在酶反应中在样品中合成cDNA的方法 【发明背景】
本发明涉及分子生物学领域以及该领域中的研究，还涉及人和非人诊断。
进行非聚腺苷酸化RNA分子，例如细菌RNA或小RNA(如所谓的小RNA(miRNA))的分析很困难，且需要特殊方法。最近，文献中公开了可能的方法。该方法包括几个依次进行的酶步骤，即首先用聚-(A)-聚合酶和合适的底物，例如ATP来给RNA加尾。然后，停止聚-(A)反应，纯化反应产物。接着，将产生的聚-(A)-RNA加到反转录酶反应中，用合适的引物转换成cDNA。
【技术领域】
在实践中，接连进行的这两种酶反应很昂贵，并且有许多错误来源，例如核酸酶的输入，材料损失或移液误差等。
小RNA(miRNA)的大小为20-25个核苷酸不等，代表了一类新的非编码RNA家族。
它们通过所谓的“发夹前体”加工，并可在基因表达中作为负调节物。因此，它们向下调节许多基因(Ambros，V.，2001，小RNA：具有大潜能的小调节物，细胞(Cell)107，823-826)。小RNA首先作为长“原始转录物”被转录(也被称为原始小RNA)(Lee，Y.，Jeon，K.等，2002，小RNA成熟：分步加工亚细胞定位(MicroRNAMaturation：Stepwise Processing Subcellular Localisation)，胚胎杂志(Embo J.)21，4663-4670)。然后，这些“原始转录物”被缩短，从其缩短至约70个核苷酸。产生所谓的“茎环结构”，也称为“前-miRNA”。前-miRNA被输出到胞质内。输出酶被称为Exportin-5。它们在此被进一步加工，由此产生长约22个核苷酸的天然miRNA分子(Lee，Y.，等.，2003，核RNA的III Drosha引发小RNA加工，自然杂志425，415-419)。最新研究提出，miRNA在发育和分化中起到了重要作用。总的说，小RNA能以两种不同的方式起调控作用。在植物中，miRNA与其对应的mRNA以精确互补方式互补。这导致靶-mRNA被包括RNA干扰(RNAi)的机制破坏。在动物中，miRNA通过包括Lin-4和Let-7的机制阻止基因表达。在此，miRNA并不与其对应的mRNA精确互补，但它们阻止蛋白的合成和功能(Ambros，V.，2004，动物小miRNA的功能，自然杂志，431，350-355)。由于最近才发现的miRNA的此决定性作用，它们的检测和分析具有决定性的重要性。
在真核细胞中，18s，5.8s和25/28s rRNA的合成包括修饰核内所谓前体-rRNA(前-rRNA)中的加工。rRNA生物合成的复杂过程包括许多小的所谓“小核仁RNA(snoRNA)”，它们在核仁内聚集。它们以所谓的小核仁核糖核酸蛋白颗粒(snoRNP)形式聚集(Maxwell，E.S.等，1995，小核仁RNA，生物化学年度综述(Annual Review Biochem)，35，897-934).
