一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法.pdf

本发明提供了一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒及其构建方法和应用、一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株及其构建方法和应用、以及一种生产谷胱甘肽的方法。本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒包括GSH1和GSH2序列和一合适的载体片段；本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组菌株使用谷胱甘肽合成酶系重组质粒构建；本发明提供的生产谷胱甘肽的方法为发酵本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组菌株。使用本发明提供的共表达质粒可以构建产谷胱甘肽毕赤酵母，获得的产谷胱甘肽毕赤酵母发酵培养，获得的发酵液中谷胱甘肽产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平，提高了原料利用率、降低了生产成本和能耗，可用于工业化生产。

1、  一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括GSH1和GSH2序列和一合适的载体片段，所述GSH1和GSH2序列分别如Genebank上编号为EF633694、EF633695的序列所示。

2、  如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述GSH1和GSH2序列置于GAP启动子之下。

3、  如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包括一段与宿主菌基因组同源的片段。

4、  如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述与宿主菌基因组同源的片段为His4片段。

5、  如权利要求1-4中任一项所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A)PCR扩增获得GSH1、GSH2序列；
B)将GSH1、GSH2序列共同克隆到合适的表达载体。

6、  如权利要求1-4中任一项所述的重组质粒用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株的应用。

7、  如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述菌株为毕赤酵母。

8、  如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述毕赤酵母为GS115。

9、  一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株，其特征在于，所述菌株使用如权利要求1-4中任一项所述的重组质粒构建。

10、  如权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为毕赤酵母。

11、  如权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为GS115。

12、  如权利要求9-11中任一项所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-4中任一项所述的重组质粒转化到宿主菌的步骤。

13、  如权利要求9-11中任一项所述的重组菌株的用于生产谷胱甘肽的应用。

14、  一种生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，通过发酵培养如权利要求9-11中任一项所述的重组菌株来生产谷胱甘肽。

