多核酸检测方法 本申请基于并要求2008年7月3日提交的日本专利申请No.2008-174927的优先权，并通过引用将其整体并入本文。
【技术领域】
本发明涉及使用固定有核酸探针的用于检测核酸样品的设备检测核酸样品的方法，尤其涉及一次检测多个核酸样品的方法。
背景技术
近年来，随着分子生物学的发展，鉴定了多个疾病基因，这使通过基因诊断确定疾病成为可能。另外也实现了基于基因诊断结果给各患者提供最适治疗的个性化医疗。
随着基因诊断的有效性增加，临床现场中操作的样品数激增，因此对同时检查大量核酸样品的检查阵列和检查方法有了强烈需求，且有些已实现(特开2005-345243)。
但当同时检查大量核酸样品时发生被检物错用和污染的问题。基因诊断多为病发前诊断，根据诊断结果进行预防性治疗，因此得到正确的诊断结果是不可或缺的。
发明概述
本发明旨在提供可防止被检物错用、被检物间污染所致的误检并具备医疗现场要求的高安全性和可靠性的检测方法。
第一实施方案
本发明的第一实施方案是检测第1～第n(n为大于等于2的自然数)核酸样品的多核酸检测方法，包括：
第一步：准备如下用于检测核酸样品的设备：
准备分别对应于第1～第n核酸样品的第1～第n孔，从而使第1孔含：
固定有第1检测核酸探针的用于检测第1核酸样品的第1检测核酸探针固定区域和
固定有第1阳性对照核酸探针的用于识别第1核酸样品的第1阳性对照固定区域，且
使第k(k为2～n的自然数)孔含：
固定有第k检测核酸探针的用于检测第k核酸样品的第k检测核酸探针固定区域和
固定有第k阳性对照核酸探针的用于识别第k核酸样品的第k阳性对照固定区域；
第二步：准备用于识别第1～第n核酸样品的试剂，所述试剂含相互不同的核酸，各核酸含与固定于第1～第n孔中的第1～第n阳性对照固定区域的第1～第n阳性对照核酸探针具有分别互补的序列的核酸；
第三步：将用于识别第1～第n核酸样品的试剂分别加入到第1～第n核酸样品中；
第四步：将第1～第n核酸样品各注入第1～第n孔中；
第五步：检测第1～第n阳性对照固定区域有无反应；
第六步：检测第1～第n检测核酸探针固定区域有无反应。
第二实施方案
本发明的第二实施方案是检测第1～第n(n为大于等于2的自然数)核酸样品的多核酸检测方法，包括：
第一步：准备如下用于检测核酸样品的设备：
准备分别对应于第1～第n核酸样品的第1～第n孔，从而使第1孔含：
固定有第1检测核酸探针的用于检测第1核酸样品的第1检测核酸探针固定区域、
固定有第1阳性对照核酸探针的用于识别第1核酸样品的第1阳性对照固定区域和
用于检测第1核酸样品之外的核酸样品混入的第1阴性对照固定区域，且
使第k(k为2～n的自然数)孔含：
固定有第k检测核酸探针的用于检测第k核酸样品的第k检测核酸探针固定区域、
固定有第k阳性对照核酸探针的用于识别第k核酸样品的第k阳性对照固定区域和
用于检测第k核酸样品之外的核酸样品混入的第k阴性对照固定区域，
其中，
第1阴性对照固定区域由(n-1)个固定区域构成，在各固定区域上分别独立固定有与固定于第2～第n阳性对照固定区域的第2～第n阳性对照核酸探针含同一序列的各核酸探针，且
第k(k为2～n的自然数)阴性对照固定区域由(n-1)个固定区域构成，在各固定区域上分别独立固定有与固定于除第k之外的第1～第n阳性对照固定区域的除第k之外的第1～第n阳性对照核酸探针含同一序列的各核酸探针；
第二步：准备用于识别第1～第n核酸样品地试剂，所述试剂含相互不同的核酸，各核酸含与固定于第1～第n孔中的第1～第n阳性对照固定区域的第1～第n阳性对照核酸探针具有分别互补的序列的核酸；
第三步：将用于识别第1～第n核酸样品的试剂分别加入到第1～第n核酸样品中；
第四步：将第1～第n核酸样品各注入第1～第n孔中；
第五步：检测第1～第n阳性对照固定区域有无反应；
第六步：检测第1～第n阴性对照固定区域有无反应；
第七步：检测第1～第n检测核酸探针固定区域有无反应。
第三实施方案
本发明的第三实施方案是检测第1～第n(n为大于等于2的自然数)核酸样品的多核酸检测方法，包括：
第一步：准备如下用于检测核酸样品的设备：
准备分别对应于第1～第n核酸样品的第1～第n孔，从而使第1孔含：
固定有第1检测核酸探针的用于检测第1核酸样品的第1检测核酸探针固定区域、
固定有第1阳性对照核酸探针的用于识别第1核酸样品的第1阳性对照固定区域和
用于检测第1核酸样品之外的核酸样品混入的第1阴性对照固定区域，且
使第k(k为2～n的自然数)孔含：
固定有第k检测核酸探针的用于检测第k核酸样品的第k检测核酸探针固定区域、
固定有第k阳性对照核酸探针的用于识别第k核酸样品的第k阳性对照固定区域和
用于检测第k核酸样品之外的核酸样品混入的第k阴性对照固定区域，
其中，
第1阴性对照固定区域由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有与固定于第2～第n阳性对照固定区域的第2～第n阳性对照核酸探针含同一序列的核酸探针，且
第k(k为2～n的自然数)阴性对照固定区域由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有与固定于除第k之外的第1～第n阳性对照固定区域的除第k之外的第1～第n阳性对照核酸探针含同一序列的核酸探针；
第二步：准备用于识别第1～第n核酸样品的试剂，所述试剂含相互不同的核酸，各核酸含与固定于第1～第n孔中的第1～第n阳性对照固定区域的第1～第n阳性对照核酸探针具有分别互补的序列的核酸；
第三步：将用于识别第1～第n核酸样品的试剂分别加入到第1～第n核酸样品中；
第四步：将第1～第n核酸样品各注入第1～第n孔中；
第五步：检测第1～第n阳性对照固定区域有无反应；
第六步：检测第1～第n阴性对照固定区域有无反应；
第七步：检测第1～第n检测核酸探针固定区域有无反应。
第四实施方案
本发明的第四实施方案是检测第1～第n(n为大于等于2的自然数)核酸样品的多核酸检测方法，包括：
第一步：准备如下用于检测核酸样品的设备：
准备分别对应于第1～第n核酸样品的第1～第n孔，从而使第1孔含：
固定有第1检测核酸探针的用于检测第1核酸样品的第1检测核酸探针固定区域、
固定有第1阳性对照核酸探针的用于识别第1核酸样品的第1阳性对照固定区域和
固定有第1阴性对照核酸探针的用于检测第1核酸样品之外的核酸样品混入的第1阴性对照固定区域，且
使第k(k为2～n的自然数)孔含：
固定有第k检测核酸探针的用于检测第k核酸样品的第k检测核酸探针固定区域、
固定有第k阳性对照核酸探针的用于识别第k核酸样品的第k阳性对照固定区域和
固定有第k阴性对照核酸探针的用于检测第k核酸样品之外的核酸样品混入的第k阴性对照固定区域；
第二步：准备用于识别第1～第n核酸样品的试剂，其中，
所述用于识别第1核酸样品的试剂包括：
含与固定于第1阳性对照固定区域的第1阳性对照核酸探针具有互补序列的核酸的用于判定第1阳性对照的试剂和
含与固定于第2～第n阴性对照固定区域的第2～第n阴性对照核酸探针具有分别互补的序列的多个核酸的用于判定第1阴性对照的试剂，且
所述用于识别第k(k为2～n的自然数)核酸样品的试剂包括：
含与固定于第k阳性对照固定区域的第k阳性对照核酸探针具有互补序列的核酸的用于判定第k阳性对照的试剂和
含与固定于除第k之外的第1～第n阴性对照固定区域的除第k之外的第1～第n阴性对照核酸探针具有分别互补的序列的多个核酸的用于判定第k阴性对照的试剂；
第三步：将用于识别第1～第n核酸样品的试剂分别加入到第1～第n核酸样品中；
第四步：将第1～第n核酸样品各注入第1～第n孔中；
第五步：检测第1～第n阳性对照固定区域有无反应；
第六步：检测第1～第n阴性对照固定区域有无反应；
第七步：检测第1～第n检测核酸探针固定区域有无反应。
第五实施方案
本发明的第五实施方案是检测第1～第n(n为大于等于2的自然数)核酸样品的多核酸检测方法，包括：
第一步：准备如下用于检测核酸样品的设备：
准备分别对应于第1～第n核酸样品的第1～第n孔，从而使第1孔含：
固定有第1检测核酸探针的用于检测第1核酸样品的第1检测核酸探针固定区域、
固定有第1阳性对照核酸探针的用于识别第1核酸样品的第1阳性对照固定区域和
固定有第1阴性对照核酸探针的用于检测第1核酸样品之外的核酸样品混入的第1阴性对照固定区域，且
使第k(k为2～n的自然数)孔含：
固定有第k检测核酸探针的用于检测第k核酸样品的第k检测核酸探针固定区域、
固定有第k阳性对照核酸探针的用于识别第k核酸样品的第k阳性对照固定区域和
固定有第k阴性对照核酸探针的用于检测第k核酸样品之外的核酸样品混入的第k阴性对照固定区域；
第二步：准备用于识别第1～第n核酸样品的试剂，其中，
所述用于识别第1核酸样品的试剂包括：
含与固定于第1阳性对照固定区域的第1阳性对照核酸探针具有互补序列的核酸的用于判定第1阳性对照的试剂和
含与固定于第2～第n阴性对照固定区域的第2～第n阴性对照核酸探针具有分别互补的序列，且与和固定于第2～第n阳性对照固定区域的第2～第n阳性对照用核酸探针杂交的核酸具有分别互补的序列的多个核酸的用于判定第1阴性对照的试剂，且
所述用于识别第k(k为2～n的自然数)核酸样品的试剂包括：
含与固定于第k阳性对照固定区域的第k阳性对照核酸探针具有互补序列的核酸的用于判定第k阳性对照的试剂和
含与固定于除第k之外的第1～第n阴性对照固定区域的除第k之外的第1～第n阴性对照核酸探针具有分别互补的序列，且与和固定于除第k之外的第1～第n阳性对照固定区域的除第k之外的第1～第n阳性对照用核酸探针杂交的核酸具有分别互补的序列的多个核酸的用于判定第k阴性对照的试剂；
第三步：将用于识别第1～第n核酸样品的试剂分别加入到第1～第n核酸样品中；
第四步：将第1～第n核酸样品各注入第1～第n孔中；
第五步：检测第1～第n阳性对照固定区域有无反应；
第六步：检测第1～第n阴性对照固定区域有无反应；
第七步：检测第1～第n检测核酸探针固定区域有无反应。
可通过本发明的多核酸检测方法防止被检物错用和被检物间污染所致的误检，从而可实现具备医疗现场所需的高安全性和信赖性的检测方法。
以下描述本发明的优点，一部分可通过描述显而易见，或可通过实施本发明得知。可通过以下描述的仪器及其组合实现并得到本发明的优点。
附图简述
附图构成说明书的一部分，描绘了本发明的实施方案，并结合上述发明概述和下述发明详述用于解释本发明的原理。
图1：第一实施方案的用于检测核酸样品的设备11的模式图。
图2：使用图1所示用于检测核酸样品的设备11检测多个核酸的方法的模式图。
图3：第二实施方案的用于检测核酸样品的设备31的模式图。
图4：使用图3所示用于检测核酸样品的设备31检测多个核酸的方法的模式图。
图5：第三实施方案的用于检测核酸样品的设备51的模式图。
图6：图5所示固定于阴性对照固定区域的核酸探针的模式图。
图7：使用图5所示用于检测核酸样品的设备51检测多个核酸的方法的模式图。
图8：第四实施方案的用于检测核酸样品的设备81的模式图。
