HBA1C测定方法.pdf

本发明提供一种HbA1c的测定方法，即使对于保存后的全血试样，亦可维持与刚采血后同等的测定精度。在糖酵解抑制剂存在下保存全血，并向保存后的上述全血试样中添加蛋白酶，以切断上述全血试样中的血红蛋白。再使果糖胺氧化酶作用于所得到的血红蛋白片段的糖化部分，测定上述糖化部分与果糖胺氧化酶的氧化还原反应，由此确定HbA1c糖化率。此外，代替糖酵解抑制剂存在下的全血保存，而可以向保存后的全血中添加KCl、K2SO4、KNO、NaCl、Na2SO4、NaNO、MgCl2、MgSO4、Mg(NO)2等强电解质物质，在上述强电解质物质存在下进行蛋白酶处理。通过这些方法，可以避免因保存全血而引起的HbA1c测定值的变动。

1.  一种制备方法，其特征在于，其为HbA1c的测定方法中使用的含血红蛋白试样的制备方法，包含下述(A1)或(A2)的工序：
(A1)在抑制二氧化碳产生的状态下，保存血红蛋白含有物的工序，
(A2)从保存后的血红蛋白含有物中，减少与血红蛋白结合着的二氧化碳的工序。

2.  根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述(A1)工序中，在糖酵解抑制剂的存在下，保存血红蛋白含有物。

3.  根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述糖酵解抑制剂为氟化钠和氟化钾中的至少一种。

4.  根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述(A2)工序中，向所述保存后的血红蛋白含有物中添加强电解质物质，所述强电解质物质的正离子为选自K⁺、Na⁺以及Mg²⁺所组成的组中的至少一种离子，且所述强电解质物质的负离子为选自Cl^-、SO₄^2-以及NO^-所组成的组中的至少一种离子。

5.  根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述强电解质物质为选自KCl、K₂SO₄、KNO、NaCl、Na₂SO₄、NaNO、MgCl₂、MgSO₄以及Mg(NO)₂所组成的组中的至少一种。

6.  根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述含血红蛋白试样为全血试样或血细胞试样。

7.  一种HbA1c测定方法，其特征在于，其为测定HbA1c的方法，
包含下述(A)～(D)的工序：
(A)通过权利要求1所述的制备方法，准备保存后的含血红蛋白试样的工序，
(B)对保存后的所述含血红蛋白试样进行蛋白酶处理，切断所述含血红蛋白试样中的血红蛋白的工序，
(C)使果糖胺氧化酶作用于通过所述(B)工序得到的血红蛋白片段的糖化部分的工序，
(D)通过测定所述糖化部分与果糖胺氧化酶的氧化还原反应来确定HbA1c的量的工序。

8.  根据权利要求7所述的HbA1c测定方法，其中，所述(A)工序为如下的工序：在糖酵解抑制剂存在下保存血红蛋白含有物，由此准备保存后的所述含血红蛋白试样，
在所述(B)工序中，蛋白酶处理的反应液中的所述糖酵解抑制剂的浓度为0.01～10mol/L。

9.  根据权利要求7所述的HbA1c测定方法，其中，所述(A)工序为如下的工序：向保存后的血红蛋白含有物中添加强电解质物质，由此准备保存后的所述含血红蛋白试样，所述强电解质物质的正离子为选自K⁺、Na⁺以及Mg²⁺所组成的组中的至少一种离子，且所述强电解质物质的负离子为选自Cl^-、SO₄^2-以及NO^-所组成的组中的至少一种离子，
在所述(B)工序中，在所述强电解质物质存在下进行蛋白酶处理。

10.  根据权利要求9所述的HbA1c测定方法，其中，在所述(B)工序中，蛋白酶处理的反应液中的所述强电解质物质的浓度为10～3000mmol/L。

11.  根据权利要求7所述的HbA1c测定方法，其中，在所述(D)工序中，通过测定所述糖化部分与果糖胺氧化酶的氧化还原反应，算出所述含血红蛋白试样中的血红蛋白中的HbA1c量，再由所述含血红蛋白试样中的血红蛋白量与所述HbA1c量算出HbA1c的比例。

12.  根据权利要求8所述的HbA1c测定方法，其中，所述含血红蛋白试样为全血试样或血细胞试样。

13.  一种保存用试剂，其特征在于，其为权利要求1所述的含血红蛋白试样的制备方法中使用的、用于保存血红蛋白含有物的保存用试剂，
所述保存用试剂含有糖酵解抑制剂。

14.  根据权利要求13所述的保存用试剂，其中，所述糖酵解抑制剂为氟化钠和氟化钾中的至少一种。

15.  根据权利要求13所述的保存用试剂，其中，所述保存用试剂为用于抑制保存所述血红蛋白含有物时二氧化碳的产生的保存用试剂。

16.  根据权利要求13所述的测定方法，其中，所述含血红蛋白试样为全血试样或血细胞试样。

17.  一种处理用试剂，其特征在于，其为在权利要求1所述的含血红蛋白试样的制备方法中使用的、用于处理保存后的血红蛋白含有物的处理用试剂，
所述处理用试剂含有强电解质物质，所述强电解质物质的正离子为选自K⁺、Na⁺以及Mg²⁺所组成的组中的至少一种离子，且所述强电解质物质的负离子为选自Cl^-、SO₄^2-以及NO^-所组成的组中的至少一种离子。

18.  根据权利要求17所述的处理用试剂，其中，所述强电解质物质为选自KCl、K₂SO₄、KNO、NaCl、Na₂SO₄、NaNO、MgCl₂、MgSO₄以及Mg(NO)₂所组成的组中的至少一种。

19.  根据权利要求17所述的处理用试剂，其中，还含有蛋白酶。

20.  根据权利要求17所述的处理用试剂，其中，所述处理用试剂为用于减少所保存的血红蛋白含有物中的与血红蛋白结合的二氧化碳的处理用试剂。

21.  根据权利要求17所述的处理用试剂，其中，所述含血红蛋白试样为全血试样或血细胞试样。

22.  一种测定试剂盒，其为在权利要求7所述的HbA1c测定方法中使用的试剂盒，
所述测定试剂盒包含含有果糖胺氧化酶及强电解质物质的第1试剂、以及含有蛋白酶的第2试剂。

