一种绿麦芽抗菌蛋白分离纯化方法.pdf

本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种采用缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析、凝胶过滤层析、阳离子交换层析分离纯化从绿麦芽中制备抗酵母蛋白的方法。其是将绿麦芽粉粹后加入0.05M硫酸浸提，后硫酸铵分级沉淀，透析后经多种层析柱纯化后得到一种抗酵母蛋白，经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条带，说明已达到电泳纯。本发明具有纯化效果好，提取率高等特点。

1、  一种绿麦芽抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备，将绿麦芽粉碎后，与0.05M硫酸以1∶3～7混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15min搅拌一下，用离心机离心取上清，采用碱中和调PH为6.5～7.0，加硫酸铵分级沉淀，离心弃上清，用水复溶抗菌蛋白，将复溶的抗菌蛋白加到排阻1000Da的透析袋中，pH7～8、0.02～0.05mol/L Tis-HCl缓冲液透析至无硫酸根离子，浓缩样品，得到绿麦芽抗菌蛋白粗提液；
第二步、阴离子交换柱层析：
填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7-8；上样：绿麦芽抗菌蛋白粗提液；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；
第三步、分子筛柱层析：
填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×40cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：经阴离子交换柱层析分离的未吸附并冻成干粉的蛋白经洗脱液溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥冻成干粉；
第四步、阳离子交换柱层析：
填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱体积：200ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经分子筛柱层析分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液溶解后上样；无需梯度洗脱，收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥。

2、  根据权利要求1所述的一种绿麦芽抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于其具体操作步骤是：
第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备，取30克的绿麦芽粉粹后过40～80目筛的粉末与0.05M硫酸以1∶5～6混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15min搅拌一下，用离心机8000转/分、离心15分钟，取上清，用氢氧化钠调到6.5～7.0，加入硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度30％～80％之间的蛋白，用排阻1000Da的透析袋透析，透析后离心10000转/分、离心10分钟，取上清，上清即为抗菌蛋白粗提液，并浓缩至3ml；
第二步、阴离子交换柱层析：填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：浓缩后的绿麦芽抗菌蛋白粗提液3ml；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；
第三步、分子筛柱层析：填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×70cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7-8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmolTis-HCl，pH7-8；上样：经DEAE纤维素52层析，未吸附并冻成干粉的蛋白，经平衡液1-2ml溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冻成干粉；
第四步、阳离子交换柱层析：填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱体积：200ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经葡聚糖凝胶G-50分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液3ml溶解后上样；无需梯度洗脱，收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥。

