快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒.pdf

本发明公开了一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种人兽共患传染病病原体的基因检测技术，适用于弓形虫定性定量检测。本发明由DNA提取液、标准阳性模板、荧光定量PCR反应液、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品组成。本发明定量准确，检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可替代传统的病原学检测方法。

1、  一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
由DNA提取液，荧光定量PCR反应液，标准阳性模板pMD-B1、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品组成。
正向引物Toxo-BF：5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；
反向引物Toxo-BR：5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′；
标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫保守基因的223个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

2、  根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是：
荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正、反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成。

3、  根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是弓形虫标准阳性模板所包含的B1基因的核苷酸序列为：
5′-tccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactgcaagagaagtatttgaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgtacgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagaggtccgcccccacaagacggctgaagaa-3′。

4、  权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)DNA提取液：配制裂解缓冲液，包括如下组分：0.1M Tris-HCl(pH 8.0)，0.1～0.15M NaCl，0.1～0.5M EDTA(pH 8.0)和1％～4％SDS。配制蛋白酶K的贮存液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4μg/μl，即为DNA提取液。
2)定量PCR反应液包括：由SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成；
3)标准阳性模板pMD-B1：标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫高度保守基因B1基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10¹⁰拷贝/μl，使用前进行10倍梯度的系列稀释；
4)弓形虫B1基因特异性引物：
正向引物Toxo-BF：5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；
反向引物Toxo-BR：5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′；
5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒
技术领域
本发明属于人兽共患传染病病原体的检测技术领域，尤其涉及一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，适用于弓形虫定性定量检测。
背景技术
弓形虫是一种广泛寄生于人和动物有核细胞中的寄生性原虫，猫科动物为其终末宿主，人和许多脊椎动物为其中间宿主。该虫呈世界性分布，人和许多动物均能感染，引起人兽共患的弓形虫病。由于其对人类健康及农牧业生产存在很大的潜在危害，快速、准确地诊断弓形虫病显得十分重要。
临床检测上，传统的病原学检查方法具有检出率不高、培养时间长等不足，传统的血清学方法由于简便、快速、敏感性尚佳，仍然是各实验室的常用方法，但血清学只是感染的间接标志，当机体免疫力低下时，则很难获得可供诊断的血清学结果。由于人群感染弓形虫的普遍性，血清学检测对现症感染的诊断价值受到一定限制。常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使其在临床诊断上受到一些限制，因此急需一种精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
发明内容
本发明提供一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，其目的在于克服现有技术存在检出率不高、培养时间长等缺点和不足，用于弓形虫的快速检测。
本发明提供的快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒，包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板弓形虫pMD-B1、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品等组成；其中，
标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫高度保守B1基因的223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖；
荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成；
弓形虫标准阳性模板所包含的B1基因的核苷酸序列为：
5′-tccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactgcaagagaagtatttgaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgtacgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagaggtccgcccccacaagacggctgaagaa-3′。
本发明所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1、DNA提取液：配制裂解缓冲液，包括如下组分：0.1M Tris-HCl(pH8.0)，0.1～0.15M NaCl，0.1～0.5M EDTA(pH8.0)和1％～4％SDS。配制蛋白酶K的贮存液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4μg/μl，即为DNA提取液。
