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一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，它依次包括以下步骤：(1)土壤样品的梯度稀释；(2)选择性增菌培养；(3)DNA提取；(4)PCR扩增及扩增产物检测；(5)查MPN表并根据公式计算得出结果本发明采用了MPN的方法，实现了环境样品中沙门氏菌定量检测的需要；采用选择性增菌培养和特异性PCR检测的方法，避免了其他微生物的干扰、提高了检测的灵敏度和特异性，与现有的方法相比，灵敏度可以提高两个数量级以上。此外，本发明还缩短了检测的时间、减轻了工作量，而且可以进行大批量样品的检测。

1、  一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)土壤样品的梯度稀释；(2)选择性增菌培养；(3)DNA提取；(4)PCR扩增及扩增产物检测；(5)查MPN表并根据公式计算得出结果；所述的步骤(4)中PCR反应体系为反应条件(25ul)：10×PCR缓冲液2.5ul，25mmol/LMg²⁺1.5ul，2.5mmol/L dNTP 2.0ul，10.0umol/L引物各1.0ul，5U/ul TaqDNA聚合酶0.5ul，待测沙门氏菌模板1.0ul，其中特异性引物为：
正向引物I ttrC-13；5’-[ACTGCCGATAAATGCACGTT]-3’
反向引物II ttrB-1；5’-[CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA]-3’。

2、  根据权利要求1所述的一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，其特征在于(1)土壤样品的梯度稀释过程包括：称取5.00g土样加入盛有45ml无菌水的250ml三角瓶中，振荡10分钟，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液，从而制备出系列梯度稀释液。

3、  根据权利要求1所述的一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，其特征在于(2)选择性增菌培养过程包括：每个稀释度取100μL悬液加入到灭菌的900μL氯化镁孔雀绿液体培养基，42±1℃水浴培养18-24h，每个稀释度设三个重复。

4、  根据权利要求1所述的一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，其特征在于(3).DNA的提取过程包括以下步骤：培养好的菌悬液转移到经灭菌的1.5ml离心管中，13000r/min离心2min，弃去上清液；再加入1ml无菌水，盖严管盖，反复颠倒离心管数次，以混合内容物；13000r/min离心2min，弃去上清液，加入10ul超纯水，沸水煮7分钟，然后13000r/min离心2min取上清液，完成DNA提取，短时间内使用4℃保存，长时间使用需要-20℃保存。

5、  根据权利要求1所述的一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，其特征在于(4)PCR扩增过程包括以下步骤：25ul PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5ul，25mmol/L  Mg²⁺1.5ul，2.5mmol/L dNTP 2.0ul，10.0umol/L引物各1.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.5ul。扩增程序为：95℃预变性1min；33循环(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec)；72℃补平4min。

6、  根据权利要求1所述的一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，其特征在于土壤样品梯度稀释后采用三管或五管平行法，每个稀释度做三个或五个平行样。

