酶催化的高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的制备方法.pdf

本发明涉及酶催化的高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的制备方法。α-葡聚糖转移酶或分支酶能水解淀粉中支链淀粉簇之间的片段的连接，从而产生支链淀粉簇，同时，分支酶将支化的侧链连接到直链淀粉上，从而产生支化的直链淀粉，随后用麦芽糖淀粉酶处理所述支链淀粉簇或支化的直链淀粉，以将长的侧链剪切为短的侧链并将葡萄糖转移到侧链上，从而由淀粉有效地产生高度支化的支链淀粉簇、高度支化的直链淀粉或支化的寡糖。

1、  一种制备高度支化的直链淀粉、高度支化的支链淀粉簇或支化的寡糖的方法，该方法是将淀粉与分支酶或α-葡聚糖转移酶、以及麦芽糖淀粉酶一起孵育。

2、  根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括以下步骤：
将淀粉与从枯草杆菌(Bacillus subtilis)中分离的分支酶或从水生栖热菌(Thermus scotoductus)中分离的α-葡聚糖转移酶，在30-75℃下孵育30分钟到4小时，以产生支链淀粉簇或支化的直链淀粉；以及
将得到的支链淀粉簇或支化的直链淀粉，用来源于嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶在45-65℃下处理2-4小时，以制备高度支化的直链淀粉、高度支化的支链淀粉簇或支化的寡糖。

3、  根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述淀粉是选自由淀粉、含淀粉的谷物、支链淀粉和直链淀粉所组成的组中的一种。

4、  一种高度支化的支链淀粉簇，该高度支化的支链淀粉簇由权利要求1-3中的任意一项所述的方法制备，该高度支化的支链淀粉簇具有10⁴-10⁵的分子量和6-23DP的α-1，6糖苷键。

5、  一种高度支化的直链淀粉，该高度支化的直链淀粉由权利要求1-3中的任意一项所述的方法制备，该高度支化的直链淀粉具有8-18DP的α-1，6糖苷键及α-1，4糖苷键。

6、  一种支化的寡糖，该支化的寡糖由权利要求1-3中的任意一项所述的方法制备，该支化的寡糖通过薄层层析法测定具有2-5BDP。

7、  一种加工的健康保健食品，该加工的健康保健食品含有高度支化的直链淀粉或高度支化的支链淀粉簇作为有效成分。该高度支化的直链淀粉或高度支化的支链淀粉簇由权利要求1-3中的任意一项所述的方法制备。