2、定量PCR反应液包括SYBR-Green I，正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl₂、dNTPs及无菌双蒸水组成。
3、标准阳性模板弓形虫pMD-B1：标准阳性模板pMD-B1是含有弓形虫高度保守基因B1基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10¹⁰拷贝/μl，使用前进行10倍梯度的系列稀释。
4、弓形虫B1基因特异性引物：正向引物Toxo-BF：5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；反向引物Toxo-BR：5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′。
5、阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。
本试剂盒的工作原理
SYBR-Green I是一种常用的实时定量PCR技术，它巧妙地利用了PCR技术高效扩增、光谱技术的敏感性及定量分析的优点，通过实时检测扩增过程中荧光物质强度的变化来进行PCR产物的分析。SYBR-GreenI具有以下特点：1)它能结合到双链DNA的小沟部位；2)它只有和双链DNA结合后才发出荧光；3)PCR反应中的高温变性时，DNA双链分开，无荧光：4)PCR反应中的低温复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR-Green I发荧光，此阶段采集信号，荧光量的增加与PCR产物的累积量呈比例关系。对弓形虫的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
本发明的使用方法包括以下步骤：
1、对贮存液浓度为10¹⁰拷贝/μl标准阳性模板pMD-B1进行10倍的系列稀释，制备阳性标准品；
2、从待测标本中提取DNA；
3、分别取步骤2中的DNA和同样量的系列稀释的步骤1中的两种阳性标准品加入到荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；
4、通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。
以下实验表明试剂盒可以快速检测弓形虫：
(1)取新鲜或冰冻动物组织块100mg(0.5cm³)，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K(500μg/ml)20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，用酚-氯仿-异戊醇(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)抽提2次，无水乙醇沉淀后用30μl TE(0.1M Tris-HCl，0.001M EDTA pH8.0)溶解，取1μl做PCR反应。
(2)将阳性标准模板系列稀释为10⁹拷贝/μl、10⁸拷贝/μl、10⁷拷贝/μl、10⁶拷贝/μl、10⁵拷贝/μl。
(3)分别取荧光定量PCR反应液各24μl，取第①步所得弓形虫DNA和第②步稀释的弓形虫阳性标准模板各1μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性60s；95℃ 15s，58℃15s，72℃ 45s，扩增40个循环。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待测样品拷贝数。结果为：弓形虫标准阳性模板10⁹拷贝/μl、10⁸拷贝/μl、10⁷拷贝/μl、10⁶拷贝/μl、10⁵拷贝/μl的Ct值分别为19.15，22.80，25.48，28.86，32.28；阴性对照为0。
反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明不同批次之间的检测结果具有可比性和良好的重复性。
从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品(DNA)的检测仅需2个小时就能完成。
本发明与现有技术相比其积极效果在于：具有定量准确、检测速度快，仅2小时、特异性好，灵敏度高、使用步骤简单，可重复性好，可以弓形虫样品进行定性定量检测，可以替代传统的病原学和血清学方法。
附图说明
图1：弓形虫标准阳性模板10⁹拷贝/μl、10⁸拷贝/μl、10⁷拷贝/μl、10⁶拷贝/μl、10⁵拷贝/μl不同稀释度PCR扩增结果。1为DL2000 Marker；2～9分别为弓形虫标准阳性模板10⁷拷贝/μl、10⁶拷贝/μl、10⁵拷贝/μl、10⁴拷贝/μl、10³拷贝/μl、10²拷贝/μl、10拷贝/μl、1拷贝/μl稀释度的PCR扩增产物。
图2：质粒pMD-B1的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明：
下列实例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：试剂盒组成与配制
(1)DNA提取液：配制裂解缓冲液，包括如下组分：0.1M Tris-HCl(pH8.0)，0.1～0.15M NaCl，0.1～0.5M EDTA(pH8.0)和1％～4％SDS。配制蛋白酶K的贮存液，浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体，终浓度为4ug/ul，即为DNA提取液。
(2)荧光定量PCR反应液：配制反应液SYBR-Green I(10×)0.5μl，10×buffer2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，MgCl₂(2.5mmol/L)3.5μl，正向引物和反向引物各1μl(10μmol/L)，无菌双蒸水14.3μl。
(3)标准阳性模板贮存液：浓度为10¹⁰拷贝/μl标准阳性模板pMD-B1。
(4)阴性指控标准品：为无菌双蒸水。
实施例2：试剂盒的特异性试验
用经过DNA有效性验证毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、利什曼原虫、柔嫩艾美尔球虫等5种对照阳性样品各1μl为模板进行荧光定量PCR反应，同时设空白对照组和阳性对照组。
PCR扩增条件为循环条件为：95℃预变性60s；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃45s，扩增40个循环。
结果只有弓形虫检测有扩增曲线，而毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、利什曼原虫、柔嫩艾美尔球虫均无扩增曲线。将弓形虫经三次重复，溶解曲线的溶解温度稳定，说明目的基因PCR扩增产物特异性较好；获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，均与目的条带大小(223bp)相近。上述结果说明试剂盒具有较好的特异性。
实施例3试剂盒的敏感性试验
首先将计数后的弓形虫速殖子DNA进行稀释，检测其总DNA含量，采用倍比法作10×，100×，1000×，2000×，4000×，8000×稀释弓形虫DNA，各1μl为模板进行荧光定量PCR反应，同时设空白对照组。
PCR扩增条件为循环条件为：95℃预变性60s；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃45s，扩增40个循环。
通过实验结果确定试剂盒的敏感性，通过6个稀释度的扩增曲线，表明该荧光定量PCR试剂盒最多能检测到0.5个弓形虫。