一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法
一、技术领域
本发明属于生物技术中土壤微生物检测领域，本发明公开了一种针对土壤和环境中沙门氏菌(Salmonella)快速定量检测的方法。
二、背景技术
沙门氏菌是引起人类胃肠炎的主要病原菌之一，近年来由于沙门菌人畜共患的生态特征及其所引发的食源性腹泻发病率上升而使之成为世界卫生组织(WHO)广泛关注的公共卫生问题，是世界公认的重要病原菌。2008年美国圣保罗沙门氏菌感染疫情暴发，沙门氏菌感染蔓延至23个州，228人感染，25人住院，1人死亡。美国联邦食品与药物管理局(FDA)证实是墨西哥辣椒受沙门氏菌感染所致。土壤中的沙门氏菌存活时间长，有关文献指出土壤中沙门氏菌存活时间长达三个月之久。因此准确、快速地检测土壤和环境中的沙门氏菌，对于防止沙门氏菌污染扩散具有十分重要的意义。
土壤中沙门氏菌检测一直采用医疗卫生和食品检测所用的方法，也即利用鉴别培养基结合生理生化鉴定。但是这种方法应用于土壤样品检测时，一方面由于土壤组成复杂、含有大量的微生物而对检测的灵敏度产生干扰，另一方面存在检测周期长、漏检率高、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，费时费力，不能满足大量土壤或环境样品快速检测的要求。
本发明所提供的检测方法能克服传统的微生物培养检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间缩短到只需2天，操作步骤和劳动强度也大为减缩，达到省时、省力、快速、高灵敏度的要求。本发明方法主要是将土壤微生物检测的MPN法(最大或然数，most probable number)和现代分子生物学技术聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)有机结合起来，使检测结果既能定量又能具有较高的检测灵敏性，为土壤和环境中沙门氏菌检测提供了一个稳定、实用的检测方法。
三、发明内容
发明目的：本发明提供一种能快速定量检测土壤和环境样品中沙门氏菌的检测方法。
技术方案：一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法，其特征在于它依次包括以下步骤：(1)土壤样品的梯度稀释；(2)选择性增菌培养；(3)DNA提取；(4)PCR扩增及扩增产物检测；(5)查MPN表并根据公式计算得出结果；所述的步骤(4)中PCR反应体系为反应条件(25ul)：10×PCR缓冲液2.5ul，25mmol/L Mg²⁺1.5ul，2.5mmol/L dNTP 2.0ul，10.0umol/L引物各1.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.5ul，待测沙门氏菌模板1.0ul，其中特异性引物为：
正向引物I ttrC-13；5’-[ACTGCCGATAAATGCACGTT]-3’
反向引物II ttrB-1；5’-[CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA]-3’
。
土壤样品的梯度稀释过程包括：称取5.00g土样加入盛有45ml无菌水的250ml三角瓶中，振荡10分钟，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液，从而制备出系列梯度稀释液。选择性增菌培养过程包括：每个稀释度取100μL悬液加入到灭菌的900μL氯化镁孔雀绿液体培养基，42±1℃水浴培养18-24h，每个稀释度设三个重复。
DNA的提取过程包括以下步骤：培养好的菌悬液转移到经灭菌的1.5ml离心管中，13000r/min离心2min，弃去上清液；再加入1ml无菌水，盖严管盖，反复颠倒离心管数次，以混合内容物；13000r/min离心2min，弃去上清液，加入10ul超纯水，沸水煮7分钟，然后13000r/min离心2min取上清液，完成DNA提取，短时间内使用4℃保存，长时间使用需要-20℃保存。
PCR扩增过程包括以下步骤：25ul PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5ul，25mmol/L Mg²⁺1.5ul，2.5mmol/L dNTP 2.0ul，10.0umol/L引物各1.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.5ul。扩增程序为：95℃预变性1min；33循环(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec)；72℃补平4min。
土壤样品梯度稀释后采用三管或五管平行法，每个稀释度做三个或五个平行样。
将土壤或环境样品用无菌水稀释，振荡成悬液后进行倍梯度稀释，然后接种于选择性增菌培养液氯化镁孔雀绿培养基中，于42±1℃水浴培养18-24h后，采用热裂解法提取增菌液中的DNA。以沙门氏菌特异性基因序列为引物，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，扩增结果用1.0％琼脂糖电泳进行检测，产生特异性扩增条带的记为阳性，不产生特异性条带的记为阴性。然后按照MPN计算方法，以出现阳性和阴性反应所对应的稀释度，计算样品中沙门氏菌的含量。
有益效果：本发明采用了MPN的方法，实现了环境样品中沙门氏菌定量检测的需要；采用选择性增菌培养和特异性PCR检测的方法，避免了其他微生物的干扰、提高了检测的灵敏度和特异性，与现有的方法相比，灵敏度可以提高两个数量级以上。此外，本发明还缩短了检测的时间、减轻了工作量，而且可以进行大批量样品的检测。
四、附图说明
图1土壤和环境样品中沙门氏菌MPN-PCR检测流程图
本流程主要包括样品的梯度稀释、选择性增菌培养、DNA提取、PCR扩增以及MPN计算等五个环节。
图2土壤样品中沙门氏菌MPN-PCR检测结果实例(PCR扩增结果)
从图可以根据条带的分布来判断系列稀释浓度的条带近似值，进而计算出土壤中沙门氏菌的数量。
五、具体实施实例
1、样品的梯度稀释：
称取5.00g土样加入盛有45ml无菌水的250ml三角瓶中，振荡10分钟，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。土壤分散后，吸取1ml土壤悬液到9ml稀释液中混合均匀，依次按10倍稀释到合适的稀释度。稀释度按照具体样品而定。
2、选择性增菌培养：选择性增菌培养基为氯化镁孔雀绿液体培养基(配方见附表)。每个稀释度取100μL悬液加入到灭菌的900μL氯化镁孔雀绿液体培养基，42±1℃水浴培养18-24h，每个稀释度设三个重复。
3、DNA提取：
培养好的菌悬液转移到经灭菌的1.5ml离心管中，13000r/min离心2min，弃去上清液；再加入1ml无菌水，盖严管盖，反复颠倒离心管数次，以混合内容物；13000r/min离心2min，弃去上清液，加入10ul超纯水，沸水煮7分钟，然后13000r/min离心2min取上清液，完成DNA提取，短时间内使用4℃保存，长时间使用需要-20℃保存。
4、PCR扩增：
沙门氏菌特异性引物：ttrC-13/ttrB-1
引物I ttrC-13；5’-[ACTGCCGATAAATGCACGTT]-3’
引物II ttrB-1；5’-[CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA]-3’
反应体系(25ul)：
成分                用量(ul)
超纯水dH₂O          15.5
10×PCR buffer            2.5
25mmol/L  Mg²⁺            1.5
2.5mmol/L dNTP            2.0
10.0umol/L引物            各1.0
5U/ul Taq DNA聚合酶       0.5
待测沙门氏菌模板          1.0
                                     