23.  根据权利要求22所述的测定试剂盒，其中，所述第1试剂还含有氧化酶，所述第2试剂还含有通过氧化而显色的底物。

HbA1c测定方法
技术领域
本发明涉及HbA1c测定中使用的含血红蛋白试样的制备方法及HbA1c测定方法。
背景技术
作为指示生物体状态的指标，常对各种蛋白质的糖化率进行测定。其中血细胞内血红蛋白(Hb)的糖化率，尤其是HbA1c能够反映生物体内血糖值的过往的历史，因此被视为糖尿病诊断及治疗等中重要的指标。HbA1c为葡萄糖结合于HbA(α₂β₂)的β链N末端氨基酸(缬氨酸)上的形态，其值用HbA1c量与总Hb量之比(比例，％)表示。
HbA1c例如可通过高效液相色谱(HPLC)法、免疫法、酶法、电泳法等进行测定，近年来，就确立利用酶法的简便的测定方法进行了研究。所述利用酶法的HbA1c测定方法例如为以下的方法。首先，使蛋白酶作用于Hb，切出含β链N末端缬氨酸的片段。随后再使果糖胺氧化酶(以下称“FAOD”)作用于上述片段的糖化部分(即β链N末端缬氨酸的糖化部分)，产生过氧化氢。该过氧化氢量对应于上述Hb的β链N末端缬氨酸的糖化量。再向该反应液中添加过氧化物酶(以下称“POD”)以及通过氧化而显色的显色底物，POD能催化过氧化氢与显色底物间的氧化还原反应。此后通过吸光度测定等来测定上述显色底物的显色程度。在该方法中，吸光度的大小与显色的显色底物的量相应，上述显色的显色底物的量与生成的过氧化氢的量相应，过氧化氢的量如前所述与糖化量相应。即通过测定显色程度，借助这样的氧化还原反应，可间接地测定糖化量。随后，利用该糖化量以及总Hb量可计算出HbA1c(％)。
这种HbA1c(％)的测定通常由检测机构来进行，特别是，在健康检查等中，从患者采集的含Hb试样(例如全血试样、从全血回收到的血细胞试样、从全血中回收到的Hb试样等)，采集后并非立即供于测定。通常，这些含Hb试样在例如常温、冷藏或冷冻状态下保存后供测定。
发明内容
然而，本发明人等在对上述酶法进行研究时，发现以下现象。即，将上述这种含Hb试样保存后再进行HbA1c检测时，将得到比使用刚采集的含Hb试样的测定值低的值。因此对于保存后测定的含Hb试样，很难维持与使用刚采集的含Hb试样的情况同等的测定精度。特别是，如上所述，由于HbA1c反映着生物体内血糖值的过往的历史，在糖尿病的治疗和预防中，与每次的测定值相比，了解经时变化非常重要。因此，对于引起测定值变动的主要因素，希望统一条件。但若要将含Hb试样从采集到测定的条件(例如，时间、温度等)保持为恒定，从效率上来说难以实现。
因此，本发明的目的在于提供一种HbA1c的测定方法，即使对保存后的含Hb试样，也可维持与刚采集后同等的测定精度。
本发明的含Hb试样的制备方法，其特征在于，其为测定HbA1c的方法中使用的含Hb试样的制备方法，包含下述(A1)或(A2)的工序。
(A1)在抑制二氧化碳产生的状态下，保存Hb含有物的工序，
(A2)从保存后的Hb含有物中，减少与Hb结合着的二氧化碳的工序。
本发明的HbA1c测定方法，其特征在于，其为测定HbA1c的方法，包含下述(A)～(D)的工序。
(A)通过本发明的制备方法，准备保存后的含Hb试样的工序，
(B)对保存后的上述含Hb试样进行蛋白酶处理，切断上述含Hb试样中的血红蛋白的工序，
(C)使果糖胺氧化酶作用于通过上述(B)工序得到的血红蛋白片段的糖化部分的工序，
(D)通过测定上述糖化部分与果糖胺氧化酶的氧化还原反应来确定HbA1c的量的工序。
本发明人等研究了由保存引起的含Hb试样中HbA1c变动的原因，结果表明，其原因在于含Hb试样保存时产生二氧化碳、以及产生的二氧化碳所导致的Hb结构变化。已知：一般情况下，即使是从体内采集的试样，例如，含有血细胞时，因血细胞其自身仍存活，由于糖酵解系统的作用，葡萄糖被消耗而产生二氧化碳。刚采集的健康者全血中的氧分压通常约为80～100mmHg，二氧化碳分压通常约为35～45mmHg。另外，在全血中，还以碳酸氢根离子(HCO₃^-)形式存在，上述碳酸氢根离子的浓度约为22～26mmol(例如24mmol)。但将全血例如在室温下放置1～5天的话，由于糖酵解系统的影响，氧分压降至约0mmHg左右、二氧化碳分压变为150mmHg以上，另外，碳酸氢根离子的浓度亦增加至约8～34mmol。该碳酸氢根离子的浓度为相当于例如刚采血后的全血中葡萄糖浓度的2倍的值。即，由于保存，全血中的氧浓度与二氧化碳浓度的比率发生逆转。像这样，二氧化碳所占比率增加的话，则会导致Hb的立体结构由氧合型变为脱氧型。这种转变为脱氧型的变化并不仅发生在全血中，例如，从全血中回收的血细胞试样或从全血中回收的Hb试样保存在存在二氧化碳的条件下、或保存在产生二氧化碳的状态下，同样会发生这种现象。对此进一步反复研究，结果表明，脱氧型Hb变成了如下的立体结构：通过酶法测定HbA1c时十分重要的β链N末端朝向Hb内部。即，采取以往的方法时，由于保存时产生二氧化碳，导致Hb的立体结构变为蛋白酶很难作用在β链N末端的脱氧型，因难以将所有Hb保持在氧合型，所以导致HbA1c测定值随着保存而降低的结果。此外，关于Hb的立体结构，虽已有报告存在氧合型与脱氧型，但脱氧型Hb为β链N末端朝向内部的构象，因此导致难以用蛋白酶切出β链N末端的缬氨酸或含该氨基酸的多肽则是由本发明人等首次阐明的。于是，本发明人等的第1手段为：通过抑制Hb含有物保存时产生二氧化碳，来实现对保存所导致的HbA1c变动的抑制。另外，本发明人等的第2手段为：即使Hb含有物保存中产生二氧化碳、Hb变为脱氧型，也可通过减少与Hb结合的二氧化碳，使Hb重新变为氧合型，从而抑制保存所导致的HbA1c变动。
如上所述，使用本发明，即使在保存Hb含有物的情况下，也可抑制HbA1c测定值的变动，因此对于保存后的含Hb试样，也可以以与刚采集的含Hb试样同样的精度测定HbA1c。由于这样可以抑制保存对HbA1c测定值的影响，因此，如上所述，对于在与试样采集地点不同的地点测定HbA1c的情况下、或收集一定数量的试样后集中进行HbA1c测定这样的必须保存试样的情况来说，可称为是相当有用的方法。此外，上述机理仅为推测，对本发明无任何限制。
具体实施方式
<含Hb试样的制备方法>
本发明的制备方法，如上所述，其特征在于，其为测定HbA1c的方法中使用的含Hb试样的制备方法，包含下述(A1)或(A2)的工序：
(A1)在抑制二氧化碳产生的状态下，保存Hb含有物的工序，
(A2)从保存后的Hb含有物中，减少与Hb结合着的二氧化碳的工序。
这样通过(A1)在抑制二氧化碳产生的状态下保存Hb含有物、或通过(A2)从保存后的Hb含有物中减少与Hb结合着的二氧化碳，可获得抑制了HbA1c测定值变动的含Hb试样。在本发明中，只要例如对Hb含有物抑制保存时二氧化碳的产生、或可减少保存时产生并与Hb结合的二氧化碳即可，对抑制二氧化碳产生的方法或使已产生的二氧化碳减少的方法没有任何限制。并且，只要是利用这样的方法制备出的保存后的含Hb试样，则在HbA1c测定时，例如可以以与刚采集后相同的精度测定HbA1c。予以说明，对使用通过本发明制得的含Hb试样的HbA1c的测定方法，没有任何限制。作为具体例子，例如，除了后述的酶法，还可采用免疫法、HPLC法等目前已知的方法。予以说明，关于本发明的含Hb试样的制备方法，将在本发明的HbA1c测定方法中详述。
在本发明中，保存的Hb含有物只需含有Hb即可。上述Hb含有物可举出例如全血、血细胞等。上述全血可举出例如采集(采血)后未经处理的全血、稀释的全血、溶血的全血等。另外，上述血细胞可举出例如从全血回收的血细胞、稀释的血细胞、溶血的血细胞等。血细胞例如可由全血通过沉降或离心分离等进行回收，但也可以残留有血浆等。另外，也可为从采血后的全血等回收的Hb(例如，精制Hb)。上述(A1)工序优选应用在例如保存含血细胞的Hb含有物、例如可举出未处理全血、稀释全血、血细胞等。上述(A2)工序优选应用于例如未处理全血、稀释全血、溶血的全血、血细胞、精制Hb等Hb含有物的保存中。另外，Hb含有物可以是干燥的(干燥物)也可以是湿润的(液体)。
<HbA1c测定方法>
本发明的HbA1c测定方法，其特征在于，其为测定HbA1c的方法，包含下述(A)～(D)的工序。
(A)通过本发明的制备方法，准备保存后的含Hb试样的工序，
