一种转化体及基于其制备重组人降钙素基因相关肽的方法.pdf

本发明公开了一种基于转化体制备重组人降钙素基因相关肽的方法，所述转化体宿主细胞是大肠杆菌TB1(E.coli TB1)，导入宿主细胞的表达载体为pMAL-CGRP线性载体，其中，CGRP为重组人降钙素基因相关肽基因，通过Xmn I酶切位点克隆入pMAL-c2X载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；基于该转化体的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，包括菌株培养、融合蛋白的纯化、CGRP的纯化得到具有高活性的CGRP，该方法制备CGRP成本大大降低，生产条件温和、易于控制。

1、  一种转化体，其特征在于，其宿主细胞是大肠杆菌TB1(E.coli TB1)，导入宿主细胞的表达载体为pMAL-CGRP线性载体，其中，CGRP为重组人降钙素基因相关肽基因，通过Xmn I酶切位点克隆入pMAL-c2X载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
该转化体保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 209021。

2、  一种基于权利要求1所述转化体的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，其特征在于，包括下步骤：
1)菌株培养：
在酵母培养基中培养CCTCC M 209021菌株至对数期，然后按1∶10～1∶100的比例转接于50～500L的含氨苄青霉素50mg/L的酵母培养基培养，培养到对数生长期时用IPTG诱导培养3～5小时，此时CCTCC M 209021菌株表达出MBP-CGRP融合蛋白；
2)融合蛋白的纯化：
a、诱导表达后的培养液经冰冻离心机离心，收集菌体沉淀；
b、按1g菌体加5～10ml STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，然后加入裂解液进行裂解，裂解后的菌体在4℃条件下12000rpm离心20min，收集上清；
所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；所述的裂解液：蔗糖200～500g，0.5M的EDTA 2ml，pH8.0的3M Tris-Hcl 10ml加水至1000ml；
c、上清用亲和层析柱洗脱，用洗脱液反复洗脱后收集融合蛋白洗脱峰，所述洗脱液：11g Nacl，0.5M的EDTA 2ml，pH7.4的1M Tris-Hcl 20ml加水至1000ml；
3)CGRP的纯化：
用凝血因子X a消解收集的融合蛋白洗脱峰，从融合蛋白切下CGRP，然后通过葡聚糖G25层析柱收集CGRP。

3、  如权利要求2所述的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，其特征在于，所述的裂解液为包含质量分数为1％的NP-40溶液或者质量分数为1％的SDS溶液。

4、  如权利要求2所述的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，其特征在于，用洗脱液反复洗脱后收集融合蛋白洗脱峰，然后用密理博透析膜(Millimore)透析。

一种转化体及基于其制备重组人降钙素基因相关肽的方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及人降钙素基因相关肽(CGRP)重组质粒的构建、转化体的构建，融合蛋白的表达以及目的蛋白的纯化，特别涉及一种基于转化体制备重组人降钙素基因相关肽的方法。
背景技术
降钙素基因相关肽(Cacitonin Gene-Related Peptide，简称CGRP)是1983年Rosenfeld等应用分子生物技术发现的一种生物活性多肽，是由37个氨基酸组成：Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Gly-Gly-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH₂。CGRP与降钙素来自一个共同的由2800个碱基对组成基因，其中含有5个内含子和6个外显子。该基因在不同的组织中进行基因重组：在甲状旁腺可以转录、表达成降钙素，而在神经系统可以转录、表达成CGRP。人的CGRP有α和β两种分子型式，其氨基酸的组成和排列基本相同，仅在第3、22、25为的氨基酸不同：α型为Asp、Val和Asn，β型为Asn、Met和Ser；CGRP的基因亦有α和β两种，分别表达α和β型的CGRP，均为单拷贝基因，定位在第11号染色体的短臂上。CGRP的mRNA最先翻译成分子量为16000Da、由128个氨基酸组成的CGRP前体，存贮于分泌颗粒内，释放时酶解成CGRP发挥其生物学作用。
