用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法.pdf

本发明利用硫酸溶液提取大麦、经5天发芽的绿麦芽蛋白液，离心取上清，用碱调到中性后，采用硫酸铵分级沉淀，用精密排阻的透析袋透析至无硫酸根离子，加乙腈使乙腈与抗菌蛋白达到一定比例，离心去除沉淀，上清液用0.45um纤维滤膜除菌后，即可得抗菌蛋白液。抗菌蛋白含量达到31ug/ml时，把抗菌蛋白加到酵母培养液里面，培养8h后，抑制率为30％；加到乳酸菌培养液中，培养8h后，抑制率达到50％。本发明提取抗菌蛋白操作简便易行。

1、  一种用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，其特征在于具体操作步骤如下：
第一步、将大麦麦芽粉碎后，将麦芽粉末与0.05M硫酸以1∶3～7混合，冰浴提取2～4小时，每隔10～15分钟搅拌一次，8000r/min离心10分钟，取上清液，用氢氧化钠调到6.5～7.0，得到抗菌蛋白的粗提液；
第二步、将抗菌蛋白的粗提液加入硫酸铵至饱和度达到30％，在4℃，10000r/min，离心10min后，去沉淀，上清液加入80％硫酸铵，在4℃，10000r/min离心10分钟后弃去上清液，将沉淀用水复溶；
第三步、将上述复溶物加到精密排阻1000Da的透析袋中，透析至所得蛋白液用氯化钡检测无硫酸根离子，将上述蛋白液离心得上清液，冷冻干燥，加入乙腈水溶液复溶，离心弃除不容物，用0.45微米纤维滤膜过滤后即得抗菌蛋白液，其中乙腈水溶液为乙腈∶水＝1∶3～5。

2、  根据权利要求1所述的一种用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，其特征在于第一步中，大麦麦芽粉碎后，将麦芽粉末过40～80目筛。

3、  根据权利要求1所述的一种用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，其特征在于第一步将麦芽粉末与硫酸混合后，于4～6℃提取2～4小时。

4、  根据权利要求1所述的一种用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，其特征在于选用大麦粒或经5天发芽的绿麦芽粉碎。