(B)对保存后的上述含Hb试样进行蛋白酶处理，切断上述含Hb试样中的血红蛋白的工序，
(C)使果糖胺氧化酶作用于通过上述(B)工序得到的血红蛋白片段的糖化部分的工序，
(D)通过测定上述糖化部分与果糖胺氧化酶的氧化还原反应来确定HbA1c的量的工序。
在本发明的测定方法中，上述(A)工序中，既可以如上所述地在抑制二氧化碳产生的状态下保存Hb含有物，由此制备保存后的含Hb试样(A1)，也可以如上所述地从保存后的Hb含有物中减少与Hb结合的二氧化碳，由此制备保存后的含Hb试样(A2)。下面，第1种HbA1c测定方法为前者的具体例，第2种HbA1c测定方法为后者的具体例。此外，本发明不受这些具体例的限制。
第1种HbA1c测定方法
本发明的第1种HbA1c测定方法包含以下(A1’)～(D)的工序。
(A1’)在糖酵解抑制剂存在下，保存Hb含有物的工序(制备保存后的含Hb试样)，
(B)对保存后的含Hb试样进行蛋白酶处理，切断上述含Hb试样中的血红蛋白的工序，
(C)使果糖胺氧化酶作用于通过上述(B)工序得到的血红蛋白片段的糖化部分的工序，
(D)通过测定上述糖化部分与果糖胺氧化酶的氧化还原反应来确定HbA1c的量的工序。
根据本发明的第1种HbA1c测定方法，例如，在含血细胞的Hb含有物的情况下，由于保存时血细胞的糖酵解系统被抑制，所以能抑制二氧化碳的产生。其结果，能防止血红蛋白立体结构变为脱氧型Hb。因此，即使是保存后的含Hb试样，Hb的立体结构也能保持采血时那样的、β链N末端易于被蛋白酶作用的氧合型，从而能防止HbA1c测定值的变动。上述(A1’)的工序优选应用于保存例如含血细胞的Hb含有物，可举出例如未处理全血、稀释全血、血细胞等。
第1种HbA1c测定方法，只要是例如在上述(A1’)的工序中，在上述糖酵解抑制剂存在下保存Hb含有物即可，而对其它工序中的条件等无任何限制。另外，上述(B)工序和(C)工序，例如可以在同一反应液中同时进行。上述(D)工序可在上述(C)工序之后进行，亦可与上述(C)工序(以及上述(B)工序)同时进行。
上述糖酵解抑制剂可举出例如氟化钠、氟化钾等，其中优选氟化钠。另外，糖酵解抑制剂可使用任意一种，亦可将二种以上同时使用。
下面，举一个将全血作为Hb含有物进行保存的例子对本发明的第1种HbA1c测定方法进行说明。此外，本发明不受此例的限制，例如，对于稀释全血或血细胞等Hb含有物也同样适用。
(全血的保存)
从待测者采集全血，在上述糖酵解抑制剂存在下保存至HbA1c测定时。此外，虽然在HbA1c测定中，保存全血并非必需步骤，但本发明的目的是为了抑制保存所导致的HbA1c值的变动，因此优选在需要进行全血保存的情况下应用本发明。
上述糖酵解抑制剂，例如，可在从待测者采集全血后立即添加，亦可事先添加在采血用具(例如，采血管)中。具体例的含氟化钠的采血管，可以使用市售的商品名为ベノジエクトII真空采血管(terumo corporation生产)或商品名为グルコセ一ブ(セキスイ公司生产)等。另外、使用市售采血管时，可含有肝素等抗凝剂。通过同时存在肝素等抗凝剂，能确保充分的抗凝作用。本发明中，含上述糖酵解抑制剂的试剂可作为全血保存用试剂使用。
上述(A1’)工序中，上述糖酵解抑制剂相对全血的添加比例无特别限制，例如，每1ml全血中为0.1～100mol/L，优选为0.2～10mol/L。上述(B)的工序中的蛋白酶处理反应液中，上述糖酵解抑制剂(例如，NaF)的浓度为0.01～10mol/L，优选为0.01～3mol/L。
上述添加了糖酵解抑制剂的全血的保存时间无特别限制，例如，从采血当日起可保存约10天左右。采集自患者的全血送到检测机构的情况下，通常在采血之日起2天以内供于分析。根据以往的方法，从采血之日起经过4天的时间段内，对HbA1c测定值的影响很显著。从而，使用本发明的方法保存采血试样的情况下，可充分预防HbA1c％的变动，能够进行可靠性较高的HbA1c测定。
上述添加糖酵解抑制剂的全血的保存温度无特别限制，通常为1～35℃，优选为2～25℃，更优选为2～10℃。
另外，除上述未处理的全血外，在保存例如稀释全血或回收的血细胞时也可同样地进行处理。糖酵解抑制剂的添加比例无特别限制，将稀释全血或血细胞换算成全血的量，再按上述的范围进行添加。以下的工序也相同。
(溶血处理)
对保存后的全血试样进行溶血处理。全血试样的溶血方法无特别限制，例如可使用利用渗透压差的方法、利用超声波的方法等。利用渗透压差时，可相对于全血(或血细胞)添加2～100倍体积量的纯水进行溶血。另外，也可在试样中添加表面活性剂进行溶血。
(蛋白酶处理)
使蛋白酶作用于进行了溶血的保存后全血试样。通过该处理，切出上述试样中的Hb的β链N末端缬氨酸或含上述N末端缬氨酸的多肽(β链N末端多肽)，由此，使下述的FAOD能更高效地作用于Hb的糖化部分(β链N末端缬氨酸)。
上述蛋白酶可使用例如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸羧肽酶、蛋白酶K、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猪胰腺来源的胰蛋白酶、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的蛋白酶、米曲霉(Aspergillus ovvzae)来源的蛋白酶等，优选内切蛋白酶。市售品例如可举出金属蛋白酶(商品名、ア一クレイ公司生产)、蛋白酶A“アマノ”G(商品名、天野エンザイム公司生产)、蛋白酶M“アマノ”G(商品名、天野エンザイム公司生产)、蛋白酶S“アマノ”G(商品名、天野エンザイム公司生产)、肽酶R(商品名、天野エンザイム公司生产)、木瓜蛋白酶M-40(商品名、天野エンザイム公司生产)、蛋白酶N(商品名、フルカ公司生产)、蛋白酶N“アマノ”(商品名、天野制药公司生产)、芽孢杆菌属(Bacillus)来源的金属蛋白酶(商品名、トヨチ一ム东洋纺公司生产)等。
其中特别优选能与β链N末端特异性作用、催化N末端多肽断裂反应的蛋白酶(例如，日本特开2000-300294号公报、日本特开2004-344052号公报等)。另外，催化β链N末端缬氨酸断裂反应的蛋白酶可举出例如国际公开第2000/50579号小册子(日本特许3668801)、国际公开第2000/61732号小册子、日本特开2002-315600号公报等公开的蛋白酶。
该反应液中蛋白酶的添加比例例如在0.001～300,000KU/L的范围，优选为0.01～30,000KU/L，特别优选为0.1～1000KU/L。上述反应液中的Hb浓度为0.005mM时，蛋白酶的添加比例例如在0.01～300,000KU/L的范围，优选为0.05～30,000KU/L，特别优选为0.1～10,000KU/L。蛋白酶的活性单位“U”为：以每分钟内能增加相当于1微摩尔酪氨酸在275nm的吸光度的酶量作为1U。
上述蛋白酶处理优选例如在缓冲液中进行，可使用Tris-盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸缓冲液、ADA缓冲液，柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液等。另外，蛋白酶反应液的pH例如在4～10的范围，优选为6～9。
蛋白酶处理的条件无特别限制，处理温度例如在10～40℃的范围，优选为25～37℃。处理时间例如在1～100分钟左右，优选为1～10分钟。
另外，该蛋白酶处理例如可在以下所示的促进化合物存在下进行。若在这些促进化合物存在下对Hb进行蛋白酶处理，可实现蛋白酶处理的高效率和缩短。另外，由于可高效地进行蛋白酶处理，例如，也不需要增加处理中使用的蛋白酶的量。
上述促进化合物可举出下述式(I)所示的化合物。
R-X    …(I)
上述式(I)中，R为碳原子数9以上的烷基、取代烷基、酰基或取代酰基。具体例子可举出碳原子数9～16的直链烷基或直链酰基。碳原子数10～40且主链碳原子数9～16的支链烷基或支链酰基、或被环烷基取代的直链烷基(例如，环烷基的碳原子数为3～8，除环烷基外的直链的碳原子数为4～13)等。上述环烷基可举出例如环己基、环戊基、环丁基等。上述式(I)中，X为糖残基，优选为例如单糖或二糖的残基。上述单糖可举出例如甘露糖苷、葡萄糖苷、硫代葡萄糖苷等。二糖可举出麦芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷、硫代麦芽糖苷等。这些糖的构象可为α、β、D、L的任意一种。另外、键合在糖的环结构上的氢以及OH基的氢可被例如Na、K、卤素等取代。此外，本发明中，将介于R与糖残基的环结构的键间的原子(例如，-O-、-S-等)看作糖残基的组成部分。