CGRP是人体内由感觉神经末梢释放的一种重要的神经血管调节肽，它是目前已知的舒血管作用最强的内源性舒血管物质，且可抑制平滑肌细胞增殖。CGRP在CGRP能神经纤维分化成熟，CGRP能神经纤维广泛分布于中枢和外周的血管壁上，在心脏的CGRP能神经纤维一般沿心肌纤维或冠状动脉平行走向，亦可交织成网，形成神经丛。
CGRP主要分布于神经系统，亦广泛分布于心血管系统和肺组织内，正常人血浆的CGRP水平为32.9±11.7pg/ml。在心脏CGRP主要存在于心房、心室、室间隔、窦房结、房室结、乳头肌和冠状动脉壁的神经纤维内，在心脏局部副交感神经节、心内膜和外膜亦有CGRP。心内CGRP分布是不均匀的：心房高于心室，右心房高于左心房，近心外膜的含量高于近心内膜的含量。在血管系统，几乎所有的血管床均有CGRP分布，尤以腹主动脉、肠系膜动脉、颈总动脉、肾动脉、中脑动脉、基底动脉、下腔静脉、股静脉的含量为高，其含量最高达50pmol/g。CGRP能神经纤维在血管外膜或平滑肌层交织成网，包绕着整个血管，是调节心血管活动的重要的肽能神经纤维。
CGRP舒张冠状动脉和脑血管的作用不依赖内皮细胞的完整性，取出内皮细胞其舒张血管的作用依然存在，CGRP对粥样硬化的冠状动脉仍有舒张作用。CGRP舒张血管降低血压的作用可能是对血管的之间抑制作用所引起的，其作用不受预先使用使用肾上腺素受体阻断剂、胆碱能受体或组织胺受体阻断剂，利血平耗竭儿茶酚胺，切除迷走神经或前列腺素合成抑制剂的影响。CGRP对心脏具有正性变力和变时性作用，可使心率加快，心肌收缩力增强，心输出量增加。其作用对心房肌尤其明显，且较去甲肾上腺素强大。在心房、心室和血管存在有CGRP特异性受体，CGRP与其受体结合后，可以激活腺苷酸环化酶，促进细胞内cAMP水平升高发挥其生物学效应。此外，CGRP还可促进前列环素的释放的释放和细胞内外的Na⁺/Ca²⁺交换。
CGRP作为人体已知最强的扩张血管物质，其舒张作用比较临床上常用的硝酸甘油或硝普钠血管扩张作用强240倍，亦强于P物质、心钠素和异丙基肾上腺素的血管扩张作用。CGRP在临床上可减轻心绞痛，减少心绞痛发作频率，降低高血压，治疗心律失常和心力衰竭。CGRP还可以保护在缺血型情况下心脑肾细胞免受损伤，保护人重要生命器官的功能。CGRP近年来成为研究心脏和血管系统的热点，在CGRP对心律失常、急性心肌梗塞、冠状动脉造影、心肌缺氧、阿霉素性心肌损伤、高血压和血糖的调节进行了大量的探索和验证实验。鉴于CGRP对于心、脑以及血管的作用，CGRP或其拮抗剂作为药物治疗存在广泛的需求。
目前CGRP主要依靠化学合成，将氨基酸残基按照CGRP氨基酸序列合成。具有生物活性的成品含量低，作用不甚理想，价格昂贵。或者由动物心脏和肌肉为原料提取，但是生产原料有限，成本高；获得的产品纯度和比活性都很低。
发明内容
本发明解决的问题在于利用生物技术实现人降钙素基因相关肽(CGRP)的制备，包括构建CGRP重组质粒，转化宿主细胞获得稳定表达CGRP的转化体，以及纯化、制备方法。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种转化体，其宿主细胞是大肠杆菌TB1(E.coli TB1)，导入宿主细胞的表达载体为pMAL-CGRP线性载体，其中，CGRP为重组人降钙素基因相关肽基因，通过Xmn I酶切位点克隆入pMAL-c2X载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该转化体保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 209021。
一种基于上述转化体的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，包括下步骤：
1)菌株培养：
在酵母培养基中培养CCTCC M 209021菌株至对数期，然后按1∶10～1∶100的比例转接于50～500L的含氨苄青霉素50mg/L的酵母培养基培养，培养到对数生长期时用IPTG诱导培养3～5小时，此时CCTCC M 209021菌株表达出MBP-CGRP融合蛋白；
2)融合蛋白的纯化：
a、诱导表达后的培养液经冰冻离心机离心，收集菌体沉淀；
b、按1g菌体加5～10ml STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，然后加入裂解液进行裂解，裂解后的菌体在4℃条件下12000rpm离心20min，收集上清；
所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；所述的裂解液：蔗糖200～500g，0.5M的EDTA 2ml，pH8.0的3M Tris-Hcl 10ml加水至1000ml；