8、  根据权利要求7所述的加工的健康保健食品，其中，该加工的健康保健食品具有抗糖尿病、抗肥胖或持续供应能量的作用。

酶催化的高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的制备方法
技术领域
本发明涉及一种酶催化的高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的制备方法，具体地，本发明涉及的方法包括以下步骤：用分支酶或α-葡聚糖转移酶水解支链淀粉以产生支链淀粉簇，同时，用分支酶处理直链淀粉以制备支化的直链淀粉，该支化的直链淀粉中糖苷的侧链是支化的；以及利用麦芽糖淀粉酶的转糖基活性，由已制备的支链淀粉簇和支化的直链淀粉制备得到高度支化的支链淀粉簇、高度支化的直链淀粉和支化的寡糖。
背景技术
高度支化的支链淀粉簇和直链淀粉是新的功能性材料，它们是高度水溶性的，并能延缓在小肠内的消化，防止血液葡萄糖水平急剧升高，而且能通过持续的能量供应来增强运动力，因此需要一种能够有效制备此种新的功能性材料的方法。
α-葡聚糖转移酶或分支酶能水解支链淀粉簇之间的片段，从而产生支链淀粉簇。此外，当分支酶与直链淀粉反应时能产生支化的直链淀粉。麦芽糖淀粉酶水解淀粉后主要产生麦芽糖单位，并且该酶还通过形成多种糖苷键而展示出高度的转糖基活性，所述糖苷键的形成可以产生高度支化的支链淀粉和直链淀粉，其中葡萄糖通过α-1，6糖苷键而连接在非还原末端。
发明内容
因此，本发明的目的是利用麦芽糖淀粉酶、以及α-葡聚糖转移酶或分支酶提供一种作为新的功能性材料的高度支化的支链淀粉和直链淀粉。
为了实现上述目的，以从枯草杆菌(Bacillus subtilis)168中分离的分支酶或从水生栖热菌(Thermus scotoductus)中分离的α-葡聚糖转移酶在pH5.5-7.5和30-75℃条件下对支链淀粉和直链淀粉进行处理，随后再用从嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)中分离的麦芽糖淀粉酶在45-65℃下进行处理，结果产生高度支化的支链淀粉簇和直链淀粉。
本发明的特征在于提供了通过将淀粉与分支酶或α-葡聚糖转移酶、以及麦芽糖淀粉酶进行反应，来制备高度支化的支链淀粉簇、高度支化的直链淀粉和支化的寡糖的方法。
所述淀粉可以选自淀粉、含淀粉的谷物、或支链淀粉和直链淀粉。
本发明方法的特征在于包括以下步骤：向淀粉中加入从枯草杆菌(Bacillus subtilis)168中分离的分支酶或从水生栖热菌(Thermusscotoductus)中分离的α-葡聚糖转移酶，在30-75℃下孵育30分钟到4小时，从而产生支链淀粉簇或支化的直链淀粉；将上述得到的支链淀粉簇或支化的直链淀粉，用来源于嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶在45-65℃下处理2-4小时。
所述α-葡聚糖转移酶、分支酶和麦芽糖淀粉酶可以是从天然的原核或真核生物体分离和纯化的典型的酶，或者可以是通过人工表达的方法用重组DNA技术产生的所述酶的基因而制备的。
根据本发明，所述α-葡聚糖转移酶通过下述方法制得：将编码来自水生栖热菌(Thermus scotoductus)的α-葡聚糖转移酶的基因克隆，并转化到枯草杆菌(Bacillus subtilis)ISW 1214中，然后将表达的酶纯化。所述分支酶通过下述方法制得：将编码来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)168的分支酶的基因克隆，并转化到枯草杆菌中，然后将表达的酶纯化。所述麦芽糖淀粉酶也通过以下的方法制得：将编码来自嗜热脂肪杆菌(Bacillusstearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶的基因克隆，并转化到枯草杆菌LK87中，然后将表达的酶纯化。
在上述酶中，分支酶可以从枯草杆菌168中分离得到或利用基因工程方法制备得到。根据本发明的一个实施例，所述分支酶通过如下步骤产生：
(a)插入从枯草杆菌168中分离的编码分支酶的DNA序列，从而制备得到重组载体；(b)将重组载体引入宿主细胞，从而制备得到转化体；以及(c)培养所述转化体以产生淀粉酶。
在步骤(a)中，可以将编码分支酶的序列插入到典型的表达载体(即pET-22b(+))中，但是最好根据宿主细胞来选择合适的载体。在本发明的一个实施例中，制备了具有如图2所示的剪切图谱的p6xHTKNd载体。
在转化的步骤(b)中，所述宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞或衍生自真核细胞的细胞，包括大肠杆菌、乳酸细菌、酵母、真菌等等，但并不限于此。转化的方法可以利用众所周知的常用方法进行。
在培养转化体的步骤(c)中，培养基可以根据宿主细胞进行合适的选择，且培养条件也可以根据宿主细胞而改变。将根据本发明的一个实施例中所制备的大肠杆菌MC1061，在含卡那霉素的LB培养基中于30-37℃下培养16-20小时，即可产生许多分支酶。
