对苯二酚葡糖苷相比，八氢番 茄红素和六氢番茄红素的组合现在已显示出对B16黑色素瘤细胞的黑色素 形成具有至少等同的抑制活性。
意想不到的是，局部给药，或者以口服方式来施用本发明的类胡萝卜 素组合物不但不会造成当施用浓色类胡萝卜素组合物时经常碰到的皮肤 由黄色变成橙色的现象，而且本发明现在公开了这些组合物在增白皮肤方 面是有效的。虽然并不希望受到任何具体的机理或理论的束缚，但是本发 明组合物的增白效果是由于减少了皮肤内的黑色素的含量，这是八氢番茄 红素和六氢番茄红素活性减少了黑色素的合成、增强了黑色素降解或降低 了皮肤内的黑色素细胞的增殖率的结果。
因而，根据一个方面，本发明提供了一种用于促进皮肤增白的方法， 其包括将包含有效增白皮肤的量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合 的组合物施用至对其需要的受实验者。
来自任何可利用的来源的八氢番茄红素和六氢番茄红素可以根据本 发明的方法被使用，包括从天然来源中提取、通过化学合成制备或从遗传 修饰来源重新利用的八氢番茄红素和六氢番茄红素。
根据某些实施方案，本发明的方法采用了包括除八氢番茄红素和六氢 番茄红素之外的至少一种另外的类胡萝卜素的组合物。根据一个实施方 案，另外的类胡萝卜素选自由ζ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、玉 米黄素、虾青素、鸡油菌素(cataxanthin)、玉米黄素、叶黄素、角黄素及 类似物、以及其任意组合组成的组。根据另一个实施方案，八氢番茄红素 和六氢番茄红素的组合对其他类胡萝卜素之比是约1:1至约50:1，可选 择地，约2:1至约25:1，仍是可选择地，约4:1至约10:1。根据一 个实施方案，除八氢番茄红素和六氢番茄红素之外的类胡萝卜素是ζ-胡 罗卜素。
根据某些实施方案，与本发明的方法一起使用的组合物无浓色。根据 其他实施方案，组合物基本上是无色的。
根据进一步的实施方案，组合物进一步包括选自由下述物质，但不限 于，抗氧化剂、抗炎剂、增湿剂、维生素、UV吸收剂、UV保护剂、IBR (水仙球提取物(Narcissus tazetta bulb extract)，美国专利第 6,342,254号)、皮肤增白剂或其任意组合组成的组中的至少一种活性成分。
根据某些实施方案，除八氢番茄红素和六氢番茄红素外的活性成分选 自由欧米伽油(omega oil)、和维生素C组成的组。
当包括八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合与任选的ζ-胡罗卜素的 组合物局部施用到皮肤，以及当该组合物口服施用时，可以获得八氢番茄 红素和六氢番茄红素的组合与任选的ζ-胡罗卜素的增白效果。
根据本发明方法的增白组合物的施用方式和应用模式将取决于与待 治疗的现象有关的参数以及待治疗的个体的特征(年龄、身高、性别等)。 根据某些实施方案，本发明的方法包括以选自每周至少一次至高达每天至 少两次的方式局部施用至皮肤。根据其他实施方案，本发明的方法包括以 选自每周至少一次至高达每天至少两次的方式将增白的类胡萝卜素组合 物口服施用。根据其他实施方案，将口服组合物和局部组合物共同施用至 受实验者。
根据另一个方面，本发明提供了包括有效增白皮肤的量的八氢番茄红 素和六氢番茄红素的组合与至少一种另外的类胡萝卜素的组合物，其中另 外的类胡萝卜素的浓度至多等于八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合总 量的浓度。根据某些实施方案，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合对另 外的类胡萝卜素之比是约1:1至约50:1，可选择地，约2:1至约25: 1，仍是可选择地，约4:1至约10:1。可以存在于组合物中的除八氢番 茄红素和六氢番茄红素之外的类胡萝卜素选自由ζ-胡萝卜素、β-胡萝卜 素、番茄红素、玉米黄素、虾青素、鸡油菌素、玉米黄素、叶黄素、角黄 素及类似物、以及其任意组合组成的组。
根据某些实施方案，组合物中除八氢番茄红素和六氢番茄红素之外还 包括ζ-胡萝卜素。
本发明组合物中的类胡萝卜素，尤其是八氢番茄红素、六氢番茄红素 和ζ-胡萝卜素可以由任何可利用的来源获得，来源包括，但不限于，从 天然来源制备、通过化学合成制备或从遗传修饰来源重新利用。