迄今确认的所有snoRNA，除了RNA酶MRP，属于两个家族。后者是盒c/D和盒h/ACA慢RNA，可由其共同的序列基序分辨出(Ballakin，A.D.et al.，1996，核仁RNA世界：由具有相关功能的不同盒元件确定的两个主要小核仁RNA家族，细胞杂志，86，823-834)。snoRNA基因的基因组组织在不同真核细胞中有很大的不同。在脊椎动物中，多数snoRNA通过“宿主基因”被引入内含子内。而例外(例如U3)是独立转录的。在酵母中，有snoRNA被引入内含子，但大部分snoRNA是作为单基因由单独的启动子转录的。通过共同启动子上游转录成簇的snoRNA。由于小尺寸和缺乏聚腺苷酸化，snoRNA的检测和分析是分子生物学上的一项挑战。
PCR是常用的研究微生物的工具，也被用于分析16S rRNA基因。然而，在微生物样品中发现新基因受到仅能有条件合成的引物的限制。因此，对于16s RNA，引物是从那些培养的微生物的已知序列衍生的(Olson，D.J.，1986，微生物生态学和进化：核糖体RNA方法，微生物学年度综述(Annu.Rev.Microbial.)40：337-365)。基于分类学，已知序列(即用于提取16S rRNA基因)也可能存在于迄今未知的生物，可能微生物多样性被大大低估，而且也还未被分离。
正如16S rRNA分子的分离有困难一样，原核mRNA分子的分离也有困难，因为缺乏对序列的了解，特别是由于缺少聚腺苷酸尾。
本领域了解一种2-阶段方法。在该方法中，RNA分子在酶聚腺苷酸聚合酶和底物三磷酸腺苷的帮助下反应，从而产生聚腺苷酸化的核糖核酸分子。由此生成的聚腺苷酸化核糖核酸在下一步中被纯化，然后在第三步中进行反转录。反转录利用聚腺苷酸化尾，从而同聚寡核苷酸一般以互补形式使聚腺苷酸化RNA尾与聚-T-寡核苷酸结合。聚-T-寡核苷酸的3′端现在被聚合酶使用，以产生脱氧核糖核苷酸链，其与存在地核糖核酸链互补。由此产生的链被称为“cDNA第一链”。该cDNA可被用于PCR反应，从而使用随机引物或特异性引物产生扩增子(amplificat)。Shi等特别教导了通过寡-dT接头引物检测miRNA，其中在PCR中使用特异性引物的接头(Shi，R.，和Chiang，V.L.(Shi，R.et al.，通过实时PCR定量小RNA表达的便利方法，生物技术(Biotechniques)，2005，39，519-25).
该最近发表的方法也具有上述特殊核糖核酸分子具有的明确缺陷。
因此，一般说，二步法可能会引入污染物。纯化步骤导致稀少RNA的丧失。二步法需要灭活第一种酶和第一种酶和第二种酶的温育时间，都导致耗时巨大。另外，二步法的缺点是在同时处理两个或多个样品时，会产生弄混样品的危险。如本领域已知的，一旦有核酸酶，核糖核酸是相对敏感的。二步法，特别是在第一步后纯化的步骤，会有引入核酸酶的危险。最后，二或多步总是导致移液误差的风险增加。
【发明内容】
因此，本发明的一个目的是准备一种实现cDNA合成的方法，该方法尽可能的防止污染物，耗时少，尽可能减少了样品弄混的风险，尽可能减少了引入核酸酶的危险，和最后尽可能排除了移液误差的风险。
该目的是通过在一个酶反应中的一个样品中合成cDNA的方法实现的，该方法包括下列步骤：
(a)同时准备具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧核糖核苷酸、锚定寡核苷酸；
(b)加入含有核糖核酸的样品；和
(c)在一个或多个温度步骤中温育步骤(a)和(b)的试剂，选择这些温度步骤，这样第一种酶和第二种酶能显示活性。