图9：使用图8所示用于检测核酸样品的设备81检测多个核酸的方法的模式图。
图10：第五实施方案的多核酸检测方法的模式图。
图11：图10所示用于判定阴性对照的试剂中所含多个核酸的模式图。
图12：表示从第一实施方案的样品S1～S4检测到的电流值的第1柱形图。
图13：表示从第一实施方案的样品S1～S4检测到的电流值的第2柱形图。
图14：表示从第二实施方案的样品S1～S4检测到的电流值的柱形图。
图15：表示从第三实施方案的样品S1～S4检测到的电流值的柱形图。
图16：表示从第四实施方案的样品S1～S4检测到的电流值的第1柱形图。
图17：表示从第四实施方案的样品S1～S4检测到的电流值的第2柱形图。
图18：表示从第五实施方案的样品S1～S4检测到的电流值的柱形图。
发明详述
基本内容：
以下对(1)用于检测核酸样品的设备、(2)检测方法、(3)核酸样品及(4)检测过程进行说明。
(1)用于检测核酸样品的设备
本实施方案的用于检测核酸样品的设备的特征在于具备例如基板、形成于基板上的多个核酸探针固定区域和用于隔开所述核酸探针固定区域的框架。所述框架形成至少一个孔，各孔构成用于检测1种核酸样品的1个检查行道，固定有检测核酸探针的核酸探针固定区域(以下简称检测核酸探针固定区域)分别形成于各孔中。
对所述基板和框架的材料无特定限制，可使用本领域技术人员已知的任意材料。可使用例如玻璃、石英玻璃、硅、矾土、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅、氧化硅、氮化硅等无机材料。也可使用聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙稀、聚偏二氯乙烯、聚醋酸乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、脲醛树脂、环氧树脂、蜜胺树脂、苯乙烯-丙稀腈共聚物、丙稀腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、硅树脂、聚苯醚、聚砜等有机材料。对基板形状无特定限制，可为平面状和凹凸状中的任一种，也可为多孔体。
所述核酸探针固定区域由检测核酸探针固定区域、阳性对照固定区域和阴性对照固定区域构成。
“检测核酸探针固定区域”是用于检测有无待检靶核酸序列的区域。例如，当检查有无某疾病基因时，可通过固定具有与所述疾病基因互补的序列的核酸探针来判定核酸样品中有无疾病基因。可通过设定多个检测核酸探针固定区域，并分别固定含不同碱基序列的核酸探针来同时检查多个检测项目。“与疾病基因具有互补序列的核酸探针”指具有与疾病基因的至少一部分互补的序列的核酸探针。
“阳性对照固定区域”是用于确认有无核酸样品错用的区域。以往的用于检测核酸样品的设备中由于无所述“阳性对照固定区域”，所以当同时检测多个核酸样品时，即便将某核酸样品错用为别的核酸样品，也无法确认所述事实。而本实施方案的用于检测核酸样品的设备可通过所述“阳性对照固定区域”确认有无核酸样品的错用，从而可提供无样品错用的具备高安全性和信赖性的用于检测核酸样品的设备。
“阴性对照固定区域”是用于确认有无污染的区域。以往的用于检测核酸样品的设备中由于无所述“阴性对照固定区域”，所以当同时检测多个核酸样品时，即便某核酸样品中混入其他核酸样品(污染)，也无法确认所述事实。而本实施方案的用于检测核酸样品的设备可通过所述“阴性对照固定区域”确认有无其他核酸样品混入(污染)，从而可提供无污染的具备高安全性和信赖性的用于检测核酸样品的设备。
对固定于所述核酸探针固定区域的核酸探针的材料无特定限制，可使用本领域技术人员已知的任意材料。例如可使用DNA、RNA、PNA、甲基磷酸酯骨架的核酸、其他核酸类似物及它们的嵌合核酸。对所使用的探针长度无特定限制，例如8～200个碱基、优选10～100个碱基，更优选12～50个碱基。
对固定核酸探针以制作所述核酸探针固定区域的方法无特定限制，可使用本领域技术人员已知的任意方法。例如可通过物理吸附、化学吸附、疏水结合、包埋和共价结合等进行固定。更具体可通过例如经由导入探针末端的氨基，使用碳二亚胺等缩合剂将探针共价结合到基板上。也可通过向基板包被阴离子性有机物将核酸探针经由离子键固定于基板上。也可通过将生物素导入探针末端，通过生物素-抗生物素蛋白键合固定所述探针。也可通过向探针末端导入巯基，在包被于基板上的含巯基物质间形成S-S来强固固定。这种情况下，可通过预先用具有官能团的分子修饰基板表面来使固定变得容易。另外，优选在探针和末端修饰基团之间导入用于抑制基板表面和探针的立体阻碍的间隔物。对间隔物分子无特定限制，可为例如烷烃骨架、炔烃骨架、烯烃骨架、乙二醇骨架或核酸链。另外，分子结构可为直链，也可为支链。对间隔物部分的长度无特定限制，以碳-碳键计优选为10～500、更优选为20～200、再更优选为50～100。
向基板固定核酸探针时，可通过使用被称为DNA点斑仪(DNAspotter)或DNA阵列仪(DNA arrayer)的固定装置较易进行探针固定。此时，为避免损伤表面，优选使用喷墨或静电点斑仪。也可在基板表面直接合成核酸链。
另外，固定核酸探针而形成核酸探针固定区域的过程优选在密接基板与框架前进行，但也可在密接后固定核酸探针。另外，本实施方案的用于检测核酸样品的设备未必非要以核酸探针固定区域固定有核酸探针的状态提供，也可作为未固定有核酸探针的基板提供。在这种情况下，可将期望的核酸探针如上所述固定于基板上，而将所述基板用作检测核酸样品的设备。
对由框架形成的孔的形状无特定限制，可为圆形、四边形或多边形。另外，可制作孔无底的框架，并将其与在其上已形成核酸探针固定区域的基板进行密接而使用而使制成本实施方案的核酸检测基板变得容易。密接框架和基板希望使用粘结或压接等强化密接方法以防止漏液，也可利用硅包装进行密接。
另外，对于本实施方案的核酸检测基板，未必非要将形成核酸探针固定区域的基板和框架作为一体提供，也可以两者分离的状态提供。在这种情况下使用核酸检测基板时，如上将基板和框架进行密接而使用。
本实施方案的用于检测核酸样品的设备有多个由所述框架形成的孔，以检测多个核酸样品。对所述孔的个数无特定限制，优选3～100个、更优选4～50个、再更优选5～20个。所述孔形成于同一设备中，但基板不限于1个。也可在1个基板上形成全部孔，也可在多个基板上形成多个孔。可通过例如使用多个形成1个孔的基板来同时检测多个核酸样品。在这种情况下，在1个基板上检测1个核酸样品。
(2)检测方法
本发明包括本领域技术人员已知的全部检测方法，无意根据检测方法进行限定性解释。可使用例如，根据荧光色素的荧光强度进行的检测、使用放射性同位素的检测、使用嵌入剂分子的电化学应答的检测、根据静电容量变化的检测等。尤其具有代表性的检测方法是根据荧光的检测和电化学检测。根据荧光的检测由于可视觉识别检测结果，因此可防止检测结果的判定错误。因为电化学检测可仅根据电流值进行检查，因此可实现装置的小型化、检查费用的低廉化、检查时间的缩短化。另外，在进行电化学检测时，所述各核酸探针固定区域构成为电极，所述电极上固定有各核酸探针。
根据荧光检测时，预先用荧光物质标记核酸样品。例如使用用荧光物质标记的引物PCR扩增靶核酸。与核酸探针形成杂交链的靶核酸即便经洗涤后仍停留在核酸探针固定区域内，从而发出荧光。可使用任何公知的荧光物质，例如使用FITC、Cy3、Cy5或罗丹明等。可使用荧光检测仪检测荧光物质的发光。可根据得到的荧光发光量确定对应于各核酸探针的靶核酸的有无。
在荧光检测方法中，为抑制核酸或荧光色素等向核酸探针固定区域上的非特异性附着，优选用巯基乙醇、巯基己醇、巯基庚醇、巯基乙二醇、巯基寡乙二醇、巯基聚乙二醇、巯醇(如具有C30～C50链的烷基硫醇)或硬脂酰胺等脂类、表面活性剂、白蛋白或核酸等包被核酸探针固定区域表面。
进行电化学检测时使用例如具有电化学活性的分子。具有电化学活性的分子指结合于杂交链，并于施加电位后发射电子的分子。对于所述分子，可使用任何公知分子，例如使用Hoechst 33258(注册商标)(可从CALBIOCHEM得到)、吖啶橙、奎纳克林、道诺霉素、金属嵌入剂、双嵌入剂(如双吖啶)、三嵌入剂或聚嵌入剂。尤其优选使用Hoechst33258(注册商标)。Hoechst 33258(注册商标)是由化学物质p-(5-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)苯并咪唑-2-基)苯并咪唑-2-基)苯酚构成的分子。而且，可用具有电化学活性的金属络合物(如二茂铁(二环戊二烯铁)或紫罗碱)修饰这些嵌入剂。可适宜选择所述分子的浓度，一般在1ng/mL～1000ng/mL范围内。此时可使用离子强度0.01～5、pH5～10范围内的缓冲液。
所述分子识别所述杂交链并嵌入其中。施加电位后发生氧化还原反应，由所述嵌入分子释放电子而形成电流。此时，可以恒定速度进行电位扫描或通过脉冲施加电位，或可施加恒定电位。电位扫描速度在10～1000mV/秒的范围内。测定时可使用恒电位器、数字多用表和函数发生器等装置调节电流、电压。源于所述分子的电流流过电极，可通过测量所述电流值而检测有无对应于各核酸探针的靶核酸。
在电化学检测方法中，为抑制核酸或嵌入剂等向核酸探针固定区域(电极)的非特异性附着，优选用巯基乙醇、巯基己醇、巯基庚醇、巯基乙二醇、巯基寡乙二醇、巯基聚乙二醇、巯醇(如具有C30～C50链的烷基硫醇)或硬脂酰胺等脂类、表面活性剂、白蛋白或核酸等包被电极表面。
(3)核酸样品
对通过本实施方案的用于检测核酸样品的设备检测的核酸样品无特定限制，其可为例如从血液、血清、白细胞、尿、粪便、精液、唾液、组织、培养细胞、痰、食品、土壤、排水、废水、空气等样品提取的核酸样品，或为提取后通过扩增处理得到的核酸样品。本实施方案的检测方法可用于检测例如病毒(肝炎病毒(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型、庚型)、HIV、流感病毒(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型)、疱疹群病毒、腺病毒、人多瘤病毒、人乳头瘤病毒、人细小病毒、腮腺炎病毒、人轮状病毒、肠道病毒、日本脑炎病毒、天花病毒、冠状病毒、SARS、登革热病毒、风疹病毒、HTLV等)感染、细菌(金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、病原性大肠杆菌、肠炎弧菌、幽门螺杆菌、弯曲杆菌、霍乱菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、炭疽杆菌、耶尔森菌、淋病双球菌、李斯特氏菌、钩端螺旋体、军团菌、螺旋体、肺炎支原体、立克次体、衣原体、疟疾、痢疾变形虫、病原性真菌等)感染以及寄生虫和真菌感染。