同时，产生分支酶的方法可以包括从进行步骤(c)后得到的转化体中纯化得到淀粉酶重组蛋白的步骤。所述纯化的步骤可以包括用超声波裂解转化的细胞和用超声裂解的上清液进行镍亲和层析的步骤。
上述产生分支酶的方法，可以通过在较低的温度下培养微生物而有效的降低成本，并且还可以提高生产分支酶的生产能力。
本发明的淀粉酶可以通过众所周知的方法而简单地制备，这对于本领域的普通技术人员是显而易见的。
用上述方法制备的高度支化的支链淀粉簇和直链淀粉的分子量和组成可以分别用SEC-MALLS(排阻层析法-多角激光散射)和高效离子交换层析来分析。换言之，高度支化的支链淀粉和直链淀粉的分子量可以用SEC-MALLS(排阻层析法-多角激光散射)来测定，并且在它们与异淀粉酶反应而去分枝后，可以用高效离子交换层析来分析高度支化的支链淀粉和直链淀粉的组成。
根据本发明的一个实施例，高度支化的支链淀粉簇可以通过如下步骤产生和测定：
将胶凝化的糯米淀粉与50-100U/g(每克糯米淀粉用50单位)的α-葡聚糖转移酶一起孵育，以产生支链淀粉簇；
将所产生的支链淀粉簇用100-500U/g(每克支链淀粉簇用100-500单位)麦芽糖淀粉酶在45-65℃下处理3-5小时，以产生高度支化的支链淀粉簇。
当在各步骤中用SEC-MALLS测定它们的分子量时，支链淀粉簇的分子量确定为约10⁵，高度支化的支链淀粉簇的分子量为约10⁴，相反，糯米淀粉的分子量为10⁸。
可以将所述支链淀粉簇和高度支化的支链淀粉簇用0.2-1U/mg的异淀粉酶(每毫克底物用0.2-1单位)在45-60℃下处理24-48小时，以使α-1，6糖苷键去分支化，并且可以使用高效离子交换层析来确定它们的组成。
为了确认大于13DP的高度支化的支链淀粉簇，由于鉴定它们的支化度很困难，因此应该用β-淀粉酶进行处理。预计最终产生分子量为10⁴-10⁵、α-1，6糖苷键长度为6-23DP的高度支化的支链淀粉簇。
同时，根据本发明的一个实施例，高度支化的直链淀粉通可以过如下步骤产生：
将直链淀粉(来源于马铃薯的III型直链淀粉，Sigma)与50-100U/mg(每毫克底物用50-100单位)的分支酶一起孵育，以获得支化的直链淀粉；
用0.2-1U/mg(每毫克底物用0.2-1单位)的麦芽糖淀粉酶处理上述支化的直链淀粉，以产生高度支化的直链淀粉。
用0.2-1U/mg的异淀粉酶处理支化的直链淀粉和高度支化的直链淀粉以去分支化，随后进行高效离子交换层析，可以产生具有新的8-18DP的α-1，6糖苷键及α-1，4糖苷键的高度支化的直链淀粉。
另外，根据本发明的一个实施例，当用硅胶K5F薄层层析板分析在产生高度支化的支链淀粉簇的过程中产生的寡糖时，可以确认较长的麦芽糖寡糖被转变为2-5BDP的支化的寡糖。
本发明中所用的术语“支化的”定义为葡萄糖通过α-1，6糖苷键及α-1，4糖苷键而连接的状态。另外，“DP”是“聚合度”的缩写，指葡萄糖的数目。在本发明中“DP”具体指被异淀粉酶去支化的葡萄糖的数目，即分支链的长度。在本发明中，“高度支化的”定义为DP大于6。
另外，“BDP”是“支化的聚合度”的缩写，且支化的寡糖不用异淀粉酶处理即可以用BDP表示，因为它的分子量较低，它的支化度可以通过薄层层析法(TLC)分析来确定。
本发明的特征在于提供了一种加工的健康保健食品，该加工的健康保健食品具有抗糖尿病、抗肥胖或持续供应能量的作用。
本发明中所述的“持续供应能量的作用”指所述高度支化的支链淀粉或直链淀粉可以被缓慢地水解，从而能够持续地供应能量。
如表1中所示，当比较支链淀粉簇和高度支化的支链淀粉簇通过葡糖淀粉酶(能水解α-1，6糖苷键和α-1，4糖苷键，但是对α-1，4糖苷键的水解力较高)的水解动力学时，可以推测支链淀粉簇由于K_cat值高和K_m值低而更容易被葡糖淀粉酶所水解。如果K_m值低，那么它的效率就高，会诱导与底物之间的较强结合，并产生许多产物。相反，如果K_m值高，那么它的效率就低，与底物的结合会较弱。K_cat值较高意味着存在更多的能够将底物转化成产物的分子。相应的，推测出高度支化的支链淀粉簇被葡糖淀粉酶水解的较慢。换言之，高度支化的形成使水解更缓慢，并且由此可以持续地供应能量。
本发明涉及酶催化的高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的制备方法。α-葡聚糖转移酶或分支酶能水解淀粉中支链淀粉簇之间的片段的连接，从而产生支链淀粉簇，同时，分支酶将支化的侧链连接到直链淀粉上，从而产生支化的直链淀粉，随后用麦芽糖淀粉酶处理所述支链淀粉簇或支化的直链淀粉，从而将长的侧链剪切为短的侧链并将葡萄糖转移到侧链上，从而从淀粉中有效地产生高度支化的支链淀粉簇、高度支化的直链淀粉或支化的寡糖。
附图说明
图1为使用BSMA(嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶)和α-GTase(4-α-葡聚糖转移酶)或分支酶由支链淀粉或淀粉制备高度支化的支链淀粉簇和直链淀粉的流程示意图。
图2为克隆编码枯草杆菌(Bacillus subtilis)168的分支酶的基因的流程示意图。