根据某些实施方案，类胡萝卜素八氢番茄红素、六氢番茄红素和另外 的类胡萝卜素，尤其是ζ-胡萝卜素中的每一种都是由天然来源获得。根 据一个实施方案，类胡萝卜素是由相同的天然来源获得。
根据一个实施方案，八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素都 是由番茄水果获得。根据一个实施方案，八氢番茄红素、六氢番茄红素、 ζ-胡萝卜素或其组合存在于油溶性番茄提取物中。根据另一个实施方案， 这些类胡萝卜素的每一种或其组合存在于番茄水果的干物质中。根据某些 实施方案，油溶性番茄提取物或番茄水果的干物质基本上无番茄红素和β -胡萝卜素。
根据另一个实施方案，本发明的组合物包括源自藻类的八氢番茄红 素、六氢番茄红素和任选的ζ-胡萝卜素。根据一个实施方案，藻类属于 杜氏藻属物种。根据一个实施方案，八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡 萝卜素或其任意组合存在于油溶性杜氏藻属提取物中。根据另一个实施方 案，这些类胡萝卜素的每一种或其组合存在于杜氏藻属的干物质中。根据 某些实施方案，油溶性杜氏藻属提取物或杜氏藻属干物质基本上无β-胡 萝卜素。
根据又一个实施方案，存在于本发明的组合物中的类胡萝卜素八氢番 茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素的每一种源自于微生物。
本发明的类胡萝卜素组合物可以呈本领域已知的任何形式，包括溶 液、悬浮液、脱水粉料、胶囊、片剂、乳膏(creams)、软膏以及类似物。 根据某些实施方案，本发明的组合物呈非水溶液的形式。根据其他实施方 案，组合物呈脱水粉料的形式。
根据某些实施方案，本发明的组合物是配制用于局部施用的化妆品组 合物。任选地，组合物进一步包括化妆品上可接受的稀释剂或载体。根据 某些实施方案，组合物包括选自，但不限于由角鲨烷、聚癸烯、角鲨烯、 霍霍巴油(jojoba oil)、向日葵油以及类似物组成的组中的稀释剂。根据一 个实施方案，稀释剂是角鲨烷，通常是源自天然的角鲨烷。
根据某些其他实施方案，化妆品组合物进一步包括选自由防腐剂、增 稠剂、分散剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲剂、鳌合剂、着色剂、香料或 其任意组合组成的组中的至少一种试剂。
根据其他实施方案，组合物进一步包括选自由抗氧化剂、抗炎剂、增 湿剂、维生素、UV吸收剂、UV保护剂或其任意组合组成的组中的至少一 种活性成分。
根据另外的某些实施方案，本发明的组合物被配制用于口服施用。
根据一个实施方案，组合物进一步包括适合于口服消耗的赋形剂、稀 释剂或载体。根据另一个实施方案，以选自由胶囊、糖丸、丸剂、片剂、 凝胶、液体、浆状物、悬浮液和糖浆组成的组中的形式配制组合物。
从下面的描述和附图，本发明的其他目的、特征和优势将会变得清晰 可见。
附图简述
图1显示了化合物IBR-和参照化合物对B16小鼠黑色素瘤细 胞的黑色素合成的影响。
图2显示了化合物IBR-和参照化合物对由正常人黑色素细胞 (NHEM)的黑色素合成的影响。
本发明的详细描述
本发明第一次公开了类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素的组 合在增白皮肤方面是非常有效的，且对皮肤没有任何有害影响。因而，本 发明提供了使用这样的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合来增白皮肤 的方法。本发明还提供了用于化妆品应用的包括八氢番茄红素、六氢番茄 红素和至少一种另外的类胡萝卜素的类胡萝卜素组合物。八氢番茄红素和 六氢番茄红素的组合是本发明组合物的主要成分，以使另外的类胡萝卜素 的浓度至多等于八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的浓度。
定义
正如这里使用的，术语“八氢番茄红素”指7，7’，8，8’，11，11’，12，12’-八 氢-ψ-ψ-胡罗卜素。
正如这里使用的，术语“六氢番茄红素”指15Z，7，8，11，12，7’，8’-六氢 -ψ-ψ-胡罗卜素。