本实施方案的检测方法也可用于判定诱发所述感染的微生物型(基因分型)。例如，丙型肝炎病毒的基因型1a、1b、2a、2b、3a、3b和人乳头瘤病毒的基因型，即恶变相关的16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、54、56、58、59、66、68、69和与恶变无关的6、11、34、40、42、43、44、70等。也可检测耐药基因，例如结核杆菌、艾滋病毒和诱发呼吸器官感染的病原菌的耐药基因等。另外，可用于检查遗传疾病、肿瘤疾病(视网膜母细胞瘤、病毒肿瘤、家族性结肠息肉病、遗传性非息肉性结肠癌、神经纤维瘤病、家族性乳癌、着色性干皮病、脑癌、口腔癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺瘤、乳腺癌、尿肿瘤、男性生殖器瘤、女性生殖器瘤、皮肤瘤、骨肉瘤、骨软骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、实体瘤等)。另外还通适用于医疗之外的，食品检查、检疫、医药品检查、法医学、农业、畜牧、渔业、林业等需要基因检查的领域。另外也适用于限制性片段长度多态性(RFLP)、单核苷酸多态性(SNPs)、微卫星序列等的检测。还可适用于分析未知碱基序列。
(4)检测过程
为检测样品所含核酸，先要从样品中提取核酸而得到核酸样品。对提取方法无特定限制，可使用例如苯酚-氯仿法等液-液提取法或使用载体的固液提取法。也可使用QIAamp(QIAGEN公司生产)、Sumi Test(住友金属公司生产)等市售核酸提取方法。将这些样品注入微孔滴定板等，并进行基因检测。提取基因时，如果使用保持疏水性膜的微孔滴定板等，可更简便进行检测操作。优选将提取出的核酸溶于合适的溶液中。
核酸与固定于探针固定区域的探针发生杂交反应时，将离子强度0.01～5，pH5～10的缓冲液作为反应溶液。可向反应溶液中加入作为杂交促进剂的硫酸葡聚糖、鲑鱼精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂等。也可加入用于调节盐浓度的试剂、用作阳性对照的试剂等。也可根据情况进行核酸扩增反应作为预处理。对核酸扩增反应无特定限制，可为PCR法、LAMP法、ICAN法等。然后将提取出的核酸加入反应溶液中，于90℃或以上使之热变性。含核酸的反应溶液与探针固定电极的接触可在变性后立即进行，也可在迅速冷却至0℃后进行。反应过程中也可通过搅拌或振摇等操作提高反应速度。反应温度优选在10℃～90℃范围内，反应时间优选为约1分钟～过夜。杂交反应后洗涤探针固定区域。使用离子强度0.01～5，pH5～10的缓冲液作为洗涤液。此时，向含核酸的反应溶液中预先加入用于识别核酸样品的试剂。用于识别核酸样品的试剂中含对应于用作阳性对照的核酸探针、对应于用作阴性对照的核酸探针的成分。
洗涤后检测有无杂交。对检测方法无特定限制，可使用如上使用荧光染料对荧光强度的检测、使用放射性同位素的检测、使用嵌入剂分子的电化学应答的检测、根据静电容量变化的检测等。
根据本实施方案的检测方法，在形成于所述基板的各反应用孔中使用来自不同被检物的样品，从而可同时检测多个样品中核酸链的存在。
另外，可自动化所述核酸反应和核酸检测。通过自动化，从而可减少手工操作所致的测量结果的变动。自动检测装置可设置有控制提取反应、扩增反应、杂交反应、洗涤反应等的反应温度的温度控制系统。温度控制系统可使用利用Peltier元件的系统、利用电加热器的系统等。另外，自动检测装置可设置有用于递送各试剂溶液的送液系统。送液系统可使用泵、配管、流速监控器、脱气结构、气液感应监控器等。另外，自动检测装置可设置有用于检测双链核酸、单链核酸的检测系统。检测系统因检测方式而多样，荧光检测方式中可使用激光照射装置、CCD照相机等。电流检测方式中可使用2电极或3电极电流电压控制装置。另外，自动检测装置可设置有基于所得信号进行自动判定的信号处理系统。也可利用计算机预先内置的数据库和阈值等而基于所得信号来测定样品核酸的序列或判定靶核酸的有无。所述自动化装置可一次处理多个用于检测核酸样品的设备。另外，装置可集全部工程执行于一身，也可由多台分担工程。
本发明的实施方案
以下根据附图说明本发明的实施方案。下述实施方案仅限于示例性详述本发明的结构。因此不应当根据以下实施方案中的记载限制性解释本发明。本发明的范围不仅限于权利要求书中记载的发明范围，也包括以下实施方案的各种变型、改良形式的实施方案。
(1)第一实施方案
图1是显示第一实施方案的用于检测核酸样品的设备11的模式图。用于检测核酸样品的设备11的特征在于设置有基板16、形成于基板上的多个核酸探针固定区域、用于隔开所述核酸探针固定区域的框架17。所述框架17形成1个或多个孔12，所述各孔构成用于检测1种核酸样品的1个检查行道，固定有待检核酸探针的检测核酸探针固定区域13分别形成于各孔12中。
第1～第n孔121-n中分别设置有用于注入第1～第n核酸样品的注入口151～n(以下简称为第1～第n注入口151～n)。第1孔121是用于检测第1核酸样品的孔，第k(k是大于等于2的自然数)孔12k是用于检测第k核酸样品的孔。
其中第1孔121含：
用于检测第1核酸样品的检测核酸探针固定区域131(以下简称第1检测核酸探针固定区域131)和
用于识别第1核酸样品的阳性对照固定区域141(以下简称第1阳性对照固定区域141)，且
第k(k是大于等于2的自然数)孔12k含：
用于检测第k核酸样品的检测核酸探针固定区域13k(以下简称第k检测核酸探针固定区域13k)和
用于识别第k核酸样品的阳性对照固定区域14k(以下简称第k阳性对照固定区域14k)。
具有所述结构的用于检测核酸样品的设备11可检测第1～第n(n是大于等于2的自然数)核酸样品。
图1例示了可检测第1～第4(n＝4)核酸样品(核酸样品S1～S4)的用于检测核酸样品的设备11。第1～第4孔121-4中分别设置有用于注入第1～第4核酸样品的注入口151-4(以下简称为第1～第4注入口151-4)。
“阳性对照固定区域”上分别固定有各不相同的识别用核酸探针。例如，第1阳性对照固定区域141上固定有构成第1阳性对照的核酸探针C1，第2阳性对照固定区域142上固定有构成第2阳性对照的核酸探针C2，第3阳性对照固定区域143上固定有构成第3阳性对照的核酸探针C3，第4阳性对照固定区域144上固定有构成第4阳性对照的核酸探针C4。
“检测核酸探针固定区域”上有与1种以上与待检靶序列互补的核酸探针固定于其分别独立的区域。当待检靶序列有2种以上时检测核酸探针固定区域设置有2个以上独立的固定区域，各固定区域上分别固定有与1个靶序列互补的核酸探针。图1例示了有4个待检靶序列的情况，各孔中用于检测的核酸探针固定区域分别设置有4个独立的固定区域，各固定区域上分别固定有各与1个靶序列互补的核酸探针D1、D2、D3和D4。其中所述“靶序列”指例如具有与待检疾病基因的至少一部分互补的序列的序列。一般情况下，通过聚焦于待检基因的特征序列位点，设计含与所述序列位点互补的序列的核酸探针，并将其固定于检测核酸探针固定区域来进行检测。
图2
图2是显示使用图1所示用于检测核酸样品的设备11检测多个核酸的方法的模式图。
将用于识别第1～第n(n是大于等于2的自然数)核酸样品的试剂分别加入到第1～第n核酸样品中。用于识别第1核酸样品的试剂含具有与固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1互补的序列的“第1阳性对照用核酸”。用于识别第k(k是2～n的自然数)核酸样品的试剂含具有与固定于第k阳性对照固定区域14k的核酸探针C(k)互补的序列的第k阳性对照用核酸。将加入了含所述成分的用于识别第1～第n核酸样品的试剂的第1～第n核酸样品通过设置于第1～第n孔中的第1～第n注入口151-n分别注入到所述第1～第n孔中，从而在第1～第n阳性对照固定区域141-n导致杂交反应，并通过对此进行检测，可确认无第1～第n核酸样品的错用。
图2中，将用于识别第1核酸样品的试剂(试剂1)加入第1核酸样品(样品S1)中(图2a)，将用于识别第2核酸样品的试剂(试剂2)加入第2核酸样品(样品S2)中(图2b)。同样将用于识别第3核酸样品的试剂(试剂3)加入第3核酸样品(样品S3)中，将用于识别第4核酸样品的试剂(试剂4)加入第4核酸样品(样品S4)中。
用于识别第1核酸样品的试剂(试剂1)含具有与固定于第1阳性对照(PC)固定区域141的核酸探针C1互补的序列的核酸T1(图2(a))，用于识别第2核酸样品的试剂(试剂2)含具有与固定于第2阳性对照(PC)固定区域142的核酸探针C2互补的序列的核酸T2(图2(b))。同样，用于识别第3核酸样品的试剂(试剂3)含具有与固定于第3阳性对照固定区域143的核酸探针C3互补的序列的核酸T3，用于识别第4核酸样品的试剂(试剂4)含具有与固定于第4阳性对照固定区域144的核酸探针C4互补的序列的核酸T4。
将加入了用于识别第1～第4核酸样品的试剂(试剂1～4)的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)分别注入到第1～第4孔121～124中。通过设置于第1～第4孔121～124上的第1～第4注入口151～154注入各样品。例如，将加入了用于识别第1核酸样品的试剂(试剂1)的第1核酸样品注入到第1孔121时，试剂1所含核酸T1与固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交(图2(a))。结果，可检测来自形成的杂交链的信号。反之，当把第1核酸样品误注入第2孔122时，试剂1所含核酸T1不能与固定于第2阳性对照固定区域142的核酸探针C2杂交。结果，不能检测来自形成的杂交链的信号，从而可容易且确切证实发生被检物的错用。
(2)第二实施方案
图3
图3是显示第二实施方案的用于检测核酸样品的设备31的模式图。第二实施方案的用于检测核酸样品的设备31除在各孔中含阳性对照固定区域141-n之外，还含第1～第n阴性对照固定区域321-n。
第1阴性对照固定区域321由(n-1)个固定区域构成，各固定区域上分别各固定有固定于第2～第n阳性对照固定区域的各核酸探针C2～Cn；且第k(k是2～n的自然数)阴性对照固定区域32k由(n-1)个固定区域构成，各固定区域上分别各固定有除固定于第k阳性对照固定区域的核酸探针C(k)之外的固定于第1～第n阳性对照固定区域的各核酸探针C1～Cn。
图3例示了可检测第1～第4(n＝4)核酸样品的用于检测核酸样品的设备31。第1阴性对照固定区域321由3个固定区域构成，各固定区域上分别各固定有固定于第2、第3和第4阳性对照固定区域的核酸探针C2、C3和C4；第2阴性对照固定区域322由3个固定区域构成，各固定区域上分别各固定有固定于第1、第3和第4阳性对照固定区域的核酸探针C1、C3和C4；第3阴性对照固定区域323由3个固定区域构成，各固定区域上分别各固定有固定于第1、第2和第4阳性对照固定区域的核酸探针C1、C2和C4；第4阴性对照固定区域324由3个固定区域构成，各固定区域上分别各固定有固定于第1、第2和第3阳性对照固定区域的核酸探针C1、C2和C3。