图3为用大肠杆菌MC1061产生的枯草杆菌168的分支酶的电泳照片。
图4为显示了重组蛋白质(分支酶)在多种pH值条件下的活性的曲线图。
图5为显示了重组蛋白质(分支酶)在多种温度条件下的活性的曲线图。
图6为SEC-MALLS分析结果，该结果显示用α-GTase制备的支链淀粉簇的分子量降低。
图7为显示了支链淀粉簇和高度支化的支链淀粉簇的侧链分布的层析图。
图8为显示了支化的直链淀粉和高度支化的直链淀粉的侧链分布的层析图。
图9为支化的寡糖的TLC层析图，该支化的寡糖是在用BSMA制备高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的过程中产生的副产品。
具体实施方式
在下文中，通过下述实施例详细说明本发明。然而，所述实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1：来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)168的分支酶的克隆、产生和特征
1-1.编码分支酶的基因的克隆
为了分离分支酶，分别制备了正向引物F-glgB(5’-GAAAGGATGATTCCATGGCCGCTGCCAGC-3’)和反向引物R-glgB(5’-AAAGAGGAGAGATAAAAAGATGAAAAAACAATGTGTAGCCA-3’)。然后，用含有枯草杆菌168(ATCC 23857D-5)的染色体DNA、Ex Taq聚合酶(Takara Phuzo，东京，日本)、Ex Taq缓冲液和dNTP混合物的混合液进行PCR。使用US/7500实时PCR系统(Corbett公司)进行PCR。反应按如下条件进行：第一个步骤，95℃变性5分钟，一个循环；第二个步骤，94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟，30个循环；最后72℃延伸7分钟。在4℃冷却4分钟以终止反应。上述反应的结果获得了1.8kb的PCR产物。将所述PCR产物用限制性内切酶NcoI和XhoI处理，并与相应的表达载体p6xHTKNd连接，制成p6xHTKNDglgB。p6xHTKNDglgB的剪切图谱在图2中显示。所述p6xHTKNDglgB载体具有编码分支酶的基因，并且在分支酶基因的3’-末端具有附加的6-组氨酸标签。
为了转化，将大肠杆菌MC1061(New England Biolab inc.)在5mL LB培养基中于37℃预培养12小时。将1mL预培养液转移到50mL新鲜LB培养基中，培养到600nm处的O.D值达到0.5。然后，将1.5mL培养液在4℃离心(7000×g，5分钟)，并收集沉淀，将沉淀重悬于0.75mL转化溶液(50mLCaCl₂)中，在冰上放置30分钟。将15mL的所述重悬溶液与500ng含p6xHTKNDglgB的连接溶液混合，在冰上放置1小时，在42℃热激2分钟。在热激后的溶液中补充0.8mL LB培养基，于37℃培养1小时，然后将该溶液涂布于含卡那霉素(终浓度为100mg/mL)的LB琼脂培养基上，来筛选有抗性的微生物。
将所筛选的微生物接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃培养12小时，并离心收集微生物。使用质粒分离试剂盒从收集的微生物中分离质粒，并用限制性内切酶NcoI和XhoI切割质粒，该切割显示所述质粒含有约1.8kb的分支酶。
1-2.转化体的制备
将上述制备的p6xHTKNDglgB载体转化到大肠杆菌MC1061中，筛选卡那霉素抗性的微生物。将上述筛选的转化体接种于3L含氨苄青霉素的LB液体培养基中，并于37℃培养16小时。
1-3.纯化
通过离心(4℃，7000×g，离心30分钟)收集上述培养的转化体，并将其重悬于含300mM NaCl和10mM咪唑的50mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中，然后进行超声波裂解。将超声裂解的溶液离心获得上清液，并将该上清液在70℃热处理20分钟。热处理之后，将该溶液离心(10000×g，离心30分钟)收集上清液。用镍-NTA亲和层析从所述上清液中纯化分支酶溶液。
1-4.酶的活性和pH值特征
将溶于50mM Tris-HCl缓冲液中的所述酶溶液(25μL)与溶于50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)中的0.1％直链淀粉溶液混合，并于37℃孵育20分钟。用碘化物-HCl溶液终止反应并染色。测量660nm处的吸光度。1单位分支酶定义为与直链淀粉标准曲线相比较，每分钟降解1μg/mL直链淀粉的酶量。
为了确定所述酶的最适pH值，以β-环糊精的多种pH值来测量该酶的相对活性。
25μL 0.1％(w/v)的直链淀粉溶液，分别溶解于50mM的醋酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)、50mM的磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0)和50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-10.0)中，将它们分别加入到25μL用各自缓冲液溶解的底物溶液中，并在30℃孵育20分钟，以测定酶的相对活性。