正如这里使用的，术语“ζ-胡萝卜素”指7，7’，8，8’-四氢-ψ-ψ-胡 罗卜素。八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素都是类胡萝卜素(C -40类异戊二烯链)，其是生物合成路线的前体，导致了β-胡萝卜素、番 茄红素和其他类胡萝卜素(八氢番茄红素是第一特定类胡萝卜素的前体， 且六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素都在随后的去饱和步骤中从其制造)的生 成。八氢番茄红素是完全无色的，而六氢番茄红素是浅黄色。ζ-胡萝卜素 是第一种可见的类胡萝卜素。
正如这里使用的，术语“增白效果”意指缓解或消除或防止由各种成 因因素产生的肤色暗沉、黑斑、黄褐斑、太阳斑、斑点以及类似物的效果， 这些因素包括，但不限于，紫外线照射、荷尔蒙平衡的变化和遗传程序 (genetic program)。一般而言，且不希望受到特定机理或理论的束缚，已 经发现黑色素细胞受到，如紫外线照射以及荷尔蒙平衡的任何变化的刺 激。黑色素细胞内合成的黑色素沉积在皮肤上且因而造成上述皮肤暗沉现 象。
正如这里使用的，术语“有效增白皮肤的量”指当一起施用时获得期 望的增白效果的八氢番茄红素的量和六氢番茄红素的量。
正如这里使用的，术语“质量％”指基于重量/重量百分比的浓度。
根据一个方面，本发明提供了一种用于促进皮肤增白的方法，其包括 将包含有效增白皮肤的量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合的组合 物施用到对其需要的受实验者。
对全世界的人来说，都非常期望拥有好的皮肤，且一些民众，尤其是 远东的民众认为白皮肤是优选的。通常，人类皮肤的颜色根据皮肤内黑色 素的浓度和分布由遗传确定，但其还可以受诸如太阳紫外线、荷尔蒙变化、 疲劳和压力等环境条件或生理状态的影响。在酶酪氨酸酶作用于氨基酸酪 氨酸，从而将后者变成多巴和多巴醌之后，通过非酶氧化反应在黑色素细 胞内生成黑色素。不希望有的皮肤色素沉着通常是由于日光中的UV线和/ 或异常的荷尔蒙平衡活化黑色素细胞的缘故。
令人惊奇的是，本发明现在显示出八氢番茄红素和六氢番茄红素的组 合在皮肤增白方面是非常有效的。
正如在下文中举例说明的，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合在减 少黑色素细胞内的黑色素含量方面是非常有效的，与曲酸具有至少等同的 效果，曲酸是已知对黑色素合成具有抑制活性的化合物。而且，根据本发 明的教导检验的包括八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合物已经显示出 不具有细胞毒性；因而，可以按比现有的增白化合物，如熊果苷的量更大 的量来将它们施用到皮肤，已知熊果苷被施用某一水平之上时，其具有有 害的副作用。因此，本发明组合物的总增白活性预期比至今已知的增白剂 具有明显的优势。
应该理解，根据本发明的教导，可以使用包括八氢番茄红素和六氢番 茄红素的组合的任意组合物，条件是组合的量在增白皮肤方面是有效的， 且组合物对皮肤，尤其是对肤色没有任何有害影响。
本发明的一些发明人和合作者先前已经公开了包括八氢番茄红素和 六氢番茄红素的无色组合物(国际专利申请公布WO 00/13654)。根据本发 明的方法，此处公开的组合物以及上面定义的和本领域已知的其他组合物 可以用于增白皮肤。
根据另一个方面，本发明提供了包括有效增白皮肤的量的八氢番茄红 素和六氢番茄红素的组合以及至少一种另外的类胡萝卜素的组合物，其中 另外的类胡萝卜素的浓度至多等于八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合 总量的浓度。
本发明组合物中的八氢番茄红素和六氢番茄红素的每一种可以呈其 反式或其顺式的形式。
本发明组合物中的八氢番茄红素与六氢番茄红素之间的重量比可以 分别在200:1至1:200之间的范围，通常在约50:1至1:50之间的范 围，优选10:1至1:10之间的范围，10:1(八氢番茄红素:六氢番茄 红素)是特定的实施例。上述八氢番茄红素对六氢番茄红素之比可以通过 使用利用了具有期望的八氢番茄红素对六氢番茄红素之比的生物体的制 剂、使用含有期望比的两种类胡萝卜素的提取物、通过将额外量的其中一 种类胡萝卜素添加至包含两种类胡萝卜素的提取物中以使得获得期望比、 或通过混合两种单独的类胡萝卜素(通过此处描述的或本领域已知的任意 一种方法来获得每一种类胡萝卜素)以达到它们之间期望比来达到。