总体积                    25.0
PCR扩增条件：
95℃预变性1min；33循环(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec)；72℃补平4min
PCR扩增产物鉴定：取扩增产物4ul，点样于1.0％琼脂糖胶电泳，以1500bp Maker作为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于0.5×TAE电泳缓冲液中电泳，用0.5ug/ml溴化乙锭染色，利用紫外凝胶成像系统进行拍照。结果见附图2。
5、MPN计算：
PCR扩增结果用1.0％琼脂糖电泳进行检测，将产生特异性扩增条带的为阳性(记为+)，不产生特异性条带的为阴性(记为-)。然后按照MPN计算方法，以出现阳性和阴性反应所对应的稀释度，计算样品中沙门氏菌的含量。
MPN计数是根据稀释系列梯度中各稀释浓度中有无待测微生物条带出现得出数量指标，再根据每个重复数量(本方法采用三管重复)中呈现阳性的个数而在相应稀释法测数统计表中查出细菌近似值。应用稀释法计数时，在浓度稀释系列中必须最后一个稀释浓度中所有重复间都呈现阴性。确定数量指标系取浓度稀释系列中所有重复都呈现阳性的最高稀释度为数量指标的第一位数，进而确定待测菌液浓度的数量级。
具体查表计算方法是：将呈现阳性的管数按稀释梯度由小到大的顺序，选择后3个连续稀释梯度(10^x、10^x+1、10^x+2)，将其排列成一个三位数(如X，X+1，X+2)称之为条带近似值(abc)。其中，第一个稀释度(即10^x)是最后一个三次重复都呈阳性的稀释度，如果第三个稀释度(10^x+2)再往下的梯度仍呈阳性，可将此稀释度重复中呈阳性的个数加到第三个稀释度(10^x+2)上。然后查阅“稀释法测数统计表”，得出对应数值，计算出1ml检测土壤样品中沙门氏菌的总数(参见《土壤微生物研究方法》，科学出版社出1985版出版)，计算公式如下：


在本实施案例中，选择10⁷、10⁸、10⁹三个稀释度，条带近似值(320)查阅“稀释法测数统计表”，得出对应数值为110。从而得出本实施案例中土壤中
在本案例中，我们还利用传统的HE培养方法进行了MPN计数。结果表明，MPN-PCR检测法比MPN-HE培养法检测极限提高了约100倍，更能反应土壤样品中实际的沙门氏菌的数量。
表1本方法所用PCR引物序列特征

氯化镁孔雀绿培养基配方：
胰蛋白胨5.0g/L，氯化钠8.0g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，孔雀石绿0.036g/L，临用时，加灭菌40％氯化镁溶液
表2每毫升稀释液细菌的近似值




序列表
<110>中国科学院南京土壤研究所
<120>一种用于土壤中沙门氏菌快速定量检测方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>1
actgccgata aatgcacgtt    20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>2
cttttttccg ccagtgaaga    20