上述式(I)促进化合物的具体例子可举出，例如，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷)、6-环己基己基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯(β-D-吡喃果糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷单十二酸酯)、正癸基-β-D-麦芽糖苷(正癸基-β-D-麦芽吡喃糖苷)、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷(正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷)、5-环己基戊基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷、十六烷基-β-D-麦芽糖苷、以及3-氧十三烷基-α-D-甘露糖苷等。其中，优选上述式(I)中R(烷基链)的碳原子数为12以上的正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、十六烷基-β-D-麦芽糖苷等。另外，若R的碳原子数相同时(例如、碳原子数相同的烷基与酰基)，更优选为酰基、如优选正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷)。
蛋白酶处理的反应液中，上述促进化合物的添加比例例如在0.01～200mM的范围，优选为0.4～100mM。上述反应液中Hb浓度为0.005mM时，上述促进化合物的添加比例例如在0.4～100mM的范围，优选为1～100mM。此外、上述促进化合物与蛋白酶的添加顺序没有任何限制，可同时添加，也可以顺序不同地添加二者。
蛋白酶的处理条件，如上所述无特别限制，同时存在促进化合物时，其处理时间无限制，尤其是上限不受限制，例如，可进行0.1～60分钟左右的蛋白酶处理。处理时间优选为0.1～45分钟，更优选为0.2～20分钟，特别优选为0.2～5分钟。在上述促进化合物存在下进行蛋白酶处理时，能更迅速地切出氨基酸或多肽，因此采用上述的处理时间即可充分进行切断处理。
另外，除上述式(I)的化合物外，上述的促进化合物例如还可举出硝基化合物。这些化合物可使用任意一种，也可两种以上同时使用。硝基化合物可举出例如亚硝酸及其盐。硝基化合物无特别限制，例如可举出亚硝酸钾、亚硝酸戊酯、亚硝酸丁酯、硝化甘油、亚硝酸钠、对硝基氯苯、三硝基甲苯、硝基苯等。进行蛋白酶处理的反应液中，上述硝基化合物的添加比例无特别限制，例如，上述反应液中Hb浓度为0.005mM时，上述硝基化合物的添加比例例如优选为0.005mM以上，更优选为0.05～2mM。
另外、在进行下一工序的FAOD处理工序之前，优选向试样中添加四唑化合物。对于血液试样这种含有抗坏血酸等还原物质的试样的情况下，例如可通过添加四唑化合物来避免其对测定的影响。这时，四唑化合物的添加时机，例如选择在蛋白酶处理前或蛋白酶处理后均可。另外，进行蛋白酶处理时，若同时存在四唑化合物，例如可促进蛋白酶的消化。上述四唑化合物无特别限制，例如，可举出2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-二氢-四唑盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-二氢-四唑盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-二氢-四唑盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-二氢-四唑盐、3，3’-(1，1’-联苯基-4，4’-二基)-双(2，5-二苯基)-二氢-四唑盐、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯基)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-二氢-四唑盐]、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑盐、2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑盐、2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨甲酰基)苯基]-二氢-四唑盐、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-双[4-二(2-磺乙基)氨甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亚联苯基)二四唑盐、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-二氢-四唑盐、2，3-二苯基-5-氰四唑盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑盐等，特别优选为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-二氢-四唑盐。
上述四唑化合物的添加量无特别限制，例如，优选每1μL试样中添加0.001～100μmol，更优选在0.005～10μmol的范围，特别优选在0.01～1μmol范围内。
(FAOD处理工序)
随后，向上述蛋白酶处理后的反应液中添加FAOD。使FAOD作用于Hb片段N末端缬氨酸的糖化部分，进行氧化还原反应。通过该FAOD处理，例如，如下所示，使结合于N末端缬氨酸的糖游离出来，生成过氧化氢。
上述FAOD无特别限制，优选能作用于α-氨基被糖化的氨基酸或多肽，催化过氧化氢与α-酮醛发生反应的酶(以下称“FAOD-α”)。这种催化反应，例如可用下述式(1)表示。
R¹-CO-CH₂-NH-R²+H₂O+O₂
→R¹-CO-CHO+NH₂-R²+H₂O₂        ...(1)
上述式(1)中，R¹指羟基或来源于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。若反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R¹)为醛糖残基，若反应前的糖为酮糖时，上述糖残基(R¹)为酮糖残基。例如，反应前的糖为葡萄糖时，虽然可通过阿马道里重排使反应后的结构转化为果糖结构，但这时糖残基(R¹)为葡萄糖残基(醛糖残基)。此糖残基(R¹)例如可表示为：
-[CH(OH)]_n-CH₂OH
，其中n为0～6的整数。
上述式(1)中，R²无特别限制，例如，为下述式(2)所示的氨基酸残基或多肽残基。
-CHR³-CO-R⁴        ...(2)
上述式(2)中，R³表示氨基酸侧链基团，R⁴表示羟基、氨基酸残基或多肽残基，例如，可用下述式(3)表示。下述式(3)中，n为0以上的整数，如上所述，R³表示氨基酸侧链基团，氨基酸侧链基团可以全部相同，也可相互不同。
-(NH-CHR³-CO)_n-OH  ...(3)
这种FAOD-α，例如，可以使用国际公开第2004/029251号小册子记载的果糖胺氧化酶、日本特开2004-275013号公报与日本特开2004-275063号公报记载的果糖胺氧化酶、青霉属来源的FAOD(日本特开平8-336386号公报)等。使用这些FAOD，例如即使β链N末端缬氨酸以外被糖化，也难以作用于缬氨酸糖化部分以外的糖化部分，因此，能以更高的精度进行HbA1c测定。