一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，简称GSH，由前体物质L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH1)和谷胱甘肽合成酶(GSH2)催化合成，能有效清除掉人体内的自由基，净化人体内的环境污染，增进人体健康。GSH在医药领域、食品领域和化妆品等方面均有广泛的用途。
谷胱甘肽的工业生产主要有萃取法、化学合成法、发酵法和酶法。谷胱甘肽的早期生产都采用萃取法，原料多为酵母，这是生产谷胱甘肽的经典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。化学合成法生产工艺已较成熟，但化学合成的谷胱甘肽是消旋体，需要进行光学拆分，且工艺过程存在成本高、操作复杂和环境污染等问题。酶法由于原料较贵，目前还不适于工业化生产。由于工艺及方法得到不断改进，发酵法目前已经成为生产谷胱甘肽最普遍的方法，其中以诱变处理获得高谷胱甘肽含量的酵母变异菌株来生产谷胱甘肽最为常见。Nomura等通过对酿酒酵母的诱变和筛选得到了一株高产谷胱甘肽的菌种酿酒酵母K-2，发酵产量达到了2.7g/L。Ishii等报道(1989，JP1141591)采用合成培养基发酵酿酒酵母，谷胱甘肽的产量达到了4.32g/L，这是目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平。
但利用酵母菌培养来单独生产谷胱甘肽，存在原料利用率低、成本和能耗高等问题，特别是谷胱甘肽的产量低而生产成本高的问题，因此，有必要对其加以改进，以克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒，以用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株。
本发明还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法。
本发明还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的应用。
本发明还有一个目的在于，提供一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株。
本发明还有一个目的在于，提供一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株的构建方法。
本发明还有一个目的在于，提供一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株的应用。
本发明还有一个目的在于，提供一种生产谷胱甘肽的方法。
本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒包括GSH1和GSH2序列和一合适的载体片段；所述GSH1和GSH2序列分别如Genebank上编号为EF633694、EF633695的序列所示。
根据本发明的一个优选实施例，在谷胱甘肽合成酶系重组质粒中，GSH1和GSH2编码区分别置于GAP启动子下。
根据本发明的另一个优选实施例，所述谷胱甘肽合成酶系重组质粒还包括一段与宿主菌基因组同源的片段，以用于提高整合效率。
本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法包括以下步骤：A)PCR扩增获得GSH1、GSH2序列；B)将GSH1、GSH2序列共同克隆入合适的表达载体。
本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒可用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株。
本发明提供的表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株，使用本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒构建。
本发明提供的表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株的构建方法包括将谷胱甘肽合成酶系重组质粒转化到宿主菌的步骤。
本发明提供的重组菌株可用于生产谷胱甘肽。
本发明提供的生产谷胱甘肽的方法通过发酵培养本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组菌株，生产获得谷胱甘肽。
根据本发明的一个优选实施例，表达谷胱甘肽的重组菌株为毕赤酵母GS115。
使用本发明提供的共表达质粒可以构建产谷胱甘肽毕赤酵母，获得的产谷胱甘肽联产毕赤酵母发酵培养，获得的发酵液中谷胱甘肽产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平，提高了原料利用率、降低了生产成本和能耗，可用于工业化生产。
附图说明
图1是PCR扩增获得的GSH1和GSH2的检测结果，其中，泳道1为GSH1，泳道2为GSH2。
图2是pGKG1G2的结构示意图。
图3是质粒HZ109的凝胶电泳检测结果，其中，泳道1为使用GSH2的特异性引物GAP-50和GSH2R500进行PCR扩增获得的结果，泳道2为使用GSH1的特异性引物GAP-50和GSH1R650进行PCR扩增获得的结果。
本发明构建获得的产谷胱甘肽基因工程菌株HZ109已于2008年6月23日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 208096。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。
在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的pMD18-T载体购自Takara；pPIC3.5K和pGAPZB质粒购自Invitrogen。
在本发明的下述实施例中，使用的T4 DNA连接酶购自Takara；KOD DNA聚合酶购自Toyobo；Taq DNA聚合酶购自Fermentas；限制性内切酶BamHI，BglII，EcoRV，SmaI，Kpn2I等均购自Fermentas。
在本发明的下述实施例中，使用的酿酒酵母BY4742获取自EUROSCARF；大肠杆菌DH5α购自Takara；毕赤酵母宿主菌GS115购自Invitrogen，其基因型是his4，表现为组氨酸缺陷菌株，不能在无组氨酸的MD平板上生长。
在本发明的下述实施例中，使用的YPD培养基的配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；使用的BMGY培养基的配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％酵母氮源，4×10^-5％生物素，1％甘油；MD培养基的配方为：1.34％酵母氮源，4×10^-5％生物素，1％葡萄糖。配置固体平板培养基时，按照上述配方添加2％琼脂。
在本发明的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，均按照Invitrogen公司PichiaExpression Kit手册中提供的方法进行，其中，电转杯为0.2mm，电转化仪使用bio-rad的Micropulser型电转化仪，电转化参数为SC2(1.5kV)。
在本发明的下述实施例中，GSH产量的检测参照：王春、严伟民，注射用还原型谷胱甘肽质量标准分析方法--HPLC法的建立与验证，中国临床药学杂志2005年第14卷第3期。
实施例1、共表达质粒的构建
1.1、引物设计
根据Genebank报道的GSH1、GSH2序列，设计以下4条引物：
GSH1UP：ATCGATACGATGGGACTCTTAGCTTTGGG；
GSH1DNM：CAATTGTTAACATTTGCTTTCTATTG；
GSH2UP：TTCGAAACGATGGCACACTATCCACCTTC；
GSH2DNE：GAATTCCTAGTAAAGAATAATACTGTC。