c、上清用亲和层析柱洗脱，用洗脱液反复洗脱后收集融合蛋白洗脱峰，所述洗脱液：11g Nacl，0.5M的EDTA 2ml，pH7.4的1M Tris-Hcl 20ml加水至1000ml；
3)CGRP的纯化：
用凝血因子X a消解收集的融合蛋白洗脱峰，从融合蛋白切下CGRP，然后通过葡聚糖G25层析柱收集CGRP。
所述的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，所述的裂解液或者为包含质量分数为1％的NP-40溶液或者质量分数为1％的SDS溶液。
所述的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，用洗脱液反复洗脱后收集融合蛋白洗脱峰，然后用密理博透析膜(Millimore)透析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明通过构建表达载体pMAL-CGRP，该载体转化到大肠杆菌后得到稳定表达pMAL-CGRP载体的，保藏编号为CCTCC M 209021的转化体。
2、构建CGRP重组质粒，该转化体稳定表达MBP-CGRP融合蛋白，在得到纯化后的融合蛋白后，用凝血因子Xa从融合蛋白切下CGRP，得到高活性的CGRP。
3、与化学合成或者生物提取CGRP相比，本发明通过现代生物工程实现了具有高活性的CGRP的规模生产，成本大大降低，生产条件温和、易于控制；所得CGRP不仅生物活性超强，而且比化学合成的CGRP半衰期延长近两倍。
4、与其他生物工程制备具有CGRP活性的融合蛋白相比，本发明实现了CGRP从融合蛋白的分离，保证了生物活性，降低了异源性，高效无毒。
保藏说明
本发明所述的转化体进行了下述保藏：
保藏时间：2009年2月12日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，CCTCC，湖北省武汉市武汉大学；保藏编号为CCTCC M 209021；分类命名：Escherichiacoli TB1/pMAL-c2X。
附图说明
图1是p MAL-c2X载体的质粒图谱；
图2是重组质粒pMAL-CGRP的Xmn I酶切电泳图；
图3是克隆入重组质粒的CGRP部分的DNA测序结果图；
图4是15％SDS-PAGE检测IPTG诱导CGRP表达的电泳图；
图5是12％SDS-PAGE检测CGRP表达及纯化过程的电泳图；
图6是融合蛋白的免疫印迹鉴定图；
图7是CGRP的HPLC分析图谱；
图8是CGRP等电点聚焦电泳图谱；
图9是CGRP的质谱检测图谱。
图10是CGRP对雄兔眼睛血管扩张的检测图，其中，图A为雄兔右眼未处理前，图B为雄兔右眼给10μl CGRP(10μg/ml)后3min的检测图，图C雄兔右眼给10μl CGRP(10μg/ml)后7min的检测图，图D雄兔右眼给10μl CGRP(10μg/ml)后12min的检测图。
具体实施方式
下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
一种转化体，其宿主细胞是大肠杆菌TB1(E.coli TB1)，导入宿主细胞的表达载体为pMAL-CGRP线性载体，其中，CGRP为重组人降钙素基因相关肽基因，通过Xmn I酶切位点克隆入pMAL-c2X载体载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该转化体保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 209021。
上述转化体的制备，通过以下步骤实施：
1)表达载体pMAL-CGRP的构建：
a、CGRP的序列设计：
在GenBank中查找人β-CGRP基因，根据其翻译的氨基酸序列，并按大肠杆菌的惯用密码设计并人工合成一段114bp的核苷酸，其序列如SEQ.ID.NO.1所示：
gcttgcgaca ccgctacctg cgttacccac cgtctggctg gtctgctgtc tcgttctggt  60
ggtgttgtta aaaacaactt cgttccgacc aacgttggtt ctaaagcttt ctga       114
b、pMAL-c2X载体质粒用Xmn I酶切：
pMAL-c2X载体大小约6.7Kbp，载体宿主为E.coli，Amp抗性，购自美国NEB公司(New England Biolabs)，Xmn I的酶切位点为：gga agg att tca，其质粒图谱如图1所示。
pMAL-c2X质粒经Xmn I酶切得到线性化片段，用试剂盒(购自NEB公司)回收线性化片段。
c、将SEQ.ID.NO.1所示的CGRP序列PCR扩增，退火产物用Klenow酶(购自NEB公司)补平PCR产物末端。
d、将末端补平的CGRP序列和回收的pMAL-c2X线性片段用T4DNA连接酶连接，得到表达载体pMAL-CGRP。