FAOD还可具有上述(1)以外的底物特异性。这类FAOD可举出例如可作用于上述被糖化的α-氨基与被糖化的氨基酸侧链基团双方的FAOD(以下称“FAOD-αS”)。具体例子可举出例如商品名FPOX-CE(キツコ一マン公司生产)，商品名FPOX-EE(キツコ一マン公司生产)，市售的商品名为FOD(旭化成公司生产)、赤霉(Gibberella)属来源的FAOD(日本特开平8-154672号公报)、镰孢菌(fusarium)属来源的FAOD(日本特开平7-289253号公报)、曲霉菌(aspergillus)属来源的FAOD(WO97/20039)等。这些FAOD例如可通过适当选择蛋白酶的种类，并且与能特异切断β链N末端氨基酸或多肽的蛋白酶进行组合，可抑制蛋白酶作用于其他糖化位点。
FAOD处理优选与上述蛋白酶处理同样地在缓冲液中进行，上述缓冲液无特别限制，可使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。FAOD处理的条件无特别限制，反应液的pH可例如为6～9，处理温度例如在10～38℃的范围，优选为25～37℃。处理时间也无特别限制，例如为0.1～60分钟，优选为0.1～5分钟。
FAOD处理的反应液中，FAOD的添加比例例如在0.01～50KU/L的范围，优选为0.5～10KU/L。FAOD的活性“U”定义为：以果糖基缬氨酸作为底物，1分钟内催化生成1微摩尔过氧化氢的酶量为1U。
(氧化还原反应的测定)
下面，对上述糖化部分与FAOD的氧化还原反应进行测定。该测定可举出例如测定由上述反应生成的过氧化氢量、或测定上述反应消耗的氧量。上述过氧化氢量的测定例如可如下进行：使用氧化物酶(POD)、通过氧化而显色的底物，通过这些与过氧化氢反应使上述底物显色，测定其显色程度。另外，过氧化氢量除可通过使用POD等的酶法测定外，还可用电学方法进行测定。
上述通过氧化而显色的底物(显色底物)无特别限制，例如，可举出N-(羧甲基氨羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯胺钠(商品名D4-64、和光纯药工业公司生产)，10-(羧甲基氨羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐(例如，商品名DA-67，和光纯药公司生产)、N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐(例如，商品名TPM-PS，同仁化学公司生产)、N-(羧甲基氨甲酰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯胺钠、邻苯二胺(OPD)、Trinder试剂与4-氨基安替比林共同组成的底物等。Trinder试剂可举出，例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除4-氨基安替比林外，还可使用氨基安替比林衍生物、香兰素二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(sulphonatedmethylbenzothiazolone hydrazone，SMBTH)等。
反应液中上述显色底物的添加比例在0.001～10mM的范围，优选为0.004～2mM。
POD反应优选与上述蛋白酶处理同样地在缓冲液中进行，可使用上述那样的缓冲液。POD处理的条件无特别限制，反应液的pH例如为5～9。处理温度例如在10～40℃的范围，优选为25～37℃。处理时间无特别限制，例如为0.1～5分钟。
POD反应液中POD的添加比例在0.01～300KU/L的范围，优选为0.5～40KU/L。另外，上述反应液中的显色底物添加比例例如在0.001～10mM的范围，优选为0.004～2mM。POD的活性“U”定义为：1分钟内能氧化1微摩尔愈创木酚的酶量为1U。
如上所述，使用显色底物时，用例如分光光度计测定其显色(例如，反应液的吸光度)即可。因过氧化氢量对应于Hb的N末端缬氨酸的糖化量(即HbA1c量，也称HbA1c浓度、糖化浓度)，从而可由测定的吸光度推算出N末端缬氨酸的糖化量。这样就能测定HbA1c量。
随后如下述式所示，通过计算Hb的N末端缬氨酸的糖化量(HbA1c量)与试样中总Hb量(Hb浓度)之比(百分比)，即可得到HbA1c％(HbA1c比例)。此外，Hb量可使用目前已知的方法或市售的试剂盒进行测定。
HbA1c％＝(β链N末端缬氨酸的糖化量/Hb量)×100
从吸光度计算N末端缬氨酸糖化量，例如可用标准曲线来进行，上述标准曲线为Hb的N末端缬氨酸的已知糖化量对吸光度作图而得到。例如，对于N末端缬氨酸糖化量已知的Hb标准液，与上述同样进行吸光度测定，作出显示该标准液的测定值与已知的糖化量的关系的标准曲线。然后在该标准曲线中代入如上测定得到的吸光度，即可算出N末端缬氨酸的糖化量(HbA1c量)。
另外，上述显色底物如上所述，无特别限制，例如，优选上述DA-67这样的、通过与过氧化氢反应生成亚甲基蓝的底物。这种显色底物所生成的亚甲基蓝，因在相对较长的波长侧(约666nm)有极大的吸收，从而，例如即使全血试样中存在在500nm附近或其以下的波长范围具有吸收的成分时，也可避免这些成分引起的吸光度变动，从而以更高的可靠性进行测定。另外，使用此类显色底物时，优选向上述反应液中进一步添加后文所述的染料物质后，再进行吸光度测定。通过同时存在有这些染料物质，能够在更长的波长侧(660nm以上)对亚甲基蓝进行检测，但具体机理尚不明确。因此，例如即使全血试样中含有在660nm处有吸收的成分，也可以避免其影响，可以更高的可靠性进行测定。此外，上述染料物质的添加时机只要是在吸光度测定前即可，其他无任何限制。例如，可在亚甲基蓝生成前或生成后添加，亦可与上述显色底物、氧化酶同时添加。
上述染料物质可举出例如5-羟基-1-(4-磺苯基)-4-(4-磺基苯偶氮)-3-吡唑羧酸或其盐(例如，三钠盐)、6-羟基-5-(4-磺基苯偶氮)-2-萘磺酸或其盐(例如，二钠盐)、3-羟基-4-(4-磺基萘偶氮)-2，7-萘二磺酸或其盐(例如，三钠盐)、7-羟基-8-(4-磺基萘偶氮)-1，3-萘二磺酸或其盐(例如，三钠盐)或水合物(例如，11/2水合物)等，这些盐或水合物可举出，例如，市售品酒石黄、食用黄5号，食用红2号，食用红102号等。此外，还可举出3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四碘螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)呫吨]-3-酮或其盐(例如，二钠盐)或水合物(例如，一水合物)、3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四溴-4，5，6，7，-四氯螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H]呫吨]-3-酮或其盐(例如，二钠盐)、4，5，6，7-四氯-3’，6’-二羟基-2’，4’，5’，7’-四碘螺[异苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H]呫吨]-3-酮或其盐(例如，二钠盐)等，这些盐或水合物，例如，可使用食用红3号，食用红104号，食用红105号等。另外，也可使用花青素聚合物(例如，市售的可可色素(Cacao color from Theobtoma cacao LINNE))与柿色素(Japanese persimmon color from Dipos pyros kakiTHUNB.)等。上述染料物质的添加比例无特别限制，但相对每摩尔显色底物，例如，为0.1～1000摩尔，优选为1～500摩尔，更加优选为2～100摩尔，另外，其在反应液中的终浓度为，例如，10^-6～0.1mol/L，其中优选为10^-5～0.05mol/L，更加优选为0.00005～0.03mol/L。
测定HbA1c量与HbA1c％时，各处理工序可分别如上所述进行，但也可采用例如以下所示的组合同时进行各处理。另外，蛋白酶、FAOD、POD、显色底物的添加顺序亦无特别限制。
1：溶血处理+蛋白酶处理
2：溶血处理+蛋白酶处理+FAOD处理
3：溶血处理+蛋白酶处理+FAOD处理+POD处理
4：蛋白酶处理+FAOD处理