其中，GSH1UP和GSH1DNM用于扩增GSH1编码区；GSH2UP和GSH2DNE用于扩增GSH2编码区；GSH1UP和GSH2UP上的下划线表示在GSH1UP和GSH2UP上分别引入的AsuII酶切位点和ClaI酶切位点。
1.2、PCR扩增GSH1、GSH2序列
抽提获得酿酒酵母BY4742基因组。
然后，以酿酒酵母BY4742基因组为模板，分别以步骤1.1中设计的引物对GSH1UP和GSH1DNM以及引物对GSH2UP和GSH2DNE为引物对，进行PCR扩增，具体如下：
反应体系：10×KOD缓冲液5μl，2mM dNTPs 5μl，25mM MgSO₄ 2μl，上下游引物(20μM)各1μl，BY4742基因组DNA 1μl，KOD DNA聚合酶1μl，加入去离子水，至体系总体积为50μl。
反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃120s，30个循环；72℃10min。
PCR扩增产物分别进行凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。根据图1的结果，获得的产物的大小分别为1.5kb、2.0kb，符合GSH1、GSH2产物的预期大小。
1.3、表达载体的构建
1.3.1、构建预处理
由于步骤1.2中PCR反应获得的产物是平末端产物，不易进行亚克隆，因此，为便于亚克隆操作，使用Taq酶对PCR产物进行处理，为PCR产物末端加上一个突出的A，以和pMD18-T载体末端突出的T进行配对，从而使得后续的亚克隆步骤可以获得更高的连接克隆效率，具体步骤如下：
使用胶回收试剂盒纯化步骤1.2中获得的PCR产物，然后加入Taq酶，于72℃反应10min，反应体系如下：
10×Taq缓冲液5μl，2.5mM dATPs 4μl，25mM MgCl₂ 3μl，PCR平末端片段20uL，Taq DNA聚合酶0.2uL，加去离子水至体系总体积50uL。
反应结束后，使用胶回收试剂盒纯化回收反应产物。
将获得的纯化后的反应产物和pMD18-T载体，用T4 DNA连接酶，于16℃连接过夜，反应体系如下：
5μL处理后的PCR产物，0.5μLpMD18-T载体，1μLT4 DNA连接酶缓冲液，3μL无菌去离子水，0.5μL T4 DNA连接酶。
连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，培养后挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得两个质粒pMDGSH1、pMDGSH2。
质粒pMDGSH1和pMDGSH2经测序验证，分别包含GSH1，GSH2编码区(GSH1，GSH2编码区序列分别如SEQ ID NO：1、2所示)，而且编码区无氨基酸残基突变。
1.3.2、表达载体的构建
分别用AsuII/SalI和ClaI/SalI从pMDGSH1、pMDGSH2中将GSH1和GSH2两个基因的编码区切出(AsuII和ClaI位点通过引物在PCR扩增时引入，SalI位点在pMD18-T载体上)，分别连接入AsuII/XhoI酶切的表达载体pGAPZB(购自Invitrogen，含有GAP启动子)，获得两个质粒pGZG1、pGZG2。
质粒pGZG1和pGZG2经测序验证，分别包含GSH1，GSH2编码区(GSH1，GSH2编码区序列分别如SEQ ID NO：1、2所示)，其中，GSH1、GSH2编码区分别置于GAP启动子下，而且编码区无氨基酸残基突变。
由于GAP启动子是组成型强启动子，因此，这两个质粒可以分别组成型表达GSH1和GSH2。
1.4、共表达质粒的构建
BamHI/BglII酶切pGZG2质粒，获得GSH2表达框，然后将其连入使用BglII酶切的pGZG1质粒，获得pGZG1G2质粒。该质粒可以组成型共表达GSH1和GSH2。
1.5、共表达质粒优化
由于pGZG1G2转化毕赤酵母，能与基因组发生重组的同源区仅数百bp，整合效率较低，不便于操作，因此需要对pGZG1G2进行优化改造。改造的方式是在此质粒中引入一段与宿主菌基因组同源的序列。较长的同源区可以获得较高的整合效率。出于操作性的考虑，同源区片段的长度以0.5-10kb为宜。优选同源区片段长度为1-8kb，较优的为2-6kb，更优的为3-5kb.
本实施例使用的宿主菌为GS115，此宿主菌带有一个突变型的his4基因；因此，优化改造的方式是在共表达质粒中引入野生型的His4基因片断作为同源区。引入的野生型His4基因片段和宿主菌所带的突变型his4基因片段除了数个碱基对的差异外，几乎完全相同，同源区长达大约3kb，因此可以获得较高的整合效率。
而且，转化后最终得到的重组菌将获得野生型His4基因，因而可以具备组氨酸合成能力，表现为原养型；原养型菌株更便于下一步实施发酵生产。
具体优化改造过程如下：
EcoRV切质粒pPIC3.5K，获得大小为5.0kb的、包含了His4的片段，然后将该片段的平端连入使用SmaI单酶切的pGZG1G2，从而获得质粒pGKG1G2。将质粒pGKG1G2进行测序，并对测序结果进行分析获得pGKG1G2的结构示意图，结果如图2所示。该质粒中，GSH1和GSH2编码区分别置于两个GAP启动子下。根据图2及SDS-PAGE的检测结果，质粒pGKG1G2可以组成型共表达GSH1和GSH2。
虽然以上仅以野生型His4基因片段为例描述了共表达质粒pGZG1G2的优化，本领域的技术人员容易理解，使用其它与宿主菌基因组同源的片段同样可以实现提高整合效率的目的。退一步说，即使不对共表达质粒进行优化改造，也不会影响本发明的实施，区别仅仅在于整合的效率相对较低。
实施例2、产谷胱甘肽毕赤酵母菌种的构建
过夜培养带有质粒pGKG1G2的大肠杆菌，抽提pGKG1G2质粒，并用Kpn2I线性化。然后将线性化处理后的pGKG1G2质粒，电转入宿主菌GS115(his4)。电转后的溶液涂布于不含组氨酸的MD平板上，于30℃培养至转化子长出。其中，由于GS115(his4)是组氨酸缺陷菌株，不能在无组氨酸的MD平板上生长，因此，平板上生长出的转化子均为转化了pGKG1G2质粒的毕赤酵母。
随机挑取若干转化子，摇瓶发酵培养，选取产量较高的两株毕赤酵母菌株，将其中一株命名为HZ109，另外一株命名为HZ117。其中，HZ109已于2008年6月23日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 208096。
同时，EcoRV酶切质粒pPIC3.5K获得5.0kb片段，用此片段转化GS115获得一株菌株，命名为HZ100。HZ100做为空白对照。
设计一组特异引物：
GAP-50：TGGTTTCTCCTGACCCAAAG
GSH1R650：TCCTGATGGATGCTGTCAAG
GSH2R500：GGCCTGCAAATGACACTGAC
其中，GAP-50和GSH1R650用于PCR检测GSH1的插入；GAP-50和GSH2R500用于PCR检测GSH2的插入。
抽提HZ109和HZ117的总DNA，分别使用引物GAP-50和GSH1R650、GAP-50和GSH2R500作为引物对，进行PCR反应，将PCR扩增获得的产物经过琼脂糖凝胶电泳，结果显示均获得了长度分别为0.7kb，0.5kb的片段，确证GSH1、GSH2表达框均已插入，其中，HZ109获得的结果电泳的具体结果如图3所示。
根据上述结果，HZ109和HZ117均具有组氨酸合成能力，且插入有GSH1、GSH2表达框；HZ100具有组氨酸合成能力，但没有转入GSH1、GSH2表达框。
实施例3、HZ109和HZ117摇瓶发酵产谷胱甘肽
将于30℃，在YPD平板上生长三天的HZ109、HZ117和HZ100(作为对照)单菌落，分别接入5mLYPD培养基中，于30℃，200rpm培养过夜。
取0.25mL菌液转接入25mL BMGY培养基，于30℃，200rpm培养96h，分别于第24h、48h、72h补加甘油至1％，添加前体L-半胱氨酸至0.01mol/L，并于发酵第48h、72h、96h取样，检测培养液中的GSH产量，检测结果如表1所示。
表1、不同时段的HZ109、HZ117和HZ100中GSH产量