e、表达载体pMAL-CGRP转化感受态TB1细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素(Amp)100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养后收菌提取质粒后Xmn I酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定；如图2重组质粒pMAL-CGRP的酶切电泳图所示，图中泳道1：DNA marker；泳道2、3：重组质粒pMAL-CGRP经Xmn I酶切获得预期114bp大小的插入片段。
提取质粒后DNA测序结果显示与所合成CGRP序列插入到了pMAL-c2X载体，如图3所示的DNA测序结果图，上下箭头之间标注部分所示的序列与SEQ.IE.NO.1所示的序列一致，并且上下箭头两侧的序列分别为：ggaagg和atttca，为Xmn I的酶切识别位点；至此pMAL-CGRP表达载体构建成功。
2)转化体的构建
a、感受态细胞的制备
取大肠杆菌TB1菌种按1∶100的体积比接种入LB培养液，在37℃振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至OD600为0.4～0.6，无菌操作下将菌液冰浴10min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液，加入沉淀物1/2体积预冷的100mmol/L的CaCl₂，吹起沉淀，冰浴40min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液后加入沉淀物1/25体积的含质量浓度25％的甘油和100mmol/L的CaCl₂的混合溶液再次吹起沉淀，分装入Eppendorf管中，-70℃保存备用；
b、感受态细胞的转化
将大肠杆菌感受态细胞从-70℃中取出，冰浴融解5～10分钟，加入含有重组质粒pMAL-CGRP的悬液，轻微混匀，继续冰浴30分钟，然后铺板，含氨苄青霉素(Amp)50mg/L的酵母培养基培养，37℃孵箱培养过夜；
所述的酵母培养基组分：酵母浸出粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖2g，PH7.4，加水至1000ml。
c、蓝白筛选转化体
将pMAL-CGRP转化到感受态的大肠杆菌TB1宿主菌中，37℃恒温箱培养12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素50mg/L的酵母培养液中，摇床37℃培养过夜；次日以1∶100的体积比接种于新鲜的含氨苄青霉素50mg/L的酵母培养液中，37℃继续培养至细菌密度达到OD600＝0.4～0.6，加入0.01mM IPTG诱导4h后12000rpm离心20min收取白色克隆的细菌，-20℃保存。
所述转化体保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 209021。
基于上述转化体的重组人降钙素基因相关肽CGRP制备方法，包括下步骤：
1)菌株培养：
在酵母培养基中培养CCTCC M 209021菌株至对数期，然后按1∶10的比例转接于50L，或者按1∶100的比例转接于500L的含氨苄青霉素50mg/L的酵母培养基培养，培养到对数生长期时用IPTG诱导培养3～5小时，此时CCTCCM 209021菌株表达出MBP-CGRP融合蛋白；
2)融合蛋白的纯化：
a、诱导表达后的培养液经冰冻离心机离心，收集菌体沉淀；
b、按1g菌体加5～10ml STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，然后加入裂解液进行裂解，裂解后的菌体在4℃条件下12000rpm离心20min，收集上清；
所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；所述的裂解液：蔗糖200～500g，0.5M的EDTA 2ml，pH8.0的3M Tris-Hcl 10ml加水至1000ml；或者为包含质量分数为1％的NP-40溶液或者质量分数为1％的SDS溶液。
c、上清用Amylose Resin(购自NEB公司)亲和层析柱洗脱，用洗脱液反复洗脱后收集融合蛋白洗脱峰，融合蛋白的洗脱时间为12～15min，所述洗脱液：11g Nacl，0.5M的EDTA 2ml，pH7.4的1M Tris-Hcl 20ml加水至1000ml；
或者用洗脱液反复洗脱后收集融合蛋白洗脱峰，然后用密理博透析膜(Millimore)透析，冷冻保存。
3)CGRP的纯化：
用凝血因子Xa消解收集的融合蛋白洗脱峰，从融合蛋白切下CGRP，然后通过葡聚糖G25层析柱收集CGRP；CGRP的洗脱时间为15min。
对上述CGRP表达过程及纯化分别做以下鉴定：