迄今，对于酶性聚腺苷酸化和反转录酶的组合是否技术上可行仍然是有顾虑的。甚至更近，即在发现小RNA和snoRNA(其代表了在分析和分离上的一种特殊的分子生物学挑战)后，酶反应还总是仍然连续进行，也显示了这一点(Want，J.F.，et al.，从水稻(Oryza sativa)鉴定20种小RNA，核酸研究杂志(Nucleic Acid Res.)，2004，32，1688-95；Shi，R.和Chiang，V.L.，实时PCR定量小RNA表达的便利方法，生物技术(Biotechniques)，2005，39，519-25；Fu，H.，et al.，用新方法鉴定人胎肝miRNA；FEBS通信(FEBS Lett)，2005，579，3849-54；Chen，C.L.et al.，植物中snoRNA的高多样性：来自水稻的120种snoRNA的鉴定和比较研究，核酸研究(Nucleic Acids Res)，2003，31，2601-13；Botero，L.M.et al.，环境RNA的聚(A)聚合酶修饰和反转录酶PCR扩增，应用环境微生物学(Appl.Environ Microbiol)，2005，71，1267-75)。足够惊人的是，本领域技术人员长久以来就已经知道了这两个过程，即聚腺苷酸化和反转录(Sano，H.，和Feix，G.，大肠杆菌的末端核糖腺苷酸转移酶，定性和应用，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，1976，71，577-83)。总的说，根据聚-A加尾步骤，本领域技术人员纯化了反应产物(Shi，R.，et al.，实时PCR定量小RNA表达的便利方法，生物技术(Biotechniques)，2005，39，519-25)。其原因是由于反应缓冲液和反应所需底物的完全不同。
本发明的另一个目的是准备一种简单的方法，以实现cDNA合成，并将该反应可任选的和第三次酶反应组合，从而能在同一反应容器中特异性检测产生的cDNA。通过一个非常简单的操作，当要在一个或少许分析物中分析大量样品时，该“三合一”方法显示了特殊的优点。其理由是例如与实时PCR结合，它是一种非常快速简便的方法，显示大量要分析的样品。尽可能的避免了其它操作步骤和污染，从而使耗时变少，样品弄混的危险被减至最小，引入核酸酶的危险被减至最小，和最后，尽可能的排除了移液误差的危险。
“三合一”反应是通过一种方法实现的，该方法用于在样品中在一次酶反应中合成cDNA，然后是另一次酶反应，任选扩增，任选与检测结合(实时在扩增过程中或下游)，该方法包括以下步骤：
(a)同时准备具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧核糖核根酸、锚定寡核苷酸，具有核酸合成活性的至少第三种酶，至少一种引物，和可任选的一种探针；
(b)加入含有核糖核酸的样品；和
(c)在一个或多个温度步骤中温育步骤(a)和(b)的试剂，选择这些温度步骤以使第一种酶和第二种酶显示活性，和可任选的第三种酶有活性或无活性。可任选的，随后为一个或多个温度步骤，其中第一种和第二种酶活性较弱或无活性，第三种酶有活性。
体内使用的聚-(A)-聚合酶底物是三磷酸腺苷(ATP)。对于一些聚-(A)-聚合酶，显示甚至可以将短尾结合到其它NTP上以作为底物(Martin，G.，和Keller，W.，用酵母聚腺苷酸聚合酶和各种核苷酸加尾和3′-末端标记，RNA，1998，4，226-30)。
足够惊人的是，本发明的发明人发现可以在一些要求下，在一个反应容器中同时进行这两个非常不同的酶反应。在本发明的一个优选例中，样品是核糖核酸，其选自原核核糖核酸、真核核糖核酸、病毒核糖核酸、来源于太古生物的核糖核酸、小核糖核酸(miRNA)、小核仁核糖核酸(snoRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、一般的未聚腺苷酸化的核糖核酸，以及核糖体核糖核酸(rRA)，和甚至上述两种或更多种核糖核酸的混合物。当然样品中可已经包含聚腺苷酸化RNA。
在本发明的一个特别优选例中，样品是核糖核酸，选自原核核糖核酸、miRNA、snoRNA和rRNA。在本发明的最优选例中，样品包含核糖核酸，其选自miRNA和snoRNA。也优选与其它物质结合的不同类型和不同量的核糖核酸组成的其它混合样品。