图4
图4是显示使用图3所示用于检测核酸样品的设备31检测多个核酸的方法的模式图。第二实施方案和第一实施方案的差别在于，通过在各孔中设置阴性对照，从而不仅可检测核酸样品的错用，还可检测核酸样品中是否混入其他核酸样品(污染)。
同第一实施方案一样，将加入了用于识别第1～第4核酸样品的试剂(试剂1～4)的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)分别注入第1～第4孔121～124中。通过设置于第1～第4孔121～124上的第1～第4注入口151～154注入各样品。例如，将加入了用于识别第1核酸样品的试剂(试剂1)的第1核酸样品注入到第1孔121时，试剂1所含核酸T1与固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交(图4(a))。结果，可检测到来自形成的杂交链的信号。而试剂1所含核酸T1不能与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针C2、C3和C4中的任一个杂交(图4(b))。结果，不能从第1阴性对照固定区域321检测到信号，从而可确认没有发生其他核酸样品的混入(污染)。
反之，当从第1阴性对照固定区域321检测到信号时，则可检测出有其他核酸样品的混入。例如，当加入了用于识别第2核酸样品的试剂(试剂2)的第2核酸样品(样品S2)混入第1核酸样品(样品S1)中时(图4(c))，由于第1核酸样品(样品S1)中混入了试剂2所含核酸T2，从而核酸T2与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针C2杂交(图4(d))。结果，可检测到来自形成的杂交链的信号，从而可检测出有其他核酸样品的混入(污染)。第二实施方案在可检测是否发生核酸样品的错用的同时，还可检测有无污染，从而可提供安全性和可靠性更高的检测方法。
(3)第三实施方案
图5
图5是显示第三实施方案的用于检测核酸样品的设备51的模式图。第三实施方案的用于检测核酸样品的设备51并非如第二实施方案中一样在各孔中设置多个阴性对照固定区域，而以由1个固定区域构成为其特征。
第1阴性对照固定区域由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有与固定于第2～第n阳性对照固定区域的各核酸探针C2～C(n)具有同一序列的核酸探针，且第k(k为2～n的自然数)阴性对照固定区域由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有与除固定于第k阳性对照固定区域的核酸探针C(k)之外的固定于第1～第n阳性对照固定区域的各核酸探针具有同一序列的核酸探针。
图5例示了可检测第1～第4(n＝4)核酸样品的用于检测核酸样品的设备51。第1阴性对照固定区域321由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有固定于第2、第3和第4阳性对照固定区域的各核酸探针C2、C3和C4；第2阴性对照固定区域322由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有固定于第1、第3和第4阳性对照固定区域的各核酸探针C1、C3和C4；第3阴性对照固定区域323由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有固定于第1、第2和第4阳性对照固定区域的各核酸探针C1、C2和C4；第4阴性对照固定区域324由1个固定区域构成，在所述固定区域上一同固定有固定于第1、第2和第3阳性对照固定区域的各核酸探针C1、C2和C3。
图6
图6是显示固定于图5所示阴性对照固定区域的核酸探针的模式图。第三实施方案与第二实施方案的差别在于，阴性对照固定区域由1个区域构成。阴性对照与阳性对照不同，随着核酸样品数的增多，所需作为阴性对照的核酸探针数也增多。如果在1个固定区域一并固定多个核酸探针，则即便核酸样品数增多，也不必增加阴性对照固定区域数，与样品数的增减无关，可确保基板上用于检查的充分的空间恒定。
将多个阴性对照设置于1个区域时，所述设置状态有例如：将构成阴性对照的多种核酸探针并列固定的形式(图6(a))、将串联多种核酸探针的核酸链进行固定的形式(图6(b))、另外还有在所述串联多种核酸探针的核酸链中各核酸探针的末端与其他核酸探针的末端重叠的形式(图6(c))等。在多种核酸探针并列固定的形式(图6(a))中，当阴性对照数增加时，也可分成2个或3个区域进行固定。例如，当阴性对照由8种核酸探针构成时，将每4种混合并固定于2个区域；或当阴性对照由9种核酸探针构成时，将每3种混合并固定于3个区域等。当阴性对照数进一步增加时，还可分成4个、5个或更多区域进行固定。
在检查基板日趋小型化的现在，各检查点也表现出微小化的倾向。而且还同时期望进一步增加样品数。样品数增加导致阴性对照数增加，但预期将来可实现的在极微小区域并列混合大量阴性对照时(图6(a))，一个一个的阴性对照的固定量变少，结果可能检测不到足够的信号。但可通过串联多种核酸探针，并在空间上展开(图6(b))来维持一个一个阴性对照的固定量。从而对于将来预期实现的极微小区域，也可将大量阴性对照固定于1个区域上。另外，可通过在串联时将各核酸探针末端与其他核酸探针重合来抑制串联导致的探针长度增大(图6(c))，这尤其对样品数增多的情况有效。
图7
图7是显示使用图5所示用于检测核酸样品的设备51检测多个核酸的方法的模式图。第三实施方案与第二实施方案的差别在于阴性对照固定区域由1个区域构成。可通过使阴性对照固定区域为1个而显著节约阴性对照所必需的基板空间，所述效果会随着样品数的增多而愈加显著。
同第二实施方案一样，将加入了用于识别第1～第4核酸样品的试剂(试剂1～4)的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)分别注入第1～第4孔121～124中。通过设置于第1～第4孔121～124上的第1～第4注入口151～154注入各样品。例如，将加入了用于识别第1核酸样品的试剂(试剂1)的第1核酸样品注入到第1孔121时，试剂1所含核酸T1与固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交(图7a)。结果，可检测到来自形成的杂交链的信号。而试剂1所含核酸T1不能与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针C2、C3和C4中的任一个杂交(图7b)。结果，不能从第1阴性对照固定区域321检测到信号，从而可确认没有发生其他核酸样品的混入(污染)。图7显示了将构成阴性对照的多种核酸探针混合并固定的形式的阴性对照固定区域，但其也可以是串联多种核酸探针并固定的形式(图6b)、将多种核酸探针末端重叠而串联并固定的形式(图6c)中任一种形式的阴性对照固定区域。
反之，从第1阴性对照固定区域321检测到信号时，则可检测出有其他核酸样品的混入。例如，当加入了用于识别第2核酸样品的试剂(试剂2)的第2核酸样品(样品S2)混入第1核酸样品(样品S1)中时(图7c)，由于第1核酸样品(样品S1)中混入了试剂2所含核酸T2，从而核酸T2与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针C2杂交(图7d)。结果，可检测到来自形成的杂交链的信号，从而可检测出有其他核酸样品的混入(污染)。
第三实施方案如第二实施方案一样在可检测出有无核酸样品的错用的同时，还可检测出有无污染，因此可提供安全性和可靠性更高的检测方法。再者，由于第三实施方案将待固定于阴性对照固定区域的核酸探针集中固定于1个区域，从而即便核酸样品数增多，也无需增加阴性对照固定区域数。从而可将检测基板的大部分区域分配给检查项目，因此即便是检查项目数多的核酸样品检测，也可实现在小型基板上一次进行大量检查。
(4)第四实施方案
图8
图8是显示第四实施方案的用于检测核酸样品的设备81的模式图。第四实施方案的特征在于同阳性对照用试剂(“用于判定阳性对照的试剂”)一起制备了新的阴性对照用试剂，混合这些“用于判定阴性对照的试剂”来检测是否有其他核酸样品混入(污染)。
装置的基本结构与第一～第三实施方案相同。即用于检测核酸样品的设备81配备有各设置有用于注入第1～第n核酸样品的注入口151-n的第1～第n孔121-n。
其中第1孔121含：
用于检测第1核酸样品的第1检测核酸探针固定区域131、
用于识别第1核酸样品的第1阳性对照固定区域141和
用于检测第1核酸样品之外的核酸样品混入的第1阴性对照固定区域321，且
第k(k为2～n的自然数)孔12k含：
用于检测第k核酸样品的第k检测核酸探针固定区域13k、
用于识别第k核酸样品的第k阳性对照固定区域14k和
用于检测第k核酸样品之外的核酸样品混入的第k阴性对照固定区域32k。
向第1核酸样品中加入用于判定第1阳性对照的试剂和用于判定第1阴性对照的试剂。用于判定第1阳性对照的试剂与第一～第三实施方案中说明的用于识别第1核酸样品的试剂相同，含“第1阳性对照用核酸”，即与固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1具有互补序列的核酸T1。而用于判定第1阴性对照的试剂含与固定于第2～第n阴性对照固定区域322-n的核酸探针H2～H(n)具有分别互补的序列的核酸U2～U(n)。
同样，向第k核酸样品中加入用于判定第k阳性对照的试剂和用于判定第k阴性对照的试剂。用于判定第k阳性对照的试剂含与固定于第k阳性对照固定区域14k的核酸探针C(k)具有互补序列的核酸T(k)。而用于判定第k阴性对照的试剂含除与固定于第k(k为2～n的自然数)阴性对照固定区域32k的核酸探针H(k)具有互补序列的核酸U(k)之外的，与固定于第1～第n阴性对照固定区域321-n的核酸探针H1～H(n)具有分别互补的序列的核酸U1～U(n)。
可通过使用所述用于判定第1～第n阳性对照的试剂和用于判定第1～第n阴性对照的试剂来将固定于各阴性对照固定区域的核酸探针限定为1种。另外，用于判定阳性对照的试剂和用于判定阴性对照的试剂可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制而作为“用于识别核酸样品的试剂”。另外，“用于识别核酸样品的试剂”中可含任意添加剂，例如用于调整盐浓度的缓冲剂等。
图8例示了可检测第1～第4(n＝4)核酸样品(核酸样品S1-S4)的用于检测核酸样品的设备81。第1～第4孔121-4上分别设置有用于注入第1～第4核酸样品的注入口151-4。
