鉴定蕲蛇的PCR方法及其特异引物.pdf

本发明属于中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及到一种能够特异鉴定蕲蛇的PCR方法及其特异引物。使用此方法鉴别蕲蛇的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品真伪的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于蕲蛇药材、含有蕲蛇的制剂以及蕲蛇活体材料的快速鉴定。

1、  一种鉴定蕲蛇的特异引物P1、P2，其序列为：
P1：5’-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3’
P2：5’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3’

2、  一种蕲蛇的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
a)从所述材料中提取得到DNA样品；
b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95℃预变性5min后，进行30次循环(95℃ 30s，60-63℃ 45s)，后延伸72℃ 5min，获得扩增产物；
c)电泳所述扩增产物，如果存在分子量343bp的单一DNA条带，则确定所检材料为蕲蛇。

鉴定蕲蛇的PCR方法及其特异引物
技术领域
本发明涉及中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及一种能够特异鉴定蕲蛇的PCR方法及其特异引物。主要用于蕲蛇药材、含有蕲蛇的制剂以及蕲蛇活体材料的快速鉴定。
背景技术
蕲蛇为中国药典(2005年版)一部收载的一种常用中药，来源于蝰科动物五步蛇Agkistrodon acutus Güenther的干燥体。有祛风，通络，止痉之功效。用于风湿顽痹，麻木拘挛，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风疥癣(中国药典.一部.2005.258))。
蕲蛇作为贵重动物药材的临床功效确切，但商品来源复杂、药材形态鉴别困难，我们在收集实验材料的同时对市场上蕲蛇药材的流通情况进行了调查。商品流通中多以中介蝮蛇、山烙铁头、蝰蛇等经过加工后混作正品蕲蛇销售。这些品种与蕲蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥处理，皮上的花纹特征、颜色变得模糊，使得辨认困难，如百花锦蛇、玉斑锦蛇、滑鼠蛇、眼镜蛇等其大小、形态特征有与蕲蛇相近之处，这也是造成鉴定困难的另一重要原因。为了获取暴利，造假的手段越来越高明，一些造假者将蕲蛇蛇皮黏合其他动物的肉以增加份量。因此就要求鉴别者具备丰富的鉴别经验，如仅根据形态特征来进行鉴别已不能满足市场的需求。随着分子生物学技术的发展，我们曾利用PCR技术对蕲蛇的鉴别鉴别进行了一些探索(唐晓晶，冯成强，黄璐琦，钱忠直，崔光红，张继.蕲蛇及其混淆品高特异性PCR鉴别.药物分析杂志，2006，26(2)：152～155)，但原有方法需要配制大量的试剂，且操作时间长，不具有推广实用性。因此，建立更快捷和特异的方法是解决蕲蛇乃至中药材真伪鉴别迫切的需求。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR引物及方法。
发明内容
本发明提供了一种蕲蛇的PCR引物及其鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、样品量少、能快速准确的鉴定蕲蛇药材、粉末制剂以及活体材料，特别适用于鉴定因加工而导致DNA含量极少、形态破碎的中药真伪的鉴定。
一种鉴定蕲蛇的特异引物P1、P2，其序列为：
P1：5’-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3’
P2：5’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3’
一种蕲蛇的PCR鉴定方法，包括下列步骤：
a)从所述材料中提取得到DNA样品；
b)用P1、P2为引物进行PCR扩增，PCR反应参数为95℃预变性5min后，进行30次循环(95℃30s，60-63℃45s)，后延伸72℃5min，获得扩增产物；
c)电泳所述扩增产物，如果存在分子量343bp的单一条带，则确定所检材料为蕲蛇。
本发明采用试剂盒提取DNA的方法，不需配制任何试剂，使得提取时间大大缩短，样品量只需0.1g，可以为蛇体的任何部分。同时采用两步法PCR，使得PCR过程只需1.5h即可完成，整个鉴别过程只需3h。综上所述，本发明提供了快速准确鉴定蕲蛇的PCR引物及方法，以蕲蛇DNA为模板，能将蕲蛇从与其亲缘关系极近的其他的蛇类中，高效、准确地鉴定出来，为蕲蛇鉴定提供了一种实用的技术。
附图说明
图1为蕲蛇药材及其混淆品PCR鉴别结果
1.阳性对照2.蕲蛇3.虎斑颈槽蛇4.三索锦蛇5.双全白花蛇6.灰鼠蛇7.滑鼠蛇8.红点锦蛇9.王锦蛇10.赤链华游蛇11.中国水蛇12.短吻蝮蛇13.百花锦蛇14.眼镜蛇15.赤练蛇16.铅色水蛇17.金环蛇18.山烙铁头蛇19.黑眉锦蛇20.环纹华游蛇21.乌梢蛇22.金钱白花蛇23.阴性对照24.空白M.DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp
图2为8个不同批次的蕲蛇药材PCR鉴别结果
1.阳性对照2-9.蕲蛇(顺序见表1)10.阴性对照11.空白M.DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp
具体实施方式
1材料
蕲蛇样品来自河北安国地区、北京同仁堂药店、北京金象大药房、北京阳光同仁大药房、北京京隆堂药店等，详见表1。样品均经中国药品生物制品检定所中药室标本馆张继馆长鉴定。
表1样品来源表