可以存在于组合物中的除八氢番茄红素和六氢番茄红素之外的类胡 萝卜素选自由ζ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄素、虾青素、 鸡油菌素、玉米黄素、叶黄素、角黄素及类似物、以及其任意组合组成的 组。
根据某些实施方案，本发明的组合物无浓色。本发明组合物的主要活 性成分是八氢番茄红素和六氢番茄红素，前者是无色的类胡萝卜素，而后 者具有浅黄色。因而，通过选择来自具有浅色的类胡萝卜素的另外的类胡 萝卜素或通过减少组合物中有色的类胡萝卜素的浓度来获得浅色的组合 物。
根据某些实施方案，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合总量的浓度 对另外的类胡萝卜素的浓度之比是约1:1至约50:1，可选择地，约2: 1至约25:1，仍是可选择地，约4:1至约10:1。
根据某些实施方案，另外的类胡萝卜素是ζ-胡萝卜素。ζ-胡萝卜素 是包括β-胡萝卜素和番茄红素的有色的类胡萝卜素的生物合成路线中的 第一种可见成分(visible component)。
根据目前优选的实施方案，组合物具有黄色到浅橙色。根据一个实施 方案，组合物具有浅黄色。
组合物中的类胡萝卜素的浓度可以通过本领域技术人员已知的任何 方法来测量。通常，类胡萝卜素的浓度通过高效液相色谱(HPLC)法或 通过分光光度计来测量。
共轭双键系统构成了赋予类胡萝卜素自身颜色并提供其吸收光谱的 光吸收发色团，吸收光谱起到用于其确认和定量的基础。因而，紫外(UV) 光谱和可见光谱是用于类胡萝卜素的确认以及还有定量的第一分析工具。 最大吸收波长(λmax)和光谱形状(光谱精细结构)是发色团的特征。类 胡萝卜素中的共轭双键的数目越大，最大吸收值越高。因而，具有11个共 轭双键的最不饱和的无环类胡萝卜素番茄红素具有浓红色，且其以最长的 波长吸收(λmax在444nm、470nm和502nm处，通常在450nm的平均 值处测量)。对具有可察觉颜色的类胡萝卜素需要至少7个共轭双键；因 而，ζ-胡萝卜素是浅黄色。还是无环的，其光谱具有三个明确的峰，但这 些峰是在远小于番茄红素的波长的波长处(λmax在378nm、400nm和425 nm处，通常在400nm的平均值处测量)，相当于其7个共轭双键。八氢 番茄红素(具有3个共轭双键)和六氢番茄红素(具有5个共轭双键)是 无色的，且六氢番茄红素有时候显示浅黄色。八氢番茄红素在276nm、286 nm和297nm处吸收最大(通常在286nm的平均值处测量)，而六氢番茄 红素在331nm、348nm和367nm处吸收最大(通常在348nm的平均值 处测量)。
类胡萝卜素的吸收光谱是明显依赖溶剂的，且用于计算某些类胡萝卜 素的浓度时的类胡萝卜素的吸光系数(在具有1cm光程的分光光度计的比 色皿中，在1％溶液的给定波长时的吸光度)在不同的溶剂中显著变化。 在分析某种组合物中的类胡萝卜素时，尤其是当通过在分离过程中可能使 用不同的溶剂的HPLC进行分析时，这必须被记住。
具有无浓色的类胡萝卜素组合物的优势在于类胡萝卜素对组合物的 美观性或者施用后，即当组合物被局部施用至皮肤时或口服施用时，对肤 色将没有强烈的影响。此外，在可见区内光的最小吸光度赋予组合物在可 见光下的降解稳定性，且因而提高了其被局部施用至皮肤时的生物利用度 以及其适用期。
使用在本发明组合物中的类胡萝卜素可以从任何可利用的来源获得。 它们可以从天然来源提取、可以化学合成或可以通过分子遗传学的方法获 得。通常，类胡萝卜素可以从产生类胡萝卜素的生物体获得，这些生物体 包括各种植物、各种藻类以及某些微生物，包括遗传修饰生物体。每一种 类胡萝卜素可以从不同的来源提取，或者可以从相同的来源获得八氢番茄 红素、六氢番茄红素和另外的类胡萝卜素，可能的ζ-胡萝卜素。
根据某些实施方案，八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其 任意组合可以源自于番茄果实中。番茄果实的特征通常是，与八氢番茄红 素或六氢番茄红素的浓度相比，存在高浓度的番茄红素。根据某些实施方 案，从番茄果实提取类胡萝卜素的过程包括将期望的类胡萝卜素八氢番茄 红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素与其他任何类胡萝卜素分离的步骤。 根据其他实施方案，本发明利用了具有除八氢番茄红素、六氢番茄红素和 ζ-胡萝卜素之外的低量或不能检测到的量的类胡萝卜素的番茄品种。
