基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157H7核酸筛查方法.pdf

本发明属于微生物检验领域，具体是一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法。利用环介导等温扩增(LAMP)技术来进行，通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对肠出血性大肠杆O157:H7进行核酸筛查。本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。

1、  一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法，利用环介导等温扩增技术来进行，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌O157:H7进行核酸筛查。

2.  根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法，其特征在于利用环介导等温扩增技术扩增肠出血性大肠杆菌O157:H7的特定靶核酸序列区域。

3.  根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法，其特征在于所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控品为相同于扩增细菌靶基因的DNA，阴性对照质控品为不相同于扩增细菌靶基因的DNA，并使用电泳分析、沉淀分析或Smartgreen荧光染料紫外灯下显色法同时检测阴阳对照和肠出血性大肠杆菌O157:H7靶基因扩增产物。

4.  根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法，针对大肠杆菌O157:H7中的genbank登录号为S83460的rfbE基因及genbank登录号为L07388的fliC基因分别设计环介导等温扩增特异性引物。

5.  根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法，其特征在于，所用的环介导等温扩增反应体系是通过优化的反应成分组成，并具有特定反应程序；其反应体系组成如下：
反应体系：2×U-LAMP反应混合液10ul，其组成为：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mMKCl、20mM(NH₄)₂SO₄、10mM MgSO₄、0.2％Triton X-100、2.4mMdNTP、1.6M甜菜碱及其他稳定剂和增强剂；10×引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，FIP为12μM，BIP为12μM，LF为5μM，LB为5μM；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl；
特定反应程序是：60℃1小时→80℃10分钟→10℃保存。