根据表1的结果，HZ109、HZ117中GSH的产量都达到对照HZ100中GSH的产量的二倍左右，且产量基本相近，故在下一实施例中，仅选取摇瓶发酵后期产量相对稍高的HZ109进行发酵罐发酵。
实施例4、HZ109发酵罐发酵生产谷胱甘肽
将于30℃，在YPD平板上生长三天的HZ109单菌落，接种至30ml的YPD培养基中，于30℃，240rpm培养20h；然后，接入320ml的YPD培养基中，于30℃，240rpm培养8h，再接入3.15L的发酵培养基BMGY中(7.5L发酵罐)，并添加消泡剂聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚(即泡敌GPE)至终浓度为0.01％，于30℃进行发酵，发酵过程中流加甘油，以满足细胞生长需要，同时，通过流加氨水，控制pH为6.0。发酵到30h时开始添加30g L-半胱氨酸，继续发酵至70h时停止发酵。
采用上述方法，进行平行实验，并分别取样检测发酵液中的谷胱甘肽产量，检测结果显示，在上述平行实验中，发酵液中谷胱甘肽产量达到4.5～6.0g/L以上，均高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的4.32g/L的最高水平。
综上所述，使用本发明提供的共表达质粒可以构建产谷胱甘肽毕赤酵母，获得的产谷胱甘肽毕赤酵母发酵培养，获得的发酵液中谷胱甘肽产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平，提高了原料利用率、降低了生产成本和能耗，可用于工业化生产。虽然，在本发明的实施例中，未优化的共表达质粒没有用于转化毕赤酵母，但由于优化的共表达质粒与未优化的共表达质粒的区别仅在于，优化的共表达质粒更容易进行转化毕赤酵母的操作，二者对转化后的菌株的谷胱甘肽的产量没有影响，这对本领域的技术人员而言，是显而易见的，因此，使用未优化的共表达质粒转化毕赤酵母，以及获得的转化后的毕赤酵母，同样应当属于本发明的范围。同样，引入其他同源片段进行改造获得的共表达质粒，以及使用此类共表达质粒转化毕赤酵母，以及获得的转化后的毕赤酵母，同样也应当属于本发明的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心
<120>一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法
<130>P5081026
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2087
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>1
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