用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法
技术领域
本发明具体涉及一种用大麦麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法。
背景技术
大麦和酵母是啤酒制造的主要原料，大麦对酵母的影响一直是人们研究的热点，大麦中抗菌蛋白对酵母的毒害作用一直受人们的关注。Okada(1970)等从小麦和大麦中分离了一种对酵母有毒性的物质。它是一种抗蛋白水解和抗热的多肽，但在二价钙离子存在的条件下，其对酵母的影响会减弱，提到用0.05M的硫酸浸提大麦得到的蛋白对酵母有毒害作用的物质；有抗菌素，非特异脂移蛋白、硫堇等，他的提取方法工艺复杂，提取时间较长。Barry C.Axcell(2000)提出提出不彻底发酵现象与对酵母毒害作用可能是相互联系的，而且主要的原因可能是脂类转移蛋白的抗菌多肽或硫堇类，并提出能部分提纯这种蛋白。SandraN.E.van Nierop(2008)采用0.05M硫酸提取后，直接用透析袋透析，后冷冻干燥，加乙腈去除不容物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种用大麦麦芽制备抗菌蛋白的方法。本发明通过高效提取大麦芽蛋白，硫酸铵分级沉淀抗菌活性物质，当抗菌蛋白含量在31ug/ml时，培养8h-12h后，酵母生长抑制率达到了30％，乳酸菌抑制率达到了50％。具有工艺操作简便，生产成本低，所得抗菌活性物质活性稳定。
本发明的大麦或绿麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，包括如下步骤：
第一步、将大麦麦芽粉碎后，将麦芽粉末与0.05M硫酸以1∶3～7混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15分钟搅拌一次，8000r/min离心10分钟，取上清液，用氢氧化钠调到6.5～7.0，得到抗菌蛋白的粗提液；
第二步、将抗菌蛋白的粗提液加入硫酸铵至饱和度达到30％，在4℃，10000r/min，离心10min后，去沉淀，上清液加入80％硫酸铵，在4℃，10000r/min离心10分钟后弃去上清液，将沉淀用水复溶；
第三步、将上述复溶物加到精密排阻1000Da的透析袋中，透析至所得蛋白液用氯化钡检测无硫酸根离子，将上述蛋白液离心得上清液，冷冻干燥，加入乙腈水溶液复溶，离心弃除不容物，用0.45微米纤维滤膜过滤后即得抗菌蛋白液，其中乙腈水溶液为乙腈∶水＝1∶3～5。
本发明可选用大麦粒、麦芽或经5天发芽的绿麦芽，将其粉碎后直接与0.05M硫酸混合，优选方法为将上述粉末过40～80目筛后再与0.05M硫酸混合。
抑制率测定方法：抑制率＝(OD_空-OD_样)/OD_空，OD_样即把抗菌蛋白加入菌培养液中在600nm下所得吸光值，OD_空即是把等体积乙腈水溶液加入菌培养液中在600nm下所得吸光值。  
本发明与现有技术相比，具有如下优点：采用0.05M硫酸提取抗菌蛋白，利用抗菌蛋白的稳定性使杂蛋白酸解，提高了提取率，采用了硫酸铵分级沉淀，大大纯化了抗菌蛋白的纯度，通过排阻1000Da的透析袋，透析出去了硫酸根离子，使小分子的抗菌多肽得以保留，利用乙腈水溶液，使不溶的杂蛋白分离出去，所得抗菌蛋白的含量在31ug/ml，培养8小时，酵母抑制率达到30％，乳酸菌抑制率达到了50％。本发明操作简便，生产成本低。
具体实施方式
实施例1
第一步：将绿麦芽粉碎后，取50目粉末与0.05M硫酸以1∶6混合，冰浴浸提3小时，中间每隔15min搅拌一次，提取结束后，在4℃，8000r/min，离心10min，除去沉淀，上清用0.5M氢氧化钠调Ph值为7.0。
第二步：将上清加入硫酸铵使饱和度达到30％，放置两个小时后，在4℃，10000r/min，离心10min，除去沉淀，上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，在4℃，10000r/min，离心10min，除去上清，用少量去离子水复溶沉淀得抗菌蛋白液。
第三步：将水复溶的抗菌蛋白液加入排阻1000Da的透析袋中，用去离子水透析过夜，至无硫酸根离子(用氯化钡检测)，在4℃，10000r/min，离心10min，去除沉淀，将上清液冷冻干燥，再加入4倍体积的乙腈水溶液(乙腈∶水＝1∶4)，在4℃放置一个小时后10000r/min，离心10min去除沉淀，保留上清液。
第四步：保留的上清液用0.45um的硝酸纤维滤膜过滤，即为抗菌蛋白液。
第五步：把抗菌蛋白加入到酵母、乳酸菌培养液中，使抗菌蛋白含量在31ug/ml，培养8小时后，在相同条件下测定；酵母抑制率达到30％，乳酸菌达到了50％。
实施例2
第一步：将大麦芽粉碎后，取60目粉末与0.05M硫酸以1∶5混合，4℃浸提4小时，中间每隔10min搅拌一次，提取结束在4℃，8000r/min，离心10min，除去沉淀，上清液用0.5M氢氧化钠调Ph值为6.5。
第二步：将上清液加入硫酸铵使饱和度达到30％，放置两个小时后在4℃，10000r/min，离心10min，去沉淀，上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，在4℃，10000r/min，离心10min，除去上清液，得到沉淀即为抗菌蛋白用少量去离子水复溶。
第三步：将水复溶的抗菌蛋白液加入排阻1000Da的透析袋中，透析过夜，至无硫酸根离子(用氯化钡检测)，在4℃，10000r/min，离心10min，去除沉淀，将上清液冷冻干燥，加入3倍体积的乙腈水溶液(乙腈∶水＝1∶3)复溶，4℃放置一个小时后，10000r/min，离心10min，去除沉淀，保留上清液。
第四步：保留的上清液用0.45um的硝酸纤维滤膜过滤，过滤液即为抗菌粗蛋白。
第五步：把抗菌蛋白加入到酵母、乳酸菌培养液中，使抗菌蛋白含量在31ug/ml，培养8小时后，在相同条件下测定；酵母抑制率达到25％，乳酸菌达到了45％。
实施例3
第一步：将大麦粒粉碎后，取70目粉末与0.05M硫酸以1∶5混合，在4℃浸提4小时，中间每隔10min搅拌一次，提取结束在4℃，8000r/min，离心10min，除去沉淀，上清液用0.5M氢氧化钠调Ph值为6.8。
第二步：将上清液加入硫酸铵使饱和度达到30％，放置两个小时后在4℃，10000r/min，离心10min，去沉淀，上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，在4℃，10000r/min，离心10min，除去上清液，用少量水复溶沉淀得抗菌蛋白液。
第三步：将水复溶的抗菌蛋白液加入排阻1000Da的透析袋中，透析过夜，至无硫酸根离子(用氯化钡检测)，在4℃，10000r/min，离心10min，去沉淀，将上清液冷冻干燥，再加入3.5倍体积乙腈水溶液(乙腈∶水＝1∶5)复溶，在4℃放置一个小时后，10000r/min，离心10min，去除沉淀，保留上清液。
第四步：保留的上清液用0.45um的硝酸纤维滤膜过滤。过滤液即为抗菌蛋白液。
第五步：把抗菌蛋白加入到酵母、乳酸菌培养液中，使抗菌蛋白含量在31ug/ml，培养8小时后，在相同条件下测定；酵母抑制率达到27％，乳酸菌达到了48％。