“阳性对照固定区域”上固定有各自不同的用于识别的核酸探针C1～C4。例如，第1阳性对照固定区域141上固定有构成第1阳性对照的核酸探针C1；第2阳性对照固定区域142上固定有构成第2阳性对照的核酸探针C2；第3阳性对照固定区域143上固定有构成第3阳性对照的核酸探针C3；第4阳性对照固定区域144上固定有构成第4阳性对照的核酸探针C4。
“阴性对照固定区域”上固定有与固定于“阳性对照固定区域”的核酸探针C1～C4不同的用于识别的核酸探针H1～H4。例如，第1阴性对照固定区域321上固定有构成第1阴性对照的核酸探针H1；第2阴性对照固定区域322上固定有构成第2阴性对照的核酸探针H2；第3阴性对照固定区域323上固定有构成第3阴性对照的核酸探针H3；第4阴性对照固定区域324上固定有构成第4阴性对照的核酸探针H4。
用于判定第1～第4阳性对照的试剂(试剂1A～4A)与第一～第三实施方案中说明的用于识别第1～第4核酸样品的试剂相同。
以下对用于判定第1～第4阴性对照的试剂(试剂1B～4B)进行说明。
首先，用于判定第1阴性对照的试剂(试剂1B)是加入到第1核酸样品的试剂。试剂1B是含以下3个核酸U2、U3、U4的试剂：
核酸U2：与固定于第2阴性对照(NC)固定区域322的核酸探针H2具有互补序列的核酸；
核酸U3：与固定于第3阴性对照(NC)固定区域323的核酸探针H3具有互补序列的核酸；
核酸U4：与固定于第4阴性对照(NC)固定区域324的核酸探针H4具有互补序列的核酸。
将用于判定第1阴性对照的试剂(试剂1B)和用于判定第1阳性对照的试剂(试剂1A)一同加入第1核酸样品(样品S1)中。其中，试剂1A与试剂1B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂1E”。
其次，用于判定第2阴性对照的试剂(试剂2B)是加入到第2核酸样品的试剂。试剂2B是含以下3个核酸U1、U3、U4的试剂：
核酸U1：与固定于第1阴性对照(NC)固定区域321的核酸探针H1具有互补序列的核酸；
核酸U3：与固定于第3阴性对照(NC)固定区域323的核酸探针H3具有互补序列的核酸；
核酸U4：与固定于第4阴性对照(NC)固定区域324的核酸探针H4具有互补序列的核酸。
将用于判定第2阴性对照的试剂(试剂2B)和用于判定第2阳性对照的试剂(试剂2A)一同加入第2核酸样品(样品S2)中。其中，试剂2A与试剂2B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂2E”。
再次，用于判定第3阴性对照的试剂(试剂3B)是加入到第3核酸样品的试剂。试剂3B是含以下3个核酸U1、U2、U4的试剂：
核酸U1：与固定于第1阴性对照(NC)固定区域321的核酸探针H1具有互补序列的核酸；
核酸U2：与固定于第2阴性对照(NC)固定区域322的核酸探针H2具有互补序列的核酸；
核酸U4：与固定于第4阴性对照(NC)固定区域324的核酸探针H4具有互补序列的核酸。
将用于判定第3阴性对照的试剂(试剂3B)和用于判定第3阳性对照的试剂(试剂3A)一同加入第3核酸样品(样品S3)中。其中，试剂3A与试剂3B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂3E”。
最后，用于判定第4阴性对照的试剂(试剂4B)是加入到第4核酸样品的试剂。试剂4B是含以下3个核酸U1、U2、U3的试剂：
核酸U1：与固定于第1阴性对照(NC)固定区域321的核酸探针H1具有互补序列的核酸；
核酸U2：与固定于第2阴性对照(NC)固定区域322的核酸探针H2具有互补序列的核酸；
核酸U3：与固定于第3阴性对照(NC)固定区域323的核酸探针H3具有互补序列的核酸。
将用于判定第4阴性对照的试剂(试剂4B)和用于判定第4阳性对照的试剂(试剂4A)一同加入第4核酸样品(样品S4)中。其中，试剂4A与试剂4B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂4E”。
图9
图9是显示使用图8所示用于检测核酸样品的设备81检测多个核酸的方法的模式图。
将加入了试剂1A和1B的第1核酸样品(样品S1)通过注入口151注入到孔121中。此时，试剂1A所含核酸T1与固定于阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交，从而检测到源自所述杂交链的信号(图9a)。而试剂1B所含核酸U2、U3、U4均不能与固定于阴性对照固定区域321的核酸探针H1杂交，从而不能从阴性对照固定区域检测到信号(图9b)。
同样，将加入了试剂2A和2B的第2核酸样品(样品S2)通过注入口152注入到孔122中。此时，试剂2A所含核酸T2与固定于阳性对照固定区域142的核酸探针C2杂交，从而检测到源自所述杂交链的信号(图9c)。而试剂2B所含核酸U1、U3、U4均不能与固定于阴性对照固定区域322的核酸探针H2杂交，从而不能从阴性对照固定区域检测到信号(图9d)。相同的反应机制对于以下第3核酸样品(样品S3)、第4核酸样品(样品S4)也成立。
现对第1核酸样品(样品S1)中混入第2核酸样品(样品S2)(污染)的情况进行说明(图9e)。样品S2混入样品S1时，加入到样品S2中的试剂2B所含核酸U1与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针H1杂交，从而检测到源自所述杂交链的信号(图9f)。可通过从阴性对照固定区域321检测到信号来确认有其他核酸样品混入(污染)。
第四实施方案的特征在于配制新的用于判定阴性对照的试剂而将固定于第1～第n阴性对照固定区域的核酸探针数分别限制为1种。在第四实施方案中，即便核酸样品数增加，固定于各阴性对照固定区域的核酸探针数仍为1种。从而无需随着核酸样品数的增减而对阴性对照固定区域进行设计上的变更，从而可简便且快速地提供用于检测大量核酸探针的设备。
(5)第五实施方案
图10
图10是显示第五实施方案的多核酸检测方法的模式图。第五实施方案与第四实施方案的差异在于所使用的用于判定阴性对照的试剂。在第五实施方案中使用的用于判定阴性对照的试剂含具有使固定于阴性对照固定区域的核酸探针H1～H(n)与用于判定阳性对照的试剂所含核酸T1～T(n)串联的接头序列的核酸V1～V(n)。由于通过使用所述具有接头序列的核酸V1～V(n)(以下简称接头序列V1～V(n))可加长由阴性对照形成的杂交链的长度，从而可使检测敏感度更高。
第五实施方案同第四实施方案一样可使用图8所示用于检测核酸样品的设备81。以下例示第五实施方案的使用用于检测核酸样品的设备81检测第1～第4核酸样品的方法。
首先对用于判定第1～第4阴性对照的试剂(试剂1B～4B)进行说明。
用于判定第1阴性对照的试剂(试剂1B)是加入到第1核酸样品的试剂。试剂1B是含核酸V2、V3、V4的试剂。
核酸V2的一端具有与固定于第2阴性对照固定区域322的核酸探针H2互补的序列、且另一端具有与和固定于第2阳性对照固定区域142的核酸探针C2杂交的“核酸T2”互补的序列。
核酸V3的一端具有与固定于第3阴性对照固定区域323的核酸探针H3互补的序列、且另一端具有与和固定于第3阳性对照固定区域143的核酸探针C3杂交的“核酸T3”互补的序列。
核酸V4的一端具有与固定于第4阴性对照固定区域324的核酸探针H4互补的序列、且另一端具有与和固定于第4阳性对照固定区域144的核酸探针C4杂交的“核酸T4”互补的序列。
将用于判定第1阴性对照的试剂(试剂1B)和用于判定第1阳性对照的试剂(试剂1A)一同加入第1核酸样品(样品S1)中。其中，试剂1A与试剂1B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂1E”。
其次，用于判定第2阴性对照的试剂(试剂2B)是加入到第2核酸样品的试剂。试剂2B是含核酸V1、V3、V4的试剂。
核酸V1的一端具有与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针H1互补的序列、且另一端具有与和固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交的“核酸T1”互补的序列。
核酸V3的一端具有与固定于第3阴性对照固定区域323的核酸探针H3互补的序列、且另一端具有与和固定于第3阳性对照固定区域143的核酸探针C3杂交的“核酸T3”互补的序列。
核酸V4的一端具有与固定于第4阴性对照固定区域324的核酸探针H4互补的序列、且另一端具有与和固定于第4阳性对照固定区域144的核酸探针C4杂交的“核酸T4”互补的序列。
将用于判定第2阴性对照的试剂(试剂2B)和用于判定第2阳性对照的试剂(试剂2A)一同加入第2核酸样品(样品S2)中。其中，试剂2A与试剂2B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂2E”。
再次，用于判定第3阴性对照的试剂(试剂3B)是加入到第3核酸样品的试剂。试剂3B是含核酸V1、V2、V4的试剂。
核酸V1的一端具有与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针H1互补的序列、且另一端具有与和固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交的“核酸T1”互补的序列。
核酸V2的一端具有与固定于第2阴性对照固定区域322的核酸探针H2互补的序列、且另一端具有与和固定于第2阳性对照固定区域142的核酸探针C2杂交的“核酸T2”互补的序列。
核酸V4的一端具有与固定于第4阴性对照固定区域324的核酸探针H4互补的序列、且另一端具有与和固定于第4阳性对照固定区域144的核酸探针C4杂交的“核酸T4”互补的序列。
将用于判定第3阴性对照的试剂(试剂3B)和用于判定第3阳性对照的试剂(试剂3A)一同加入第3核酸样品(样品S3)中。其中，试剂3A与试剂3B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂3E”。
最后，用于判定第4阴性对照的试剂(试剂4B)是加入到第4核酸样品的试剂。试剂4B是含核酸V1、V2、V3的试剂。
核酸V1的一端具有与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针H1互补的序列、且另一端具有与和固定于第1阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交的“核酸T1”互补的序列。
核酸V2的一端具有与固定于第2阴性对照固定区域322的核酸探针H2互补的序列、且另一端具有与和固定于第2阳性对照固定区域142的核酸探针C2杂交的“核酸T2”互补的序列。
核酸V3的一端具有与固定于第3阴性对照固定区域323的核酸探针H3互补的序列、且另一端具有与和固定于第3阳性对照固定区域143的核酸探针C3杂交的“核酸T3”互补的序列。