基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法
技术领域
本发明属于食品检验领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法。主要应用于肠出血性大肠杆菌O157:H7的核酸检测。
背景技术
肠出血性大肠杆菌(EHEC)是近年来新发现的危害严重的肠道致病菌。自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻暴发和流行。我国自1997年在一定范围内开展监测工作以来，已陆续有十余个省份从市售食品、进口食品、家畜家禽、腹泻病患者等分离出肠出血性大肠杆菌O157:H7，特别是1999年我国部分地区发生了肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发，表明肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻已成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。
自2006年9月14日以来在美国爆发的美国“毒菠菜”风波至今仍未平息。9月24日，美国疾病控制和预防中心宣布，美国25个州已报告出现因食用新鲜的生菠菜感染大肠杆菌的病例，共计173人染病，其中92人入院治疗，3人死亡。涉及美国25个州，随着全美范围内感染大肠杆菌人数超过100人，美国将禁食范围从袋装菠菜扩大到任何未经加工的蔬菜。这次危机给蔬菜产业带来的损失将会扩大。加州大学戴维斯分校的农业经济学家桑纳表示，此次危机将给美国的蔬菜产业带来5000万美元至1亿美元的损失。这是涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发众多事件之一。
大肠杆菌(E.coli)是一种在人和温血动物肠道内常见的细菌。大多数大肠杆菌菌株无害。然而，一些菌株可引起严重的食源性疾病。它主要通过食用被污染的食物传染给人类。O157:H7大肠杆菌是与公共卫生有关的最重要的出血性大肠杆菌的血清类型。O157:H7主要通过食用污染的食物，例如未经烹调或烹煮不透的绞碎肉制品和原料奶向人类传播。受粪便污染的水和其它食物以及食物制备期间的交叉污染(与牛肉和其它肉制品、受污染的板面和厨房用具)也将导致感染。涉及O157:H7大肠杆菌暴发的食物包括未煎透的汉堡包、风干肠、未经高温消毒的新鲜苹果酒、酸奶、奶酪和牛奶。越来越多暴发与食用水果和蔬菜(芽苗菜、生菜、凉拌卷心菜、沙拉)有关，污染可能是由于种植或处理期间的某一阶段接触到家畜或野生动物的粪便。也从水源(池塘、溪水)、井和水槽中分离出肠出血性大肠杆菌，并发现它们在粪便和水槽污垢中能够存活数月。有关于来自被污染的饮用水和游憩用水的水源性传播的报告。
目前肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测方法主要是微生物培养鉴定及多重PCR检测技术。(1)大肠杆菌培养，结果可信度高，并能做细菌药敏试验，但需时过长，应用受到限制，同时由于肠出血性大肠杆菌O157:H7属于消化道传播的烈性传染病菌，对实验室安全要求较高，不利于肠出血性大肠杆菌O157:H7的普遍筛查。(2)聚合酶链反应(PCR)，特异性较差，优点是敏感度可达98％～100％.，但是其需要PCR扩增仪、凝胶电泳等相关贵重设备，不利于现场快速测定。
21世纪初，Notomi T等开发了一种新颖的恒温核酸扩增理论，即所谓的环介导恒温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，利用一种链置换Bst DNA聚合酶在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或显色反应进行判断是否发生反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，LAMP法具有高特异性、高效性、快速、廉价(不需要特定的贵重检测设备，只需要简单结构的恒温箱)、易检测(直接进行目测判断)等特点。
发明内容
本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法，LAMP检测技术的检测高于常规检测法100-200倍，有力地解决了传统的的微生物培养鉴定方法检出率较底的问题；另外由于经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术对仪器设备要求较高(如PCR扩增仪，琼脂凝胶电泳系统等)、技术较为复杂，不利于其在基层医疗防疫、检验检疫机构的普遍应用，而LAMP检测技术只需要简单结构的恒温箱，检测时间短(0.5-1.0小时)、特异性高(针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，)等特点，可以使用基因扩增技术在现场监测中广泛使用。
本发明是这样实现的：一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸筛查方法，利用环介导等温扩增技术LAMP来进行，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌O157:H7进行核酸筛查。
利用环介导等温扩增技术来进行，通过使用两套特异性引物，利用LAMP技术体系扩增靶基因的特定区域(分别针对O157特异性抗原基因rfbE基因及H7鞭毛基因fliC基因)，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对肠出血性大肠杆O157:H7进行核酸筛查或检测。
进一步地，在本发明所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸的筛查检测方法中，在LAMP筛查过程中引入了阴阳性对照检测系统。阳性对照质控品为相同于扩增靶基因的DNA，阴性对照质控品为不相同于扩增靶基因的DNA，并使用电泳分析、沉淀分析或Smartgreen荧光染料紫外灯下显色法同时检测内对照和大肠杆菌O157:H7靶基因扩增产物。
进一步地，在本发明所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸检测方法中，针对大肠杆菌O157:H7中rfbE gene(gendbank：S83460)及fliC gene(gendbank：L07388)分别设计环介导等温扩增引物。
进一步地，在本发明所述的食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸检测方法中，所用的LAMP反应体系是一系列通过优化的反应成分组成，并具有特定反应程序。
本发明具有严格的鉴别筛查体系，以保证检测结果的准确性。该鉴别筛查诊断系统由阳性和阴性质控品，内对照质控品以及相关扩增和检测体系组成。
本发明中鉴别筛查诊断系统的阳性和阴性质控品是每批实验检测结果是否有效的重要标志。对于每批实验，必须引入一个阴性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阳性结果；对于每批实验，必须引入一个肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阴性反应。针对肠出血性大肠杆菌O157:H7的阳性质控品是人工构建的包含肠出血性大肠杆菌O157:H7待检靶序列的质粒DNA。
本发明鉴别诊断系统中的特异性扩增产物，通过核酸合成设备制备。核酸合成设备可选用不同厂家，不同型号的产品。所有引物按照LAMP引物设计原则，利用ICBgyrB数据库及RIDOM数据库寻找肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP基因序列，利用软件选取其特异性序列，利用PrimerExplorerIV软件进行进一步分析，设计一套6种引物，引物由北京擎科生物技术有限公司合成合成。肠出血性大肠杆菌O157:H7的核酸特异性引物序列、LAMP反应体系及反应程序如下：
一、大肠杆菌O157:H7的环介导等温扩增引物情况
表1针对编码O157:H7脂多糖的rfbE基因
(GenBank S83460)的LAMP反应引物序列组成