此外，本发明的发明人已发现在某些条件下，能够在一个反应容器中同时进行两种非常不同的酶反应，并将其与第三种酶反应结合，用于特异性检测生成的cDNA，优选具有核酸合成活性。在本发明的一个优选例中，样品是核糖核酸，选自原核核糖核酸、真核核糖核酸、病毒核糖核酸、来源于太古生物的核糖核酸、小核糖核酸(miRNA)、小核仁核糖核酸(snoRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、一般的未聚腺苷酸化的核糖核酸，以及核糖体核糖核酸(rRA)，和甚至上述两种或更多种核糖核酸的混合物。当然样品中可已经包含聚腺苷酸化RNA。
在本发明的一个特殊优选例中，样品是核糖核酸，选自原核核糖核酸、miRNA、snoRNA和rRNA。在本发明的最优选例中，样品包含核糖核酸，其选自miRNA和snoRNA。也优选伴有其它物质的不同类型和不同量的核糖核酸组成的其它混合样品。
基于本发明的方法的这些优点，发明人可以显示可以有效和无污染的制备和定性miRNA。
在本发明的一个实施例中，锚定寡核苷酸是一种同聚寡核苷酸，选自聚腺苷酸化寡核苷酸、聚胞苷酸化寡核苷酸、聚胸苷酸化寡核苷酸、聚鸟苷酸化寡核苷酸、聚尿苷酸化寡核苷酸，额外含有5′-尾的聚腺苷酸化寡核苷酸，额外含有5′-尾的聚胞苷酸化寡核苷酸、额外含有5′-尾的聚胸苷酸化寡核苷酸、额外含有5′-尾的聚鸟苷酸化寡核苷酸、和额外含有5′-尾的聚尿苷酸化寡核苷酸。如上所述，优选额外含有5′-尾的聚胸苷酸化寡核苷酸。
本发明的锚定寡核苷酸通常长6-75个核苷酸。然而它也可长达约150个核苷酸。如果锚定寡核苷酸是合成的，最大长度符合DNA合成的技术限制。锚定寡核苷酸可任选含有5′-尾和/或锚定序列。5′-尾是在寡核苷酸5′-端的额外核苷酸序列，其用于例如引入克隆序列、引物和/或探针结合位点或任何其它序列。本领域技术人员可根据不同应用的需要鉴定合适的5′-尾序列。
在锚定寡核苷酸的3′-端，可包含通常为1-5个额外核苷酸的额外锚定序列。锚定序列可长至少一个碱基，在一优选例中第一位是简并碱基，其含有所有碱基，除了用于锚定寡核苷酸同聚部分的碱基。然后可跟其它的碱基。后者也可以是简并的。在本文的一个优选例中，使用N变量，其中N＝A，C，G，T或相应的类似物。
一般说，锚定寡核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，锚定寡核苷酸也可以是肽核酸(PNA)、锁闭核酸(LNA)、硫代磷酸(phosphorus thioate)脱氧核糖核酸、环己烯核酸(CeNA)，N3’-P5’-氨基磷酸酯(NP，phosphorus amidate)、和三环脱氧核糖核酸(tcDNA)。然而优选作为脱氧核糖核酸(DNA)的锚定寡核苷酸。也可以是RNA和DNA混合物，或一种或多种修饰核酸或类似物的混合物，和其它的修饰物的混合物(例如对应的碱基类似物，其可以与RNA或DNA在所选条件下杂交)。在一个特别优选例中，锚定寡核苷酸是还含有5′尾的聚-(T)-寡核苷酸，它是脱氧核糖核酸，长15-150个核苷酸，作为混合物存在。在寡核苷酸的3′-端可包含额外的锚定序列，通常长1-5个额外核苷酸。锚定序列可长至少一个碱基，其中在一个优选例中第一位是简并碱基，其包含所有的碱基，除了用于锚定寡核苷酸同聚部分的碱基。然后可跟随其它的碱基。后者也可以是简并的。本文的一个优选例中，在本文的一个优选例中，使用N变量，其中N＝A，C，G，T或相应的类似物。
举例说，可提到本发明的下列锚定寡核苷酸：
实施例1(SEQ ID NO：10)：5’TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAAGCT TCC CGT TCT CAG CC(T)XVVN 3’
实施例2(SEQ ID NO：11)：5’AACGAGACGACGACGACAGAC(T)x VN 3’
实施例3(SEQ ID NO：12)：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x V3’
实施例4(SEQ ID NO：13)：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x N3’