将用于判定第4阴性对照的试剂(试剂4B)和用于判定第4阳性对照的试剂(试剂4A)一同加入第4核酸样品(样品S4)中。其中，试剂4A与试剂4B可为独立的试剂，也可从一开始就混合配制，例如作为“用于识别核酸样品的试剂4E”。
其次对第五实施方案的检测原理进行说明。
将加入了试剂1A和1B的第1核酸样品(样品S1)通过注入口151注入到孔121中。此时，试剂1A所含核酸T1与固定于阳性对照固定区域141的核酸探针C1杂交，从而检测到源自所述杂交链的信号(图10a)。而试剂1B所含核酸V2、V3、V4均不能与固定于阴性对照固定区域321的核酸探针H1杂交，从而不能从阴性对照固定区域检测到信号(图10b)。
同样，将加入了试剂2A和2B的第2核酸样品(样品S2)通过注入口152注入到孔122中。此时，试剂2A所含核酸T2与固定于阳性对照固定区域142的核酸探针C2杂交，从而检测到源自所述杂交链的信号(图10c)。而试剂2B所含核酸V1、V3、V4均不能与固定于阴性对照固定区域322的核酸探针H2杂交，从而不能从阴性对照固定区域检测到信号(图10d)。相同的反应机制对于以下第3核酸样品(样品S3)、第4核酸样品(样品S4)也成立。
现对第1核酸样品(样品S1)中混入第2核酸样品(样品S2)(污染)的情况进行说明(图10e)。样品S2混入样品S1时，加入到样品S2中的试剂2B所含核酸V1在其一端与固定于第1阴性对照固定区域321的核酸探针H1杂交。此时试剂1A所含核酸T1与核酸V1的另一端单链部分杂交，从而形成整体的长双链区域(图10f)。采用特异性识别双链区域的检测方法时，例如使用电化学方法，由于长的双链区域可结合更多嵌入剂，从而可检测到的电量变多，结果实现更高的检测灵敏度。从而可更精确并可靠检测出有无其他核酸样品的混入(污染)。
图11
图11是显示图10所示用于判定阴性对照的试剂中构成用于判定第1阴性对照的试剂(试剂1B)的核酸形式的模式图。
试剂1B中有将试剂1B中所含核酸V2、V3、V4作为各自独立的核酸配制的形式(图11a)、作为互相串联的1个核酸配制的形式(图11b)和通过设计为将各核酸探针的末端与其他核酸探针末端重叠而相互串联，从而将序列全长缩短的形式(图11c)。当然对于用于判定第2～第n阴性对照的试剂(试剂2B～(n)B)也具有同样形式。
随着核酸样品数的增加，用于判定阴性对照的试剂中所含核酸种类也增加。可通过串联各核酸试剂(图11b)而减少独立的核酸种类，从而可快速且容易地提供用于判定阴性对照的试剂。另外，在各核酸串联的情况下，可通过将其末端重叠(图11c)而缩短各核酸的全长，这对于核酸样品数增加的情况尤其有效。
(6)用于检测核酸样品的试剂盒
可提供可用于上述第一～第五实施方案的用于检测核酸样品的试剂盒。用于检测核酸样品的试剂盒中含可用于第一～第五实施方案的用于检测核酸样品的设备和用于识别第1～第n(n为大于等于2的自然数)核酸样品的试剂。在用于检测核酸样品的设备的检测核酸探针固定区域上固定有与作为被检对象的特定疾病基因具有互补序列的核酸探针，通过将多核酸样品用试剂盒所含用于识别核酸样品的试剂处理后，注入用于检测核酸样品的设备而同时且快速得到检测结果。
试剂盒中所含用于检测核酸样品的设备可为用于检测1个核酸样品的各检测行道整体形成于一个基板上，或各检测行道形成于独立的基板上。例如，可为检测8个核酸样品而使用2个含4个检测行道的基板；也可为检测9个的核酸样品而使用3个含3个检测行道的基板。
另外，用于识别第1～第n核酸样品的试剂可由各自独立的用于判定第1～第n阳性对照的试剂和用于判定第1～第n阴性对照的试剂构成，也可有任意的添加剂(如用于调节盐浓度的缓冲剂等)作为试剂存在。
实施例
实施例1(第一实施方案)
1.所用仪器、所用材料等
(1)用于检测核酸样品的设备
本实施例中使用的用于检测核酸样品的设备的基本结构如图1所示。即在各孔中形成1个阳性对照固定区域和1个以上的检测核酸探针固定区域。在本实施例中，如图1所示，检测项目数为4，在各孔中形成各自独立固定了核酸探针D1～D4的4个检测核酸探针固定区域。
另外，本实施例中使用了可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备。即各孔中形成的多个核酸探针固定区域均具有金电极，可检测源自形成于各固定区域的双链核酸的电信号。可由特异性结合双链核酸的嵌入剂得到电信号。本实施例中使用“Hoechst 33258”作为嵌入剂。
(2)核酸探针
固定于阳性对照固定区域141-4的核酸探针C1～C4的序列如下：
C1：TTCAGTTATGTGGATGAT
C2：TCAGTTATGTCGATGATG
C3：TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4：TTTCAGTTATGTAGATGATG。
固定于检测核酸探针固定区域131-4的核酸探针D1～D4的序列如下：
D1：ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2：TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3：TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4：AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
(3)用于判定的试剂
阳性对照判定试剂(试剂1～4)所含核酸T1～T4的序列如下：
试剂1(含核酸T1(与C1互补的序列))
试剂2(含核酸T2(与C2互补的序列))
试剂3(含核酸T3(与C3互补的序列))
试剂4(含核酸T4(与C4互补的序列))
(4)核酸样品
作为被检对象的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)的序列含以下序列：
样品S1：(含与检测核酸探针D1互补的序列)
样品S2：(含与检测核酸探针D2互补的序列)
样品S3：(含与检测核酸探针D3互补的序列)
样品S4：(含与检测核酸探针D4互补的序列)
2.实验步骤
向第1～第4核酸样品(样品S1～S4)中同用于调节盐浓度的缓冲剂一起分别加入阳性对照判定试剂(试剂1～4)。然后将样品S1～S4分别通过注入口注入第1～第4孔中。注入各样品后，于45℃下进行10分钟的杂交反应，接下来向各孔中加入用于洗涤的缓冲剂，并于30℃下进行10分钟的洗涤反应，以除去非特异性吸附的核酸。随后检测第1～第4各孔中的阳性对照固定区域上有无反应，并检测第1～第4各孔中的检测核酸探针固定区域上有无反应。检测有无反应是通过向各孔中注入嵌入剂分子(50μM Hoechst 33258)，向各电极施加电压，并测定嵌入剂分子的氧化电流来进行的。
随后为模拟样品错用，故意将S1和S2调换，并同样进行反应。显示电流值的测定结果的图像如图13所示。
3.实验结果
图12是将分别从样品S1～S4检测出的电流值以柱形图表示的图。S1～S4是指第1～第4各核酸样品S1～S4。阳性对照用探针(PCP)是指固定于阳性对照固定区域的核酸探针，展示了固定于各孔中的核酸探针C1～C4的电流值。检测用探针(DP)是指固定于检测核酸探针固定区域的核酸探针，展示了固定于各孔中的4个核酸探针D1～D4的电流值。
本实施例中使用的可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备在核酸形成双链时可检测到特定阈值以上的电流值。反之，当未形成双链时可检测到阈值以下的电流值。可检测到小电流值的原因被认为是通过洗涤操作未完全除去的非特异性吸附的核酸所致。
如图12所示，从全部4个孔的阳性对照用探针(PCP)得到阈值以上的电流值，从而可确认无各核酸样品间的错用。其中所述阈值是40nA，而在核酸样品S1中检测到的电流值是61nA，在核酸样品S2中检测到的电流值是72nA，在核酸样品S3中检测到的电流值是62nA，在核酸样品S4中检测到的电流值是69nA。
从而可从得自检测核酸探针固定区域D1～D4的电流值表征各核酸样品所含核酸的序列。即对于核酸样品S1，由于可从核酸探针D1检测到82nA，从而可确认核酸样品S1中含与核酸探针D1互补的序列。而对于核酸样品S2，由于可从核酸探针D2检测到62nA，从而可确认核酸样品S2中含与核酸探针D2互补的序列。而对于核酸样品S3，由于可从核酸探针D3检测到73nA，从而可确认核酸样品S3中含与核酸探针D3互补的序列。而对于核酸样品S4，由于可从核酸探针D4检测到66nA，从而可确认核酸样品S4中含与核酸探针D4互补的序列。
如图13所示，从第1孔和第2孔中的阳性对照用探针(PCP)上得不到阈值以上的电流值，从而可确证有核酸样品错用。其中所述阈值是40nA，而在核酸样品S1中检测到的电流值是19nA，在核酸样品S2中检测到的电流值是17nA，在核酸样品S3中检测到的电流值是70nA，在核酸样品S4中检测到的电流值是72nA。
此外，可确认核酸样品S3、S4间无样品错用，从而可得到正确的检查结果。即对于核酸样品S3，由于可从核酸探针D3检测到66nA，从而可确认核酸样品S3中含与核酸探针D3互补的序列。而对于核酸样品S4，由于可从核酸探针D4检测到73nA，从而可确认核酸样品S4中含与核酸探针D4互补的序列。
实施例2(第二实施方案)
1.所用仪器、所用材料等
(1)用于检测核酸样品的设备
本实施例中使用的用于检测核酸样品的设备的基本结构如图3所示。即在各孔中形成1个阳性对照固定区域、3个阴性对照固定区域和1个以上的检测核酸探针固定区域。在本实施例中，如图3所示，检测项目数为4，在各孔中形成各自独立固定了核酸探针D1～D4的4个检测核酸探针固定区域。另外，本实施例中同实施例1一样使用了可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备。
(2)核酸探针、用于判定的试剂
均如实施例1中所示。其中实施例2中使用了阴性对照固定区域321-4。固定于阴性对照固定区域321-4的核酸探针C1～C4与固定于阳性对照固定区域141-4的核酸探针C1～C4相同。
(3)核酸样品
作为被检对象的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)的序列含以下序列：
样品S1：(含与检测核酸探针D1互补的序列)
样品S2：(含与检测核酸探针D2互补的序列)
样品S3：(含与检测核酸探针D3互补的序列)
样品S4：(含与检测核酸探针D4互补的序列)
2.实验步骤