5：蛋白酶处理+FAOD处理+POD处理
6：FAOD处理+POD处理
第1种HbA1c测定方法也可通过以下试剂盒进行。上述试剂盒只需能够实施上述本发明的第1种HbA1c测定方法即可，其组成不受限制，例如可举出：第1试剂为含FAOD及氧化酶的试剂，第2试剂为含有蛋白酶及显色底物的试剂。使用这种试剂盒时，例如，将含血红蛋白试样与第1试剂混合后，再添加第2试剂，蛋白酶处理、FAOD处理、显色反应即可全部开始。
上述第1试剂，除含有FAOD及氧化酶(例如，POD)外，例如，还可含有缓冲剂、上述促进化合物、上述染料物质等。另外，第2试剂，除含蛋白酶及显色底物外，例如，还可含有缓冲剂与上述染料物质。各试剂中各成分的含有比例无特别限制，但优选制备成反应液中的浓度在上述范围内。
第2种HbA1c测定方法
本发明的第2种HbA1c测定方法，含有下述(A2’)～(D)的工序：
(A2’)
向保存后的全血中添加强电解质物质的工序，上述强电解质物质的正离子为选自K⁺、Na⁺以及Mg²⁺所组成的组中的至少一种离子，且上述强电解质物质的负离子为选自Cl^-、SO₄^2-以及NO^-所组成的组中的至少一种离子(保存后的全血试样的制备)
(B)对保存后的上述含血红蛋白试样进行蛋白酶处理，切断上述含血红蛋白试样中的血红蛋白的工序
(C)使果糖胺氧化酶作用于通过上述(B)工序得到的血红蛋白片段的糖化部分的工序
(D)通过测定上述糖化部分与果糖胺氧化酶的氧化还原反应来确定HbA1c的量的工序
根据本发明的第2种HbA1c测定方法时，即使血红蛋白含有物由于保存产生二氧化碳、Hb的立体结构成为脱氧型的情况下，也可通过添加上述强电解质物质，防止保存所导致的HbA1c测定值的变动。认为这是由于：即使由于保存产生二氧化碳、Hb变为脱氧型时，也可以通过强电解质物质使与Hb结合的二氧化碳解离(除去)，由此使Hb的立体结构重新变为氧合型。
第2种HbA1c测定方法，其特征在于，向保存后的血红蛋白含有物中添加上述强电解质物质，其他工序中的条件等不受任何限制。通过向上述保存后的血红蛋白含有物中添加上述强电解质物质，由此，通常情况下，上述(B)工序在上述强电解质物质存在下进行蛋白酶处理。另外，上述(B)工序及(C)工序例如可在同一反应液中同时进行。上述(D)工序例如可与上述(C)工序(及上述(B)工序)同时进行。
下文举一个以全血作为Hb含有物进行保存的例子对本发明的第2种HbA1c测定方法进行说明。但本发明不受此例限制，例如对于稀释全血、溶血后的全血、血细胞、精制Hb等Hb含有物也可同样进行。另外，第2种HbA1c测定方法，除上述(A2’)的工序中使用本发明的制备方法来制备保存后的含Hb试样以外，不受任何限制。第2种HbA1c测定方法除特别说明外，与上述第1种HbA1c测定方法同样进行。此外，上述第2种HbA1c测定方法中的(B)～(D)的工序，分别对应上述第1种HbA1c测定方法中的(B)～(D)的工序，若无特别说明则二者为同样的工序。
(全血的保存)
首先从待测者采集全血，保存至HbA1c测定时。此外，在HbA1c测定中，保存全血并非必须步骤，但本发明的目的是为了抑制保存引起的HbA1c值的变动，因此优选在需要进行全血保存的情况下应用本发明。
该实施方式与上述第1种HbA1c测定方法不同，不需在上述糖酵解抑制剂存在下保存全血。从而，对例如采血管的种类无任何限制，例如可使用不含糖酵解抑制剂的采血管等。
(溶血处理)
对保存后的全血进行溶血处理。溶血处理的条件，例如与上述第1种HbA1c测定方法相同。此外，上述强电解质物质在溶血处理的之前、之后添加均可。
(强电解质物质的添加)
向上述溶血后的全血中添加上述强电解质物质。由此，可制备供HbA1c测定的保存后的全血试样。
上述强电解质物质可举出例如KCl、K₂SO₄、KNO、NaCl、Na₂SO₄、NaNO、MgCl₂、MgSO₄以及Mg(NO)₂。此外也可使用例如Ca(NO)₂等。其中优选KCl、NaCl、K₂SO₄、MgSO₄。另外，强电解质物质可以使用任意一种，也可同时使用两种以上。同时使用二种以上强电解质物质时，其组合不受任何限制。例如，可举出KCl与MgSO₄的组合、NaCl与MgSO₄的组合、K₂SO₄与MgSO₄的组合。本发明中，上述含强电解质物质的试剂作为处理试剂，用于减少保存后的全血中与Hb结合的二氧化碳。该处理试剂中例如还可含有蛋白酶。
强电解质物质相对于全血的添加比例例如为每1ml全血中为5～3000mol，优选为8～1000mol。另外，后一工序中的蛋白酶处理的反应液的强电解质物质的浓度例如为10～3000mmol/L，优选为40～1000mmol/L，特别优选为40～350mmol/L。上述反应液中的Hb的浓度为0.005mM时，上述强电解质物质的添加比例例如为10～3000mmol/L，优选为40～1000mmol/L，特别优选为40～350mmol/L。
另外，除上述这种未处理的全血以外，例如对稀释全血、溶血后的全血、血细胞、精制Hb等进行保存时，可用强电解质物质同样进行处理。强电解质物质的添加比例无特别限制，例如将稀释全血、溶血后的全血、血细胞、精制Hb等换算成全血的量，按上述的范围添加强电解质物质即可。其他工序亦同样。
(蛋白酶处理)
在上述强电解质物质存在下，用蛋白酶对上述溶血后的全血试样进行处理。
此外，蛋白酶处理中，上述反应液中优选含有NaOH和Tris(三羟甲基氨基甲烷)中的至少一种。通过添加这些化合物，能更加有效地抑制冻存全血试样的情况下的HbA1c变动。此外，上述第1种HbA1c测定方法中也同样。冻存的温度例如为-15℃～-80℃，通常为-80℃。
上述反应液中NaOH的添加比例例如为5～3000mmol/L，优选为30～1000mmol/L，特别优选为40～350mmol/L。另外，Tris的添加比例例如为5～3000mmol/L，优选为30～1000mmol/L，特别优选为40～350mmol/L。
蛋白酶处理后，与上述第1种HbA1c测定方法相同，通过FAOD处理、测定氧化还原反应，即可算出HbA1c。
如上所述的第2种HbA1c测定方法，例如也可使用下述的试剂盒进行。上述试剂盒只需能够执行上述本发明中第2种HbA1c测定方法即可，其具体组成不受限制。例如，可举出第1试剂为含FAOD、氧化酶以及上述强电解质物质的试剂，第2试剂为含有蛋白酶及显色底物的试剂。使用这类试剂盒时，例如将全血与第1试剂混合后，再添加第2试剂，由此，蛋白酶处理、FAOD处理、显色反应即可全部开始。
上述第1试剂，除FAOD、氧化酶(例如，POD)及上述强电解质物质外，例如还可含有上述的NaOH、Tris，此外还可含有缓冲剂、上述促进化合物、上述染料物质等。另外，第2试剂，例如，除蛋白酶及显色底物外，还可含有缓冲液、染料物质。各试剂中，各成分的含有比例无特别限制，但优选制备成反应液中的浓度在上述范围内。
以下举实施例来对本发明进行更详细的说明，但本发明不受限于此。
实施例1
将使用各种采血管采集的全血保存后，测定HbA1c％，判断是否存在HbA1c％的变动。
使用下述采血管采集健康人的全血，将上述全血在上述采血管中密封保存。4℃放置上述采血管15天后，对全血的Hb及HbA1c进行测定。
(采血管)
H管：肝素钠采血管(terumo corporation生产)
DK管：EDTA-K采血管(terumo corporation生产)
FH管：氟化钠+肝素钠采血管(terumo corporation生产)
[表1]
(第1试剂)
FPOX-CE                            1.5KU/L
POD                                10KU/L
PIPES                              30mmol/L(pH7)
正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷         2.5g/L
KNO₂                               4mmol/L
酒石黄^*                            0.15g/L
                                                          