实施例5(SEQ ID NO：14)：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)x NN3’
实施例6(SEQ ID NO：15)：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)xVNN3’
实施例7(SEQ ID NO：16)：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)xVNNN3’
实施例8(SEQ ID NO：17)：5’AACGAGACGACGACAGAC(T)xNNN3’
实施例9(SEQ ID NO：18)：5’TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAAGCT TCC CGT TCT CAG CC(T)xVN3’
实施例10(SEQ ID NO：19)：5’TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAAGCT TCC CGT TCT CAG CC(T)X VNN3’
X优选是10-30个碱基。
V和N是简并碱基的单字母码，V＝A，C，G；N＝A，C，G，T。
对于本领域技术人员来说，其它合适的5′-尾序列的鉴定也是可能的。
可任选的5′-尾包含额外的1-100个核苷酸，可用于随后的分析。因此在一个优选例中，5′-尾可含有寡核苷酸的结合序列，例如一或多个DNA探针和/或一或多个PCR引物。优选选择用于5′-尾的序列以使其与本发明的方法相容。这包含例如，选择在发明方法中和随后的分析过程中不导致任何不需要的二级反应的序列。
根据本发明，锚定寡核苷酸如图12所示。
原则上，本发明的酶反应可在载体上或容器内进行，即反应可在反应容器中进行。这样的反应容器可以是例如反应试管或例如微量滴定板。反应可在芯片上发生。如果在芯片上发生，则可固定一种或多种组分。反应可在测试条或在微流系统中发生。本领域技术人员了解与载体或容器有关的大部分变化实施方式。
在优选例中，核糖核苷酸是腺嘌呤-5′-三磷酸、胸腺嘧啶-5′-三磷酸、胞嘧啶-5′-三磷酸、鸟嘌呤-5′-三磷酸和/或尿嘧啶-5′-三磷酸。核糖核苷酸也可以是碱基类似物。可修饰或标记核糖核苷酸。原则上，重要是的核糖核苷酸能作为底物与酶在聚腺苷酸化作用中反应。
本发明的脱氧核糖核苷酸可选自脱氧腺嘌呤-5’-三磷酸(dATP)，脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸(dTTP)，脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸(dCTP)，脱氧鸟嘌呤-5’-三磷酸(dGTP)，脱氧尿嘧啶-5’-三磷酸(dUTP)以及修饰和标记的脱氧核糖核苷酸。也可额外或替换使用一种或多种含有通用碱基或碱基类似物的脱氧核糖核苷酸。对于本发明实施重要的是所用的脱氧核糖核苷酸能实现cDNA合成。
根据本发明，优选dATP，dCTP，dTTP和dGTP作为混合物同时存在。
根据本发明，还可在混合物中使用脱氧尿嘧啶-5-′-三磷酸。可联合在实际反应后进行的酶反应，它使用尿嘧啶-DNA糖基化酶(glycosilase)，不会降解进一步使用的酶性产生的反应产物。
如果标记脱氧核糖核苷酸，标记可选自：32P，33P，35S，3H；荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)、(夹)氧杂蒽(xanthene)、罗丹明、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明110；香豆素，例如7-羟基香豆素；苯甲亚胺，例如Hoechst 33258；菲啶，例如德克萨斯红、溴乙啶、氮蒽染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染料；花青染料，例如Cy3，Cy5，Cy7、BODIPY染料、喹啉染料和Alexa染料；包含生物素或一种或多种半抗原，能直接或间接检测核酸的标记(如地高辛)；通过例如抗体，然后通过与抗体偶联的酶进行的酶检测等间接检测。此外，通过引入纳米颗粒(与抗体或亲和配体等偶联)也可以进行间接检测。