向第1～第4核酸样品(样品S1～S4)中同用于调节盐浓度的缓冲剂一起分别加入阳性对照判定试剂(试剂1～4)。然后将样品S1～S4分别通过注入口注入第1～第4孔中，但为模拟样品混入，向第1孔中注入故意混合S1和S2的样品(S1+S2)。注入各样品后，于45℃下进行10分钟的杂交反应，接下来向各孔中加入用于洗涤的缓冲剂，并于30℃下进行10分钟的洗涤反应，以除去非特异性吸附的核酸。随后检测第1～第4各孔中的阳性对照固定区域上有无反应，检测第1～第4各孔中的阴性对照固定区域上有无反应，并检测第1～第4各孔中的检测核酸探针固定区域上有无反应。检测有无反应同实施例1一样，是通过向各孔中注入嵌入剂分子(50μM Hoechst 33258)，向各电极施加电压，并测定嵌入剂分子的氧化电流来进行的。显示电流值的测定结果的图像如图14所示。
3.实验结果
图13是将分别从样品S1～S4检测出的电流值以柱形图表示的图。S1～S4是指第1～第4各核酸样品S1～S4。阳性对照用探针(PCP)是指固定于阳性对照固定区域的核酸探针，显示了固定于各孔中的核酸探针C1～C4的电流值。阴性对照用探针(NCP)是指固定于阴性对照固定区域的核酸探针，表示固定于各孔中的核酸探针C1～C4的电流值。检测用探针(DP)是指固定于检测核酸探针固定区域的核酸探针，表示固定于各孔中的4个核酸探针D1～D4的电流值。
本实施例中使用的可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备同实施例1一样，在核酸形成双链时可检测到特定阈值以上的电流值；反之，当未形成双链时可检测到阈值以下的电流值。
如图14所示，从全部4个孔的阳性对照用探针(PCP)得到阈值以上的电流值，从而可确认无各核酸样品间的错用。其中所述阈值是40nA，而在核酸样品S1中检测到的电流值是71nA，在核酸样品S2中检测到的电流值是66nA，在核酸样品S3中检测到的电流值是70nA，在核酸样品S4中检测到的电流值是73nA。
另外，可通过从第1孔的阴性对照用探针(NCP)得到阈值以上的电流值来确证有其他核酸样品的混入(污染)。
此外，可确认核酸样品S2、S3、S4中无样品混入，从而可得到正确的检查结果。即对于核酸样品S2，由于可从核酸探针D2检测到72nA，从而可确认核酸样品S2中含与核酸探针D2互补的序列。而对于核酸样品S3，由于可从核酸探针D3检测到69nA，从而可确认核酸样品S3中含与核酸探针D3互补的序列。而对于核酸样品S4，由于可从核酸探针D4检测到72nA，从而可确认核酸样品S4中含与核酸探针D4互补的序列。
实施例3(第三实施方案)
1.所用仪器、所用材料等
(1)用于检测核酸样品的设备
本实施例中使用的用于检测核酸样品的设备的基本结构如图5所示。即在各孔中形成1个阳性对照固定区域、1个阴性对照固定区域和1个以上的检测核酸探针固定区域。在1个阴性对照固定区域混合固定有3种不同的核酸探针。在本实施例中，如图5所示，检测项目数为4，在各孔中形成各自独立固定了核酸探针D1～D4的4个检测核酸探针固定区域。另外，本实施例中同实施例1和2一样使用了可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备。
(2)核酸探针、用于判定的试剂
均如实施例1中所示。其中实施例3中使用了阴性对照固定区域321-4。固定于阴性对照固定区域321-4的核酸探针C1～C4与固定于阳性对照固定区域141-4的核酸探针C1～C4相同。
(3)核酸样品
作为被检对象的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)的序列含以下序列：
样品S1：(含与检测核酸探针D1互补的序列)
样品S2：(含与检测核酸探针D2互补的序列)
样品S3：(含与检测核酸探针D3互补的序列)
样品S4：(含与检测核酸探针D4互补的序列)
2.实验步骤
向第1～第4核酸样品(样品S1～S4)中同用于调节盐浓度的缓冲剂一起分别加入阳性对照判定试剂(试剂1～4)。然后将样品S1～S4分别通过注入口注入第1～第4孔中，但为模拟样品错用，故意调换注入S3和S4。注入各样品后，于45℃下进行10分钟的杂交反应，接下来向各孔中加入用于洗涤的缓冲剂，并于30℃下进行10分钟的洗涤反应，以除去非特异性吸附的核酸。随后检测第1～第4各孔中的阳性对照固定区域上有无反应，检测第1～第4各孔中的阴性对照固定区域上有无反应，并检测第1～第4各孔中的检测核酸探针固定区域上有无反应。检测有无反应同实施例1一样，是通过向各孔中注入嵌入剂分子(50μM Hoechst 33258)，向各电极施加电压，并测定嵌入剂分子的氧化电流来进行的。显示电流值的测定结果的图像如图15所示。
3.实验结果
图15所示各标记与图14相同。在本实施例中，在1个阳性对照固定区域混合固定有3种不同的核酸探针。
本实施例中使用的可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备同实施例1和2一样，在核酸形成双链时可检测到特定阈值以上的电流值；反之，当未形成双链时可检测到阈值以下的电流值。
如图15所示，不能从第3孔和第4孔中的阳性对照用探针(PCP)上得到阈值以上的电流值，从而可确证有核酸样品错用。其中所述阈值是40nA，而在核酸样品S1中检测到的电流值是62nA，在核酸样品S2中检测到的电流值是68nA，在核酸样品S3中检测到的电流值是22nA，在核酸样品S4中检测到的电流值是25nA。
另外，从第3孔和第4孔中的阴性对照用探针(NCP)上得到阈值以上的电流值，从此结果也可确证有核酸样品错用。
此外，可确认核酸样品S1、S2无污染，从而可得到正确的检查结果。即对于核酸样品S1，由于可从核酸探针D1检测到65nA，从而可确认核酸样品S1中含与核酸探针D1互补的序列。而对于核酸样品S2，由于可从核酸探针D2检测到72nA，从而可确认核酸样品S2中含与核酸探针D2互补的序列。
实施例4(第四实施方案)
1.所用仪器、所用材料等
(1)用于检测核酸样品的设备
本实施例中除使用实施例1～3中使用的用于判定阳性对照的试剂1A～4A之外，还使用用于判定阴性对照的试剂1B～4B来检测有无被检物的错用或污染。
本实施例中使用的用于检测核酸样品的设备的基本结构如图8所示。即在各孔中形成1个阳性对照固定区域、1个阴性对照固定区域和1个以上的检测核酸探针固定区域。在1个阴性对照固定区域上固定有与固定于阳性对照固定区域的核酸探针C1～C4不同的核酸探针H1～H4。核酸探针H1～H4可由阴性对照用试剂1B～4B进行检测。在本实施例中，如图8所示，检测项目数为4，在各孔中形成各自独立固定了核酸探针D1～D4的4个检测核酸探针固定区域。另外，本实施例中同实施例1～3一样使用了可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备。
(2)核酸探针
固定于阳性对照固定区域141-4的核酸探针C1～C4的序列如下(同实施例1)：
C1：TTCAGTTATGTGGATGAT
C2：TCAGTTATGTCGATGATG
C3：TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4：TTTCAGTTATGTAGATGATG
固定于阴性对照固定区域321-4的核酸探针H1～H4的序列如下：
H1：TCCGGGCGCAGAAAC
H2：GTGCTGCAGGTGCG
H3：CGTGATGACACCAAG
H4：ATGCTTTCCGTGGCA
固定于检测核酸探针固定区域131-4的核酸探针D1～D4的序列如下(同实施例1)：
D1：ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2：TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3：TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4：AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
(3)用于判定的试剂
阳性对照判定试剂(试剂1A～4A)所含核酸T1～T4的序列如下：
试剂1A(含核酸T1(与C1互补的序列))
试剂2A(含核酸T2(与C2互补的序列))
试剂3A(含核酸T3(与C3互补的序列))
试剂4A(含核酸T4(与C4互补的序列))
阴性对照判定试剂(试剂1B～4B)所含核酸U1～U4的序列如下：
试剂1B(含核酸U1(与H1互补的序列))
试剂2B(含核酸U2(与H2互补的序列))
试剂3B(含核酸U3(与H3互补的序列))
试剂4B(含核酸U4(与H4互补的序列))
(4)核酸样品
作为被检对象的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)的序列含以下序列：
样品S1：(含与检测核酸探针D1互补的序列)
样品S2：(含与检测核酸探针D2互补的序列)
样品S3：(含与检测核酸探针D3互补的序列)
样品S4：(含与检测核酸探针D4互补的序列)
2.实验步骤
向第1～第4核酸样品(样品S1～S4)中同用于调节盐浓度的缓冲剂一起分别加入阳性对照判定试剂(试剂1A～4A)和阴性对照判定试剂(试剂1B～4B)。然后将样品S1～S4分别通过注入口注入第1～第4孔中。注入各样品后，于45℃下进行10分钟的杂交反应，接下来向各孔中加入用于洗涤的缓冲剂，并于30℃下进行10分钟的洗涤反应，以除去非特异性吸附的核酸。随后检测第1～第4各孔中的阳性对照固定区域上有无反应，检测第1～第4各孔中的阴性对照固定区域上有无反应，并检测第1～第4各孔中的检测核酸探针固定区域上有无反应。检测有无反应同实施例1一样，是通过向各孔中注入嵌入剂分子(50μMHoechst 33258)，向各电极施加电压，并测定嵌入剂分子的氧化电流来进行的。显示电流值的测定结果的图像如图16所示。
然后，为模拟样品错用，故意调换S1和S2而进行同样的检测。显示电流值的测定结果的图像如图17所示。
3.实验结果
图16所示各标记与图14和15相同。在本实施例的阴性对照固定区域上固定有与固定于阳性对照固定区域的核酸探针C1～C4不同的核酸探针H1～H4。
本实施例中使用的可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备同实施例1～3一样，在核酸形成双链时可检测到特定阈值以上的电流值；反之，当未形成双链时可检测到阈值以下的电流值。
如图16所示，从全部4个孔的阳性对照用探针(PCP)得到阈值以上的电流值，从而可确认无各核酸样品间的错用。其中所述阈值是40nA，而在核酸样品S1中检测到的电流值是60nA，在核酸样品S2中检测到的电流值是72nA，在核酸样品S3中检测到的电流值是68nA，在核酸样品S4中检测到的电流值是71nA。
另外，从全部4个孔的阴性对照用探针(NCP)上得不到阈值40nA以上的电流值，从而可确认无其他核酸样品的混入(污染)。