^*5-羟基-1-(4-磺苯基)-4-(4-磺基苯偶氮)-3-吡唑羧酸三钠盐(下同)
(第2试剂)
金属蛋白酶(ア一クレイ公司生产)     1800KU/L
CaCl₂                              5mmol/L
Tris                               70mmol/L
MES                                30mmol/L(pH5.5)
十六烷基三甲基氯化铵               0.2g/L
酒石黄                             0.10g/L
DA-67(和光纯药公司生产)            0.03mmol/L
                                                      
<HbA1c％的测定方法>
将放置15日后的全血用纯化水稀释26倍，在该稀释液6.5μL中加入6.5μL纯化水作为试样。13μL该试样中加入上述第1试剂78μL，混合后37℃下孵育5分钟。将反应液在571nm/751nm波长处测定吸光度(B₁)，以及在694nm/751nm波长处测定吸光度(A₁)。随后，再往上述反应液中添加上述第2试剂19.5μL，37℃下孵育5分钟，再次将上述反应液在694nm/751nm波长处测定吸光度(A₂)。随后，如下述式中所示，从第2次的吸光度值(A₂)中减去乘以体积变化修正值[(13+78)/(13+78+19.5)]后的第1次的吸光度值(A₁)，所得值即为与全血试样中HbA1c浓度相当的吸光度(HbA1c吸光度)。此外，第1次在571nm/751nm波长处测定的吸光度值(B₁)与试样中的Hb浓度相当(Hb吸光度)。测定采用生化自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子公司制)进行。另外，作为对照，用刚采集的全血和纯化水替代全血，进行同样的吸光度测定。另外，将本操作测得的吸光度代入预先作成的标准曲线中，求出HbA1c％。上述标准曲线的作法为：用HbA1c％已知的标准试样进行相同的吸光度测定，将上述吸光度值对HbA1c％值作图。本实验结果如下述表2所示。
HbA1c吸光度＝A₂-[A₁×(13+78)/(13+78+19.5)]
[表2]