也可通过5′-磷酸进行脱氧核糖核苷酸的修饰，其可实现更简单的克隆。通过引入反应基团例如氨基接头(或生物素)，脱氧核糖核苷酸可以例如被固定化，或可实现直接或间接检测。
特别优选的修饰选自荧光染料、半抗原、5′-磷酸、5′-生物素和5′-氨基接头。
根据本发明，反应中脱氧核糖核苷酸的浓度为至少0.01mmol到至多10mmol。此浓度信息是单种脱氧核糖核苷酸的浓度。在一个优选例中，脱氧核糖核苷酸(分别是dATP，dCTP，dGTP和dTTP)以0.2mmol-2mmol的浓度存在。该浓度信息是混合物中单种脱氧核糖核苷酸的浓度。在本发明的一个特别优选例中，单种脱氧核糖核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP以每种0.5mmol的浓度存在。
足够惊人的是，发明人确定，作为本发明的主题的一步酶反应可在6-10的窄缓冲液pH范围内，在镁离子(Mg2+)的存在下进行。因此，pH6-10在优选例中出现。
在一个特别优选例中，本发明的缓冲液的pH为6.8-9。
在本发明的另一个实施例中，本发明的缓冲液含有其它离子，选自Mn2+，K+，NH4+，和Na+。
本发明的缓冲液含有例如MgCl2，MgSO4，乙酸镁，MnCl2，KCl，(NH4)2SO4，NH4Cl，和NaCl。作为缓冲物质，合适的有三羟甲基氨基甲烷(tris)，两性离子缓冲剂(tricine)，N，N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)，HEPES，和其它在本发明pH范围内的缓冲物质，或者两种或多种合适缓冲物质的混合物也是合适的。
本领域技术人员已知许多具有聚腺苷酸化活性的酶。根据本发明，它们选自原核来源、真核来源、病毒来源、和古生物来源的酶、以及植物来源的酶。
本发明的聚腺苷酸化活性是一种酶活性，其使用核糖核酸的3′-端作为底物，在合适的缓冲液中在该3′-端能加上酶性核糖核苷酸，特别优选至少10-20个核糖核苷酸。在一优选例中，酶是能用腺嘌呤-5′-三磷酸作为底物的酶。根据本发明，该酶包括酶和当使用单链和双链RNA，例如发夹RNA(如前-miRNA等)时，具有本发明所述聚腺苷酸化活性的反应条件。基于要分析的RNA，本领域技术人员能选择酶和反应条件，从而使单链RNA(例如成熟miRNA)或双链RNA(例如前-miRNA)或两者都能够用于分析。
一般说，本发明的聚腺苷酸化活性是转录酶活性。
在优选例中，具有聚腺苷酸化活性的酶是选自下列的酶：大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶、酵母聚腺苷酸聚合酶、牛聚腺苷酸聚合酶、青蛙聚腺苷酸聚合酶、人聚腺苷酸聚合酶、和植物聚腺苷酸聚合酶。其它酶也是本领域技术人员已知的，或可以通过分析已知聚腺苷酸聚合酶中的同源性新鉴定出来。在特别优选例中，具有聚腺苷酸化活性的酶是大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶。
本发明具有反转录酶活性的酶根据本发明选自来自病毒、细菌、太古细菌和真核细胞，特别是来自热稳定生物的酶。这些还包括例如，来自内含子、反转座子或逆转录病毒的酶。一种具有反转录酶活性的酶是根据本发明，能以互补方式在核糖核酸中，在合适的缓冲条件下在与核糖核酸杂交的脱氧寡核苷酸或核糖寡核苷酸的3′-端上掺入脱氧核糖核苷酸的酶。这在一方面包括当然具有该功能的酶，也包括仅通过改变其基因序列，例如诱变，或通过相应缓冲条件获得该功能的酶。