表2针对编码H7鞭毛抗原的fliC基因
(GenBank L07388)的LAMP反应引物序列组成

二、所用的环介导等温扩增反应体系是通过优化的反应成分组成，并具有特定反应程序；其反应体系组成如下：
反应体系：2×U-LAMP反应混合液10ul，其组成为：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mMKCl、20mM(NH₄)₂SO₄、10mM MgSO₄、0.2％Triton X-100、2.4mMdNTP、1.6M甜菜碱及其他稳定剂和增强剂；10×引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，FIP为12μM，BIP为12μM，LF为5μM，LB为5μM；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl；
三、特定反应程序是：60℃1小时→80℃10分钟→10℃保存。
四、检测：LAMP扩增产物取5μl，在2％的的琼脂糖凝胶进行进行电泳分析，10000r/min离心数秒进行沉淀分析，同时也可在LAMP扩增的每个管中加入1.0μl20×Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下显影。
本发明的有益效果是：该方法具有扩增效率高、检测设备要求简单、对操作人员技术要求低等特点，适合基层卫生机构、食品加工企业、检验检疫机构现场查验大规模使用。
具体实施方式
实施例1
(1)核酸提取：从37℃摇床培养10小时的菌悬液中吸取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃上清，加100μl无菌水震荡摇匀(或是从4℃冰箱中保存的平板上挑取2-3个菌落于100μl无菌水中)。100℃煮沸10min，用台式离心机以10000rpm离心5min，上清液为基因组DNA，可直接作为核酸扩增反应的模板。
(2)LAMP反应：准备上述反应体系，将反应体系混匀，分装到0.2ml的PCR反应管中，每管19ul，PCR反应管中分别加入(1)步骤抽提的模板，每管1ul，阳性对照品和阴性对照品各1ul，分别作阳性对照、阴性对照，混合均匀。放入恒温水浴箱，设定反应条件：60℃，60分钟，80℃10分钟终止反应，10℃保存，加Smartgreen荧光染料紫外灯下显色(波长302nm)。
(3)结果判定：本发明扩增产物的检测采用浊度法。在Mg²⁺作用下，LAMP扩增产生的长链核酸分子能相互交联成絮状沉淀，且沉淀的量随扩增产物的增加而增加。因此实验结果的判定可采用如下方法：
定性观察：在反应结束后，实验结果可以通过肉眼观察Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下(波长302nm)显影。结果见图1和图2。
图1是LAMP扩增E.coliO157:H7中的rfbE基因及fliC基因的沉淀图；
图2是LAMP扩增E.coliO157:H7中的rfbE基因的荧光图。
图1中管1、管2分别为E.coliO157:H7中的rfbE基因及fliC基因LAMP产物沉淀图，管3、管4分别为其阴性对照图。
图1显示了肠出血大肠杆菌O157:H7LAMP反应在10000r/min离心数秒进行沉淀分析，肉眼观察结果。
图2显示了肠出血大肠杆菌O157:H7LAMP反应在Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下(波长302nm)显影，肉眼观察结果。
其中管1为阳性质控、管2为肠出血大肠杆菌O157:H7标准菌株，其余为其它食品致病菌。
序列表
<110>中华人民共和国徐州出入境检验检疫局
<120>基于环介导的等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法
<160>29
<170>Primer explorer v4
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>1
GCGCTGTCGA GTTCTATCG                                        19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>2
ATTCCACGCC AACCAAGAT                                        19
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>3
GCAAGGTGAT TCCTTAATTC CTCTCTTTCA CACTTATTGG ATGGTCTC            48
<210>4
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>4
CATCGAAACA AGGCCAGTTT TTTACCTTCC TCAGCTATAG GGTGCTT             47
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>5
CCTCTGCGGT CCTAGTTAG                                            19
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>6
CACACGATGC CAATGTACTC                                           20
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>7
GCGCTGTCGA GTTCTATCG                                            19
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>8
TTAGTTCCGG TAGAAGCCTG A                                         21
<210>9
<211>43
<212>DNA
<213>引物
<400>9
AAACGGTTAG CAATCGCCTG ACTTCTGTCT TCTGGCTTGC GTA                 43
<210>10
<211>46
<212>DNA
<213>引物
<400>10
CTGACTCAGG CTGCACGTAA CG TTT TCACG GATACGCTGT AAGTTG        46
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>11
GTCATCCTTC GCGCTGTTA                                        19
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>12
TGTTGCACAG ACCACCGA                                         18