2特异引物设计
搜索GENBANK中蕲蛇及其常见混淆品百花锦蛇、玉斑锦蛇、滑鼠蛇、眼镜蛇等20余种蛇的细胞色素b(cytb)序列，用DNAMAN进行同源比对，根据其变异区设计一对特异引物P1、P2，序列如下：
P1：5’-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3’
P2：5’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3’
3DNA提取
采用Promega公司DNA提取试剂盒Wizard SV Genomic DNAPurification System提取各种材料的DNA。
①取供试品适量(约0.5g)，去除表面污染物，液氮中充分研磨使成粉末，取适量(约0.1g)至1.5mL离心管中；
②加入275μL消化液，比例如下：
Nuclei lysis Solution    200μL
0.5M EDTA                50μL
Proteinase K(20mg/mL)    20μL
RNaseA Solution          5μL
                                             
总体积                   275μL
③放置55℃水浴中温育0.5～1h；
④取出后加入250μL Wizard SV Lysis Buffer，混匀后将溶液全部转移入过滤柱中，10000rpm离心3min；
⑤弃掉过滤液，加入800μL洗脱液，10000rpm离心1min；
⑥弃掉过滤液，反复清洗3次，每次10000rpm离心1min；
⑦弃掉最后一次过滤液后再离心2min，将过滤柱转移入新的离心管中，加100μL无菌双蒸水，室温放置2min后10000rpm离心2min。滤液-20℃保存备用。
4PCR扩增
PCR反应在200μL PCR反应管中进行，反应总体积25μL，包括以下试剂：
10×PCR缓冲液                              2.5μL
dNTP(2.5mM)                                2μL
引物(10μM)                                0.5μL
Taq DNA聚合酶(Takara公司，ExTaq 5U μL^-1)  0.2μL
模板(约100ng)                              0.5μL
无菌双蒸水                                 19.3μL
                                                               
总体积                                     25μL
PCR鉴别极易出现假阳性和假阴性结果，为防止误差的产生，PCR鉴别须建立严格的阳性、阴性及空白对照。阳性对照为中国药品生物制品检定所提供的正品蕲蛇，选用与蕲蛇DNA序列最为接近的眼镜蛇作为阴性对照，空白对照为无菌双蒸水。按样品同样的方法进行DNA提取和PCR扩增。
PCR反应液配制完后，以4000r/min离心10s，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应：95℃5min进行30次扩增反应循环(95℃30s，60-63℃45s)，然后72℃5min。
取8μL扩增产物，采用1.5％的琼脂糖凝胶，在电压70～100V下电泳20分钟后在凝胶成像系统下观察并拍照。其涉及其20个相关混淆品的电泳如图1，8批蕲蛇的电泳如图2。结果可见，蕲蛇能扩增343bp的单一条带，而混淆品没有扩增条带，表明该体系能将蕲蛇与其混淆品准确的分开，不同来源的蕲蛇样品能实现准确的鉴别。
SEQUENCE LISTING
<110>中国中医科学院中药研究所
<120>鉴定蕲蛇的PCR方法及其特异引物
<130>-
<160>2
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>P1
<222>(1)..(28)
<400>1
gcaattcact acacagccaa catcaact                    28
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>P2
<222>(1)..(24)
<400>2
ccatagtcag gtggttagtg atac                        24