根据其他实施方案，八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其 任意组合源自于藻类，且优选杜氏藻属物种的藻类。
从生物体或其任何部分提取类胡萝卜素可以通过本领域技术人员已 知的任何方法来进行。根据某些实施方案，生物体或其部分被浸没在溶液 中，以从生物体中将油溶性成分提取到溶剂中。在应用预处理之后，可以 进行提取。例如，当来源是番茄果实时，预处理包括碾碎和/或使果实均匀 化。通过加热和/或搅拌来源-溶剂混合物可以加快提取过程。在去除非提 取的残渣后，可以去除溶剂。提取溶剂的示例包括低级一元醇，如甲醇、 乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇和2-丁醇；低级烷基酯，如乙酸乙酯； 烃，如苯、己烷和戊烷；酮，如丙酮和丁酮；油，如角鲨烷、液体石蜡、 聚癸烯；醚，如二乙醚、四氢呋喃和二丙醚；以及乙腈。可以使用一种溶 剂以及不同溶剂的组合，这对本领域技术人员是已知的。根据某些实施方 案，溶剂是己烷、乙醇、乙酸乙酯或其任意组合。
随后，提取物可以被进一步纯化，如通过分子量分级(molecular weight fractionation)、溶剂分馏，通过用诸如离子交换树脂或吸收树脂的任何树 脂以及类似物来纯化油溶性提取物。根据某些实施方案，除去提取溶剂， 以及将油溶性类胡萝卜素制剂与适于化妆品或适于口服消耗的稀释剂混 合。这种稀释剂可以是液体以获得液体制剂，或者是固体以获得固体制剂。 用于提取八氢番茄红素和六氢番茄红素的实施例描述在属于本发明的一 些发明人和合作者的美国专利第6,383,474号中，该专利在此以引用方式 以其整体并入。
根据其他实施方案，类胡萝卜素八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡 萝卜素或其任意组合并不从生物体中提取。因而，根据某些实施方案，本 发明的类胡萝卜素组合物呈粉料的形式，通过将完整的生物体或其部分脱 水来获得。可以被脱水以提供本发明组合物的生物体或其部分包括，如番 茄果实、藻类和真菌。
除了从天然来源中获得八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素 之外，这些类胡萝卜素还可以通过任何已知的化学或生物化学方法或通过 从遗传修饰来源中重新利用这些类胡萝卜素来合成。八氢番茄红素可以通 过化学方法被合成，如在可以被八氢番茄红素合成酶介导的一种反应中 由两种香叶基香叶基焦磷酸酯(C-20)来合成。香叶基香叶基焦磷酸酯 可以通过甲羟戊酸的转化或通过丙酮酸酯与甘油醛-3-磷酸酯的缩合而 直接获得。六氢番茄红素可以通过八氢番茄红素的去饱和来合成，此去饱 和是可以通过八氢番茄红素去饱和酶介导的一种反应。进一步的去饱和步 骤导致ζ-胡萝卜素的产生。可以通过，如酶的突变获得遗传修饰来源， 酶的突变是产生类胡萝卜素的生物体内的六氢番茄红素的活性下游(active downstream)。这样合成的八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素将 会具有与从上文所述产生类胡萝卜素的生物体中得到的这些类胡萝卜素 的活性基本上类似的活性。
施用方式
当局部施用至皮肤，或当口服消耗时，八氢番茄红素和六氢番茄红素 的组合可以对皮肤发挥增白效果以及其他化妆效果。应该理解，组合物中 类胡萝卜素的量取决于施用路线、待治疗的现象和与使用者有关的参数， 如年龄、性别和施用方式。
局部施用
对局部施用来说，由上文所述的任一种方法获得的油溶性类胡萝卜素 制剂与化妆品上可接受的稀释剂混合，稀释剂选自，但不限于，由角鲨烷、 角鲨烯、液体石蜡、霍霍巴油、向日葵油以及聚癸烯组成的组。这样制备 的化妆品组合物是皮肤非常容忍的，且因而适于局部施用以达到化妆效 果，包括促进皮肤增白、使肤色变浅、使皮肤色调和/或肤色均匀或一致、 减少色素沉着、减少UV照射后的色素沉着、减少太阳斑(老年斑)或斑 点(雀斑)的出现、减少黑斑、减少黄褐斑、减少炎症后的色素沉着过度 以及减少有色的角质物以及类似效果。根据某些实施方案，稀释剂是角鲨 烷，通常是源自于天然来源的角鲨烷。天然角鲨烷的典型来源包括橄榄油、 麦芽和芝麻。