a、SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测
15％SDS-PAGE检测，参见图4；图中，泳道10：蛋白质marker，9.74、6.62、4.3、3.1、2.01、1.44KDa；泳道1-9经过IPTG不同时间的诱导表达；
12％SDS-PAGE检测，参见图5；图中，泳道7：蛋白质marker，9.74、6.62、4.3、3.1、2.01、1.44KDa；泳道1-3IPTG诱导表达；泳道4：裂菌上清；泳道5：裂菌沉淀；泳道6：过Amylose Resin层析柱后约4.3KDa融合表达区带。
比较上述SDS-PAGE结果图，可知经过IPTG诱导，表达载体pMAL-CGRP得到了表达，重组蛋白MBP-CGRP是在裂菌后的上清中，经过柱层析之后得到纯化的重组蛋白，如泳道6所示的清晰的条带。
b、免疫印迹鉴定
电泳结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mMGlycine、20％甲醇)中100V恒压电泳50分钟，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl，0.05％Tween-20)清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中室温封闭1h，TBST室温洗3次，每次5min，加入鼠源性的抗CGRP作为一抗，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，再加入人抗鼠作为二抗，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，最后用TBS(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mMNaCl)洗3次，NC膜浸入DAB(3’，3’-二甲基联苯胺)显色液中，室温避光显色1min，蒸馏水冲洗终止反应。参见图4，图中泳道1为标准品；泳道2：为融合蛋白MBP-CGR。
c、CGRP的HPL C的检测
用凝血因子X a从融合蛋白切下CGRP，通过葡聚糖G25层析柱收集之后得到纯化的CGRP。
说明HPLC柱层析的为C18，流动相为乙腈∶甲醇＝20∶80，检测波长为215nm，如图7所示的HPLC检测图谱，本发明所得在CGRP在12分钟得到CGRP的峰值，与标准品一致；计算峰值面积，得到CGRP的纯度大于95％。
d、CGRP的等电点检测
如图8所示对CGRP等电点聚焦电泳图谱，泳道1所示从上到下PH值为3.5、4.55、5.20、5.85、6.55、6.85、7.35、8.15、8.45、8.65、9.3；泳道2所示CGRP的PH为8，与预期相符合。
e、CGRP的分子量检测
将本发明所得CGRP送交北京质谱中心进行质谱检测，如图9所示的CGRP质谱检测图，所示CGRP的分子量为4135，与理论值相当。
动物模型实验检测CGRP生物活性：
在CGRP生物活性实验中，将1毫克的CGRP作不同剂量的稀释滴入兔眼，每种稀释剂量以8只兔眼作实验组，另以生理盐水代替样品作对照组，在倒置显微镜的观察下，通过测微计测量，血管扩张作用十分显著。当1毫克样品稀释到10-10时，仍表现出血管扩张作用。更令人振奋的是血管扩张作用在7分钟时达到高峰，扩张作用可持续15分钟以上。这个实验结果充分证明了本发明用基因重组制备的的CGRP不仅生物活性超强，而且比化学合成的CGRP半衰期延长近两倍。参照王军志主编.《生物技术药物研究开发和质量控制》，科学出版社；584。
具体实验步骤如下：
①剂量设置：高剂量组每次滴入1.0μg CGRP，按实验方法要求，以10的倍数为比例进行稀释，得到中剂量组和低剂量组每次加药的量。
②给药途径：原位滴入给药
③给药：确认家兔眼球无充血后入选实验，用10％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg)，麻醉后将动物侧卧，置于倒置显微镜下，直接观察眼球结膜，至血管清晰地在计算机屏幕上成像。在被观察球结膜血管处原位滴入受试样品溶液，在计算机上采集同一处毛细血管直径变化的清晰图象。根据预实验结果，于加药后0、1、2、3、5、7、9、12、15min采集毛细血管直径变化的清晰图象，一只眼睛一个剂量共观察15min。生理盐水组实验时按同样的方法观察，只是将加样药液改成生理盐水，一只眼睛观察15min。
④指标观察：观察毛细血管的直径。
⑤实验结果：
家兔球结膜血管直径的变化率，即(处理前血管直径-处理后血管直径)/处理前血管直径×100％的结果如下表1，其中，低剂量0.01μg/次(溶液浓度1μg/ml，n＝8)，中剂量0.1μg/次(溶液浓度10μg/ml，n＝8)，高剂量1.0μg/次(溶液浓度100μg/ml，n＝8)
表1 各组各时间点家兔球结膜血管直径的变化率(平均值±标准差，单位：％)