图4显示了重组蛋白质(分支酶)在多种pH条件下的活性，该分支酶在pH 7.5的条件下显示出最大活性，在pH 9.0-10.0的条件下具有大于50％的活性。
1-5.酶的温度特征
为了确定所述分支酶的最适温度，在多种温度下将25μL溶解于50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)中的直链淀粉溶液热处理5分钟。然后，将热处理后的溶液与25μL分支酶混合，在各温度下孵育20分钟，以测定该酶的相对活性。
图5显示了重组蛋白质(分支酶)在多种温度条件下的活性，该分支酶在30℃的条件下显示出最大活性。
实施例2：支链淀粉簇的制备
2-1.制备
使用糯米淀粉作为淀粉的来源。
α-葡聚糖转移酶通过下述方法制得：将水生栖热菌(Thermusscotoductus)ATCC 27978的α-葡聚糖转移酶基因转化到枯草杆菌(Bacillussubtilis)ISW 1214(Takara Phuzo公司)中，然后将表达的酶用镍亲和层析纯化。
用25mM磷酸缓冲液(pH 6.5)制备5％的糯米淀粉溶液，并将该溶液置于沸水中20分钟进行胶凝化。然后，向胶凝化的淀粉溶液中加入100U/g的α-葡聚糖转移酶(每克糯米淀粉用100单位)，将混合液在75℃下孵育30分钟。将混合液煮沸30分钟以终止反应。
2-2.用SEC-MALLS(排阻层析法-多角激光散射)测量分子量
将0.5％(5mg/mL)的糯米淀粉和0.5％(5mg/mL)的支链淀粉簇煮沸超过1小时，分别注射到SEC-MALLS中测量它们的分子量。用WyattTechnology制造的MALLS系统以及Shodex公司制造的由连接的SUGARKS-806(8.0mmID×300mm)和SUGAR KS-804(8.0mmID×300mm)组成的柱进行测量。结果在图6中显示。
实施例3：从支链淀粉簇制备高度支化的支链淀粉簇
3-1.高度支化的支链淀粉簇的制备
麦芽糖淀粉酶通过以下的方法制得：将嗜热脂肪杆菌(Bacillusstearothermophilus)KCTC 0114BP的麦芽糖淀粉酶基因转化到枯草杆菌LK87(高丽大学研究生院，Improvement of the production of foreign proteinsusing a heterologous secretion vector system in Bacillus subtilis：effects ofresistance to glucose-mediated catabolite repression.Mol cells.1997 Dec31；7(6)：788-94.)中，然后将表达的酶用镍亲和层析纯化。
然后，将100U/g麦芽糖淀粉酶(每克支链淀粉簇用100单位)与实施例1中反应已终止的反应溶液一起在55℃下孵育4小时。煮沸超过30分钟来终止此反应，并将反应溶液在12000rpm离心20分钟，以除去变性的蛋白质。为了除去残留在反应溶液中的盐，将反应溶液通过阴离子交换树脂(C100FL，Prolite公司)和阴离子交换树脂(A400，Prolite公司)。然后，为了除去残余的多糖，加入两倍体积的乙醇，以沉淀大分子的糖，然后将溶液再离心并去除上清液，将沉淀冻干制成粉末。
3-2.用高效离子交换层析分析反应溶液
为了确认支链淀粉簇和高度支化的支链淀粉簇中侧链的分布和组成，将上述簇分别溶解于25mM醋酸钠缓冲液(pH4.3)制备成1％的溶液。将该溶液用0.5U/mg(每毫克底物用0.5单位)异淀粉酶在60℃处理48小时。各反应物中α-1，6糖苷键被切割，用高效离子交换层析(GP40梯度泵，Dionex公司)以CaroboPAC^TM PA1(4×50mm)柱来分析各反应物。由于DP大于13的高度支化的支链淀粉簇的分枝部分很难区分，因此使用β-淀粉酶处理以使分析更容易。(图7)
实施例4：用葡糖淀粉酶水解高度支化的支链淀粉簇的水解动力学
用分离自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶(Fluka Biochemica.)来研究支链淀粉簇和高度支化的支链淀粉簇的水解动力学。
将50μL多种浓度的溶于50mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)的底物溶液在50℃预热5分钟。然后向底物溶液中加入50μL(0.3U)的葡糖淀粉酶，在60℃每隔30秒或1分钟收集部分的(20μL)反应混合物，持续收集5分钟。加入20μL 0.1N NaOH来终止上述反应。支链淀粉簇或高度支化的支链淀粉簇的水解量用GOD-POD方法(葡萄糖检测试剂，Asan Pharmaceutical)测量。
表1显示用GOD-POD方法对支链淀粉簇和高度支化的支链淀粉簇的葡糖淀粉酶水解动力学的测量和定量结果。
表1