用根据本发明方法使用的化妆品组合物可以以选自，但不限于，由乳 膏、软膏、洗剂、凝胶、泡沫、悬浮液、水溶液或共溶剂、药膏、脂质体 以及适于局部施用类胡萝卜素制剂的其他任何化妆品上可接受的形式组 成的组中的形式被配制用于局部使用。组合物还可以形成用于经皮施用的 贴片的一部分。
因而，根据某些实施方案，本发明的组合物进一步包括稀释剂、赋形 剂或载体。
在某些实施方案中，局部制剂选自由乳状液、不可洗的(油包水)乳 膏或可洗的(水包油)的乳膏、洗剂、药膏以及类似物组成的组。
正如本领域众所周知的，稀释剂的物理化学特性可以通过添加各种赋 形剂来控制，赋形剂包括，但不限于，增稠剂、胶凝剂、润湿剂、絮凝剂、 悬浮剂以及类似物。这些任选的赋形剂将会确定所得到的制剂的物理特性 以使施用可以是更令人愉悦的或方便的。技术人员将认识到，所选择的赋 形剂应该优选增强且在任何情况下都不能干扰活性成分的活性以及制剂 的储存稳定性。
在局部组合物中含有油溶性类胡萝卜素的部分的浓度是在0.0001％- 50％(w/w)的范围内且优选在0.01％-10％(w/w)的范围内。
口服施用
先前已经显示饮食的类胡萝卜素存在于皮肤中。Hata等人 (J.Invest.Dermatology 115：441-448，2000)显示了八氢番茄红素、六氢番茄 红素和ζ-胡萝卜素以及其他物质以显著的量存在于人腹部皮肤提取物 中。还已经显示当饮食提供类胡萝卜素时，用作光保护剂的类胡萝卜素在 局部施用时也是有效的(Tronnier和heinrich，Int.J.Vitam.Nutr.Res. 75(1)：54-60，2005)。
因而，根据某些实施方案，本发明的组合物以选自液体剂量形式和固 体剂量形式的形式被配制用于口服施用。
在一些实施方案中，用于口服施用的组合物以选自由溶液、悬浮液、 干的可溶性冻干粉料、乳状液、微乳状液、分散体、脂质体剂量形式、诸 如胆固醇衍生物和磷脂的脂质体复合物、胶囊、软凝胶胶囊以及类似物组 成的组中的形式被配制。
在其他实施方案中，溶液和运载体选自水溶液和非水溶液。任选地， 选自由防腐剂、抗氧化剂和紧张性控制剂(tonicity controlling agent)组成 的组中的至少一种另外的成分可以被添加到制剂中。在一个实施方案中， 防腐剂选自由苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲 酸甲酯的钠盐组成的组。
在另一个实施方案中，紧张性控制剂选自由氯化钠、甘露醇、右旋糖、 葡萄糖、乳糖和蔗糖组成的组。
在其他实施方案中，本发明的组合物是用于口服施用的固体组合物， 其选自由片剂、胶囊、小袋(sachets)、粉料、颗粒剂和锭剂组成的组。
在某些实施方案中，配制成片剂的固体药物组合物除了活性化合物之 外，还包含合适的赋形剂，其包括，但不限于，淀粉、阿拉伯树胶、硅酸 钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制 剂可以另外包括润滑剂，如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和 悬浮剂；防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；或调味 剂。还可以使用多醇、缓冲剂和惰性填料。多醇的示例包括，但不限于： 甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、右旋糖以及 类似物。合适的缓冲剂包括，但不限于，磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐 (tartarate)、琥珀酸盐以及类似物。可以使用的其他惰性填料包括本领域 已知的且用于制造各种剂量形式的那些填料。如果期望的话，固体组合物 可以包括其他组分，如膨胀剂和成粒剂以及类似物。组合物可以被配制成 以便在通过采用本领域众所周知的过程施用至受实验者之后，提供类胡萝 卜素的快速释放、持续释放或缓慢释放。
口服剂量形式的含有油溶性类胡萝卜素的部分的浓度是在0.0001％- 50％(w/w)的范围内且优选在0.01％-10％(w/w)的范围内。
提供下面的实施例以便更充分地阐释本发明的优选实施方案。然而， 这些实施例决不应该被解释为限制本发明的宽范围。
实施例
实施例1：源自番茄的类胡萝卜素提取物(IBR-)对正常人的黑色素细胞和小鼠B16黑色素瘤细胞的培养中的黑色素合成的影响
材料和方法
细胞和培养条件
细胞类型：使用第六次传代的正常人的表皮黑色素细胞(NHEM-2)。