A1c/Hb＝[A1c(mAbs.)-纯化水(mAbs.)]/[Hb(mAbs.)-纯化水(mAbs.)]
如上述表2中所示，使用仅含肝素钠的采血管与含EDTA-K的采血管采集的全血，经放置后可见吸光度降低、结果导致HbA1c％降低。这是由于放置时全血中产生二氧化碳，使氧合型Hb转变为脱氧型Hb，从而蛋白酶难以作用在Hb的β链N末端侧。对此，使用含氟化钠的采血管时，即使采集后的全血经放置15天后，HbA1c％的结果也基本看不出变动。即，在氟化钠存在下，即使从患者采集的全血经过保存，保存后与刚采血后同样，不会发生HbA1c％变动，从而可实现更高精度的测定。
此外，还通过HPLC法确认了保存过程中HbA1c％没有发生变动。即，在与上述同样的条件下，用上述氟化钠采血管采集全血后，血液存于上述管中原样放置。随后采用HPL C法测定此全血的HbA1c％。测定时使用ADAMS-A1c HA-8160(ア一クレイ公司生产)。结果表示在下表中。如下表所示，可确认HbA1c％未因保存而发生变动。

实施例2
在保存后全血中添加各种添加剂，对HbA1c％进行测定，观察HbA1c％的变动。
使用肝素钠采血管(H管)采集健康人全血，此全血于冰箱中保存2周后，对全血的Hb及HbA1c进行测定。此外，HbA1c％的测定方法中，除用下述第1-2试剂替换第1试剂外，其余操作均与上述实施例1相同。下述第1-2试剂中的PIPES/KOH的配制方法为：在30mmol的PIPES中添加KOH调整至pH7，再加水至1L。
[表3]
(第1-2试剂)
FPOX-CE                       1.5KU/L
POD                           10KU/L
PIPES/KOH                     30mmol/L(pH7)
正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷    2.5g/L
KNO₂                          4mmol/L
酒石黄                        0.15g/L
添加剂                        规定量
                                           
另外，以使用下述表4中所示的添加剂(No.1～22)的体系作为评价标准，然后对用与实施例1同样的氟化钠+肝素钠的采血管(FH管)采集的全血与实施例1同样保存后，对HbA1c％进行测定。在实施例1中已经证明，使用FH管采集的全血进行保存后，能充分抑制HbA1c％的降低。因此，使用H管采集全血，并对加入了各种添加剂后的体系进行HbA1c测定，其测定值若与使用FH管采集的全血测定值相近似，则说明加入了上述添加剂的体系能防止HbA1c值的降低。实验结果如下述表5及表6所示。
[表4]