从而可从得自检测核酸探针固定区域D1～D4的电流值表征各核酸样品所含核酸的序列。即对于核酸样品S1，由于可从核酸探针D1检测到56nA，从而可确认核酸样品S1中含与核酸探针D1互补的序列。而对于核酸样品S2，由于可从核酸探针D2检测到67nA，从而可确认核酸样品S2中含与核酸探针D2互补的序列。而对于核酸样品S3，由于可从核酸探针D3检测到56nA，从而可确认核酸样品S3中含与核酸探针D3互补的序列。而对于核酸样品S4，由于可从核酸探针D4检测到72nA，从而可确认核酸样品S4中含与核酸探针D4互补的序列。
再如图17所示，从第1孔和第2孔中的阳性对照用探针(PCP)上得不到阈值以上的电流值，从而可确证有核酸样品错用。其中所述阈值是40nA，而在核酸样品S1中检测到的电流值是18nA，在核酸样品S2中检测到的电流值是16nA，在核酸样品S3中检测到的电流值是78nA，在核酸样品S4检测到的电流值是81nA。
此外，可确认核酸样品S3、S4中无样品错用，从而可得到正确的检查结果。即对于核酸样品S3，由于可从核酸探针D3检测到62nA，从而可确认核酸样品S3中含与核酸探针D3互补的序列。而对于核酸样品S4，由于可从核酸探针D4检测到71nA，从而可确认核酸样品S4中含与核酸探针D4互补的序列。
实施例5(第五实施方案)
1.所用仪器、所用材料等
(1)用于检测核酸样品的设备
本实施例中除使用实施例1～4中使用的用于判定阳性对照的试剂1A～4A之外，还使用用于判定阴性对照的试剂1B～4B来检测有无被检物的错用或污染。
本实施例中使用的用于检测核酸样品的设备的基本结构如图8所示。即在各孔中形成1个阳性对照固定区域、1个阴性对照固定区域和1个以上的检测核酸探针固定区域。在1个阴性对照固定区域上固定有与固定于阳性对照固定区域的核酸探针C1～C4不同的核酸探针H1～H4。核酸探针H1～H4可由阴性对照用试剂1B～4B进行检测。在本实施例中，如图8所示，检测项目数为4，在各孔中形成各自独立固定了核酸探针D1～D4的4个检测核酸探针固定区域。另外，本实施例中同实施例1～4一样使用了可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备。
(2)核酸探针
固定于阳性对照固定区域141-4的核酸探针C1～C4的序列如下(同实施例1)：
C1：TTCAGTTATGTGGATGAT
C2：TCAGTTATGTCGATGATG
C3：TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4：TTTCAGTTATGTAGATGATG
固定于阴性对照固定区域321-4的核酸探针H1～H4的序列如下：
H1：TCCGGGCGCAGAAAC
H2：GTGCTGCAGGTGCG
H3：CGTGATGACACCAAG
H4：ATGCTTTCCGTGGCA
固定于检测核酸探针固定区域131-4的核酸探针D1～D4的序列如下(同实施例1)：
D1：ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2：TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3：TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4：AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
阳性对照判定试剂(试剂1A～4A)所含核酸T1～T4的序列如下：
试剂1A(含核酸T1(与C1互补的序列))
试剂2A(含核酸T2(与C2互补的序列))
试剂3A(含核酸T3(与C3互补的序列))
试剂4A(含核酸T4(与C4互补的序列))
阴性对照判定试剂(试剂1B～4B)所含核酸V1～V4的序列如下：
试剂1B(含核酸V1(与H1互补的序列+与T1互补的序列))
试剂2B(含核酸V2(与H2互补的序列+与T2互补的序列))
试剂3B(含核酸V3(与H3互补的序列+与T3互补的序列))
试剂4B(含核酸V4(与H4互补的序列+与T4互补的序列))。
(4)核酸样品
作为被检对象的第1～第4核酸样品(样品S1～S4)的序列含以下序列：
样品S1：(含与检测核酸探针D1互补的序列)
样品S2：(含与检测核酸探针D2互补的序列)
样品S3：(含与检测核酸探针D3互补的序列)
样品S4：(含与检测核酸探针D4互补的序列)
2.实验步骤
向第1～第4核酸样品(样品S1～S4)中同用于调节盐浓度的缓冲剂一起分别加入阳性对照判定试剂(试剂1A～4A)和阴性对照判定试剂(试剂1B～4B)。然后将样品S1～S4分别通过注入口注入第1～第4孔中，但为模拟样品混入，向第3孔中注入故意混合S3和S4的样品(S3+S4)。注入各样品后，于45℃下进行10分钟的杂交反应，接下来向各孔中加入用于洗涤的缓冲剂，并于30℃下进行10分钟的洗涤反应，以除去非特异性吸附的核酸。随后检测第1～第4各孔中的阳性对照固定区域上有无反应，检测第1～第4各孔中的阴性对照固定区域上有无反应，并检测第1～第4各孔中的检测核酸探针固定区域上有无反应。检测有无反应同实施例1一样，是通过向各孔中注入嵌入剂分子(50μM Hoechst 33258)，向各电极施加电压，并测定嵌入剂分子的氧化电流来进行的。显示电流值的测定结果的图像如图18所示。
3.实验结果
图18所示各标记与图17相同。在本实施例的阴性对照固定区域上固定有与固定于阳性对照固定区域的核酸探针C1～C4不同的核酸探针H1～H4。
本实施例中使用的可进行电化学检测的用于检测核酸样品的设备同实施例1～4一样，在核酸形成双链时可检测到特定阈值以上的电流值；反之，当未形成双链时可检测到阈值以下的电流值。
如图18所示，从全部4个孔的阳性对照用探针(PCP)得到阈值以上的电流值，从而可确认无各核酸样品间的错用。其中所述阈值是40nA，而在核酸样品S1中检测到的电流值是66nA，在核酸样品S2中检测到的电流值是65nA，在核酸样品S3中检测到的电流值是77nA，在核酸样品S4中检测到的电流值是81nA。
另外，可从第3孔的阴性对照用探针(NCP)得到阈值以上的电流值，从而可确证有其他核酸样品的混入(污染)。
此外，可确认核酸样品S1、S2、S4中无样品混入，从而可得到正确的检查结果。即对于核酸样品S1，由于可从核酸探针D1检测到63nA，从而可确认核酸样品S1中含与核酸探针D1互补的序列。而对于核酸样品S2，由于可从核酸探针D2检测到72nA，从而可确认核酸样品S2中含与核酸探针D2互补的序列。而对于核酸样品S4，由于可从核酸探针D4检测到62nA，从而可确认核酸样品S4中含与核酸探针D4互补的序列。
本领域技术人员容易知晓其他优点及改进。所以本发明的范围不局限于本文所述发明详述及代表性实施方案。所以可在不脱离本发明的权利要求书或其相当的描述定义的本发明的总发明概念的精神和范围的情况下，对本发明进行各种修饰。
【序列表】
<110>Kabushiki Kaisha Toshiba
<120>多核酸检测方法
<130>08S1594
<160>20
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>1
ttcagttatg tggatgat 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>2
tcagttatgt cgatgatg 18
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>3
tttcagttat gttgatgatg t 21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>4
tttcagttat gtagatgatg 20
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>5
tccgggcgca gaaac 15
<210>6
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>6
gtgctgcagg tgcg 14
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>7
cgtgatgaca ccaag 15
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>8
atgctttccg tggca 15
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>9
accaataagg tttattgaat atttgggcat caga 34
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>10
tgcttctaca cagtctcctg tacctgggca 30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>11
tggtcctggc actgataata gggaatgtat 30
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>12
agtagttatg tatatgcccc ctcgcctagt 30
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>13
atcatccaca taactgaa 18
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>14
catcatcgac ataactga 18
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>15
acatcatcaa cataactgaa a 21
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>16
catcatctac ataactgaaa 20
<210>17
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>17
gtttctgcgc ccgga 15
<210>18
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>18
cgcacctgca gcac 14
<210>19
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>19
cttggtgtca tcacg 15
<210>20
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>试剂
<400>20
tgccacggaa agcat 15