培养基：培养基254(用于人黑色素细胞的基础培养基，Tebu-bio France，058M-254-500)+补体HMGS-2，无PMA(Tebu-bio France， 058S-016-5)
青霉素50UI/ml和链霉素50μg/ml(Invitrogen 15070063) 细胞类型：使用第五次传代的B16小鼠黑色素瘤细胞系(B16)。 培养基：DMEM(Invitrogen 21969035)
L-谷氨酰胺2mM(Invitrogen 25030024)
青霉素/链霉素50UI/ml/50μg/ml(Invitrogen 15070063)
胎牛血清10％(v/v，Invitrogen 10270098)
培养：37℃和5％ CO2
试验化合物和参照
参照浆料溶液稀释最终的试验浓度异丁基甲基黄嘌呤 (IBMX，Sigma I7018)培养基中500mM在培养基中200μM曲酸 (KA，Sigma K3125)培养基中 10mg/ml(1％)在培养基中0.04％，0.0036％和 0.00156％
培养条件
正常人的表皮黑色素细胞
在24孔板(120,000个细胞/孔)中培养R6-NHEM-2细胞。在50％ 汇合(confluence)时，用含有或不含(对照)试验化合物、KA或IBMX (参照)或最终浓度0.5％的DMSO(对照DMSO)的新鲜培养基替换培 养基。以一式三份检测每一次的试验条件(对于对照，一式六份)。在37℃ 下培育细胞达240小时，且每3天换一次培养基。
B16小鼠黑色素瘤细胞系
在24孔板(1000个细胞/孔)中培养R7-B16细胞。在20％汇合时， 用含有或不含(对照)试验化合物、KA或IBMX(参照)或最终浓度0.5％ 的DMSO(对照DMSO)的新鲜培养基替换培养基。以一式三份检测每一 次的试验条件。在37℃下培育细胞达144小时，且3天后换培养基(2×72 小时)。
黑色素检验
在培育之后，清洗细胞单层，细胞被溶解且黑色素被0.5M的NaOH 溶液提取。以相对于黑色素标准，在405nm测量每一个试验点的光密度 (OD)(标准曲线0.39μg黑色素/ml溶液到100μg黑色素/ml溶液，Sigma M8631)。结果以μg黑色素/ml以及阴性对照的百分数表示。
数据处理(Data Management)
将原始数据转移到软件(Graph Pad Software)中并用其分析。 通过方差分析(ANOVA)用Dunnett的多重比较试验来进行组内比较(inter -group comparisons)。
结果和结论
IBR-对B16小鼠黑色素瘤细胞系中的黑色素含量的影响
下面的表1和图1显示了IBR-和参照化合物对经由B16小 鼠黑色素瘤细胞(B16)的黑色素合成的影响。
以0.04％进行试验的参照化合物“曲酸”略微降低了B16小鼠黑色素瘤 细胞(B16)的黑色素含量(88％的对照)。以200μM进行试验的参照 “IBMX”极大地增加了黑色素含量(731％的对照，p<0.01)。这些值在此 类型的测定中被预期。
以0.5％的最终浓度存在于培养基中的DMSO极大地增加了B16黑色 素细胞的黑色素含量(3倍刺激因子)。
在这些试验条件下，以0.5％进行试验的化合物IBR-(最终 0.5％的DMSO)降低了B16小鼠黑色素瘤的黑色素含量(与对照DMSO 相比，22％的抑制)。在这些试验条件下，未观察到对培养基中的B16小 鼠黑色素细胞的抑制细胞效应(数据未示出)。
表1：黑色素测定-B16小鼠黑色素瘤
IBR-对正常人表皮黑色素细胞培养中的黑色素含量的影响
下面的表2和图2显示了IBR-和参照化合物对经由人表皮黑 色素细胞的黑色素合成的影响。
以0.0036％和0.00156％进行试验的参照化合物“曲酸”导致了黑色素 含量的明显的剂量依赖性(dose-dependent)的减少(分别是对照的67％ 和79％，p<0.01)。以200μM进行试验的参照“IBMX”显著增加了黑色素 含量(171％的对照，p<0.01)。这些值在此类型的测定中被预期且证实了 此测定。
在这些试验条件下，以0.5％进行试验的化合物IBR-显著降低 了正常人黑色素细胞的黑色素含量(与对照DMSO相比，71％)。
表2：黑色素测定-正常人的黑色素细胞
实施例2：角鲨烷中的IBR-对黑色素形成和增白的影响