一种绿麦芽抗菌蛋白分离纯化方法
技术领域
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，涉及采用缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀和各种层析技术相结合的绿麦芽抗菌蛋白分离纯化方法。
背景技术
大麦和酵母是啤酒制造的主要原料，大麦对酵母的影响一直是人们研究的热点，大麦中抗菌蛋白对酵母的毒害作用一直受人们的关注。Okada(1970)等从小麦和大麦中分离了一种对酵母有毒性的物质。它是一种抗蛋白水解和抗热的多肽，但在二价钙离子存在的条件下，其对酵母的影响会减弱，提到用0.05M的硫酸浸提大麦得到的蛋白对酵母有毒害作用的物质有：抗菌素，非特异脂移蛋白、硫堇等，其提取方法工艺复杂，提取时间较长。Barry C.Axcell(2000)提出不彻底发酵现象与对酵母毒害作用可能是相互联系的，而且主要的原因可能是脂类转移蛋白的抗菌多肽或硫堇类，并提出能部分提纯这种蛋白。Sandra N.E.vanNierop(2008)采用0.05M硫酸提取后，直接用透析袋透析，后冷冻干燥，加乙腈去除不容物，得到抗菌蛋白的复合物，含抗菌肽、抗菌素、硫堇等，但是没有对其分离纯化。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种用绿麦芽制备抗菌蛋白的分离纯化方法。本发明通过高效提取大麦芽蛋白，硫酸铵分级沉淀抗菌活性物质和各种层析柱层析技术分离纯化抗菌蛋白，经SDS-PAGE电泳显示为一条单带，分子量大致在16kda左右。
本发明绿麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，包括如下步骤：
第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备，将绿麦芽粉碎后，与0.05M硫酸以1∶3～7混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15min搅拌一下，用离心机离心取上清，采用碱中和调PH为6.5～7.0，加硫酸铵分级沉淀，离心弃上清，用水复溶抗菌蛋白，将复溶的抗菌蛋白加到排阻1000Da的透析袋中，pH7～8、0.02～0.05mol/L Tis-HCl缓冲液透析至无硫酸根离子，浓缩样品，得到绿麦芽抗菌蛋白粗提液。
第二步、将第一步得到的麦芽抗菌蛋白粗提液按顺序依次通过阴离子交换柱层析、分子筛柱层析和阳离子交换柱层析，使绿麦芽抗菌蛋白分离纯化。
(1)阴离子交换柱层析：
填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：绿麦芽抗菌蛋白粗提液；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉。
(2)分子筛柱层析
填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×40cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：经阴离子交换柱层析分离的未吸附并冻成干粉的蛋白经洗脱液溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥冻成干粉；
(3)阳离子交换柱层析
填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱体积：200ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经分子筛柱层析分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液溶解后上样；无需梯度洗脱，收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥。
上述的方法在实际操作中可以是：
第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备
取绿麦芽粉粹后过40～80目筛的粉末与0.05M硫酸以1∶5～6混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时(每隔10～15min搅拌一下)，用离心机8000转/分、离心15分钟，取上清，用氢氧化钠调到pH7.0，加入硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度30％～80％之间的蛋白，用排阻1000Da的透析袋透析，透析后离心10000转/分、离心10分钟，取上清，上清即为抗菌蛋白粗提液。
第二步、阴离子交换柱层析：填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7.8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7～8，；上样：浓缩后的绿麦芽抗菌蛋白粗提液；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；
第三步、分子筛柱层析：填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×70cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：经DEAE纤维素52层析，未吸附并冻成干粉的蛋白溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冻成干粉；
第四步、阳离子交换柱层析：填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5.8；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱体积：200ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经葡聚糖凝胶G-50分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液溶解后上样；无需梯度洗脱，收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥。
绿麦芽抗菌蛋白的抗菌活性峰检测方法如下：采用光密度法，把抗菌蛋白加到菌的培养基中，利用光密度差值计算抑制率。抑制率＝(OD_空-OD_样)/OD_空，OD_样即把抗菌蛋白加入菌培养液中在600nm下所得吸光值，OD_空即是把等体积抗菌蛋白溶解液加入菌培养液中在600nm下所得吸光值。
本发明具有原材料来源广泛、产品纯度高等优点。
附图说明
图1、实施例1经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图，Marker为标准蛋白，纵轴表示分子量分别为14.3kDa、20.1kDa、29.0kDa、44.3kDa、66.4kDa、97.2kDa。
具体实施方式
实施例1、
第一步、绿麦芽抗菌粗提液的制备：将绿麦芽粉碎后，取50目粉末与0.05M硫酸以1∶6混合，冰浴浸提3小时，中间每隔15min搅拌一次，提取结束后，在4℃，8000r/min，离心10min，除去沉淀，上清用0.5M氢氧化钠调Ph值为7.0。将上清加入硫酸铵使饱和度达到30％，放置两个小时后，在4℃，10000r/min，离心10min，除去沉淀，上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，在4℃，10000r/min，离心10min，除去上清，用少量去离子水复溶沉淀得抗菌蛋白液。将水复溶的抗菌蛋白液加入排阻1000Da的透析袋中，用去离子水透析过夜，至无硫酸根离子(用氯化钡检测)，在4℃，10000r/min，离心10min，去除沉淀，上清液即为抗菌粗蛋白。
第二步、阴离子交换柱层析：填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7.8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7.8和含0.5mol/l NaCl的50mmol Tis-HCl，pH7.8；洗脱体积：120ml；上样：浓缩后的大麦抗菌蛋白粗提液3ml；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；
先用60ml50mmol Tis-HCl，pH7.8的洗脱液洗脱，抗菌蛋白没有被吸附，先流下来；再用0.5mol/l NaCl的50mmol Tis-HCl，pH7.8洗脱液洗脱杂蛋白。一共出现两个峰，收集并冷冻干燥第一个峰。
第三步、分子筛柱层析：填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×70cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7.8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmolTis-HCl，pH7.8洗脱体积：200ml；上样：经DEAE纤维素52层析，未吸附并冻成干粉的蛋白，经平衡液1～2ml溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冻成干粉。
第四步、阳离子交换柱层析：填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5.8；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5.8；洗脱体积：150ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经葡聚糖凝胶G-50分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液3ml溶解后上样。
无需梯度洗脱，出现两个峰，第一个峰为抗菌蛋白峰，收集并冷冻干燥，上样SDS-PAGE电泳，出现一条单带，见附图。
实施例2、
第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备，将绿麦芽粉碎后，取60目粉末与0.05M硫酸以1∶5混合，4℃浸提4小时，中间每隔10min搅拌一次，提取结束在4℃，8000r/min，离心10min，除去沉淀，上清液用0.5M氢氧化钠调Ph值为6.5。将上清液加入硫酸铵使饱和度达到30％，放置两个小时后在4℃，10000r/min，离心10min，去沉淀，上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，在4℃，10000r/min，离心10min，除去上清液，得到沉淀即为抗菌蛋白用少量去离子水复溶。将水复溶的抗菌蛋白液加入排阻1000Da的透析袋中，透析过夜，至无硫酸根离子(用氯化钡检测)，在4℃，10000r/min，离心10min，去除沉淀，上清液即为抗菌粗蛋白。
第二步、阴离子交换柱层析：填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7.8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7.8和含0.5mol/l NaCl的50mmol Tis-HCl，pH7.8；洗脱体积：120ml；上样：浓缩后的大麦抗菌蛋白粗提液3ml；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；
先用60ml50mmol Tis-HCl，pH7.8的洗脱液洗脱，抗菌蛋白没有被吸附，先流下来；再用0.5mol/l NaCl的50mmol Tis-HCl，pH7.8洗脱液洗脱杂蛋白。一共出现两个峰，收集并冷冻干燥第一个峰。
第三步、分子筛柱层析：填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×70cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7.8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7.8；洗脱体积：200ml；上样：经DEAE纤维素52层析，未吸附并冻成干粉的蛋白，经平衡液1～2ml溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冻成干粉；
第四步、阳离子交换柱层析：填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5.8；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5.8；洗脱体积：150ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经葡聚糖凝胶G-50分离的有抗菌活的蛋白干粉，经加洗脱液3ml溶解后上样；无需梯度洗脱，出现两个峰，第一个峰为抗菌蛋白峰，收集并冷冻干燥，上样SDS-PAGE电泳，出现一条单带。