源自番茄的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合物溶解在来自橄榄 油的角鲨烷中(八氢番茄红素和六氢番茄红素组合的总浓度：0.724 mg/ml)。在此组合物中，其他类胡萝卜素是不可检测到的。以0.3％、0.5％ 和1.0％的最终浓度使用此组合物来评价其对B16小鼠黑色素瘤细胞的增 白效果。
在37℃、5％ CO2的MEM培养基中培养B16小鼠黑色素瘤细胞。第 二天，用0、0.25％、0.5％、1.25％、3.75％和5％的角鲨烷番茄提取物处 理此细胞。通过“被处理的”，这意味着培育的培养基被替换且角鲨烷番 茄提取物被添加以达到上述最终的浓度。4天后，通过离心法收集细胞。 通过按照下面的方式评价细胞团块(cell pellet)的颜色来评价增白效果：
(++)：与未接受处理的细胞团块(对照)相比，特别白；(+)：与对 照相比，明显白了；(-)：无效果
按照下面的方式测量所有处理过的细胞的生存力(viability)：将细胞 转移到另一个板，用福尔马林固定且通过添加1％的结晶紫溶液染色。基 本上根据制造商的用法说明，用MONOCELLATER(Olympus Optical Company)测量细胞生存力。未观察到对B16黑色素瘤培养细胞的毒性效 果(参见下面的表3)。
表3：角鲨烷番茄提取物对黑色素瘤细胞的增白效果
浓度(％)00.250.51.253.755.0增白效果--+++++++细胞生存力(％)10010611210410198
显示在上面的实施例1和实施例2中的结果证实了具有不可检测到的 其他类胡萝卜素、包括类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合物 在抑制正常的以及癌性的皮肤细胞内的黑色素含量方面是非常有效的。而 且，基本上不含有色的类胡萝卜素，如β-胡萝卜素和番茄红素的这样的组 合物是非常稳定的。此外，因为是无色的，所以八氢番茄红素和六氢番茄 红素的组合物非常适合于化妆品的应用，因为其并不会将任何色彩提供到 化妆品制剂中。
实施例3：洁面乳的制备
A.下面描述的成分(1)到(7)在加热条件下被混合并溶解以获得混 合物A。
B.下面描述的成分(8)到(11)在加热条件下被混合并溶解以获得 混合物B。
C.将混合物B添加到混合物A中以获得混合物C。
D.冷却混合物C，且随后添加下面描述的成分(12)到(14)并混合 以得到洁面乳。
*按照实施例1A生成的
q.s.足够量的
实施例4：润肤液的制备
A.下面描述的成分(1)到(6)被混合并溶解以获得混合物A。
B.下面描述的成分(7)到(12)被混合并溶解以获得混合物B。
C.将混合物B添加到混合物A中以获得润肤液。
*按照实施例1A生成的
q.s.足够量的
实施例5：乳液(milky lotion)的制备
A.下面描述的成分(1)到(13)在加热条件下被混合、溶解并保持 在70℃以获得混合物A。
B.下面描述的成分(14)到(18)在加热条件下被混合、溶解并保持 在70℃以获得混合物B。
C.将混合物B添加到待乳化的混合物A中并添加成分(19)以获得 混合物C。
D.将成分(20)添加到混合物(C)中以得到乳液。
*按照实施例1A生成的
实施例6：护肤霜(skin cream)的制备
A.下面描述的成分(1)到(14)在加热条件下被混合、溶解并保持 在70℃以获得混合物A。
B.下面描述的成分(15)到(19)在加热条件下被混合、溶解并保持 在70℃以获得混合物B。
C.将混合物B添加到待乳化的混合物A中并添加成分(20)以获得 混合物C。
D.冷却混合物C；添加成分(21)并混合以得到护肤霜。
*由Nisshin Oillio，Ltd.生产的“COSMOL 168AR”
**按照实施例1A生成的
按照上面的实施例4-6中的描述获得的所有化妆品组合物都是无色 的、均匀的且未显示出任何析出，因此具有极佳的稳定性。
当每周至少一次至高达每天两次，将所有这些组合物施用至皮肤时， 它们能够使皮肤变漂亮、变白和变亮。
前面的具体实施方案的描述将如此充分揭示本发明的一般性质，以致 于其他人为了不同的应用，可以通过应用目前的知识容易地修改和/或改变 这种具体的实施方案而无需过度的试验且不会偏离一般概念，且因此，这 种改变和修改应该且期望被包括在所公开实施方案的等同物的意思和范 围内。应该理解，此处采用的措词或术语是基于描述的目的，而不是限制 的目的。用于实施各种所公开的化学结构和功能的装置、材料和步骤可以 呈现多种可替代的形式，而并不会偏离本发明。