优选具有反转录酶活性的酶，该酶选自下组：HIV反转录酶、M-MLV反转录酶，EAIV反转录酶，AMV反转录酶，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶I，M-MLV RNA酶H，Superscript，Superscript II，Superscript III，MonsterScript(艾比中心(Epicenter))，Omniscript，Sensiscript反转录酶(恰根公司(Qiagen))，ThermoScript和Thermo-X(两者都来自英外特根公司(Invitrogen))。根据本发明，还可使用仅在修饰基因序列后具有反转录酶活性的酶。还可使用具有提高的准确性的反转录酶活性。举例来说，本文描述了AccuScript反转录酶(斯特拉塔基因公司(Stratagene))。对本领域技术人员来说明显的是，甚至使用两种或更多具有反转录酶活性的酶混合物也是可以的。
本领域技术人员知道大多数具有反转录酶活性的酶需要二价离子。因此，在上述优选例中，在需要二价离子的酶中存在二价离子。Mg2+和Mn2+是优选的。
酶的优选组合是HIV反转录酶，或M-MLV反转录酶，或EAIV反转录酶，或AMV反转录酶或嗜热栖热菌DNA聚合酶I或M-MLV RNA酶H，Superscript，Superscript II，Superscript III或MonsterScript(艾比中心)或Omniscript反转录酶(恰根公司)或Sensiscript反转录酶(恰根公司)，ThermoScript，Thermo-X(两者都来自英外特根公司)或两种或多种具有反转录酶活性的酶与大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶的混合物。此外，组合包括HIV反转录酶、或M-MLV反转录酶、或EAIV反转录酶、或AMV反转录酶、或嗜热栖热菌DNA聚合酶I或M-MLV RNA酶H、Superscript、Superscript II、Superscript III、或MonsterScript(艾比中心)、或Omniscript反转录酶(恰根公司)、或Sensiscript反转录酶(恰根公司)、或ThermoScript、Thermo-X(两者都来自英外特根公司)、或两种或更多具有反转录酶活性的酶与酵母聚腺苷酸聚合酶的混合物。
本领域技术人员已知反转录中高温的效果是二级结构不会起到决定性作用。另外，在一些酶中，高温的作用是反转录的特异性提高，从而抑制假配对和假引发。因此，在本发明的一个实施例中使用嗜热性的反转录酶。优选在45℃到85℃之间，更优选在55℃到80℃之间，最优选60℃到75℃之间具有最佳核酸合成活性的酶。优选嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合物I。
如果具有聚腺苷酸化活性的酶不是嗜热性酶，而具有反转录酶活性的酶是嗜热性酶，可在本发明的几个温度步骤下进行反应，从而第一个温度步骤提供的所用温度是聚腺苷酸化活性的酶的最佳温度，第二个温度步骤提供的所用温度是反转录酶活性的的酶的最佳温度。
例如，如果使用AMV反转录酶，第二个温度步骤在42℃进行，而第一温度步骤在37℃进行，主要是使聚腺苷酸化活性的酶具有活性。然而在恒温下实施也是可能的。
本领域技术人员能选择相关酶活性不受影响的温度。例如，如果使用大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶和来自嗜热栖热菌的DNA聚合酶的组合，温度过程如下：首先，在37℃温育，然后为55-70℃。根据本发明，因此可使用非热稳定性酶和热稳定性酶的组合。在这种情况下，温度步骤则依赖于两种酶中的哪一种具有聚腺苷酸化活性。根据本发明，优选具有反转录酶活性的酶是热稳定的。在相反的情况下，且本领域技术人员来说也是可信的，可在聚腺苷酸化步骤中在更高的温度下温育，而反转录酶活性的酶被部分或完全灭活。因此，如果两种酶都是热稳定的，也是优选的。
此外，本领域技术人员已知酶进行反应的程度不同，因此本领域技术人员能够组合具有不同反应性的酶，使得不同长度的模板能够以不同方式被轻易转换成cDNA。通过使用各种酶的对应量、一种或多种合适的温育温度和温育时间，本领域技术人员可得到满意的结果。
本发明的方法优选包括其它聚胞苷酸多核苷酸。本发明的方法尤其优选含有额外的聚胞苷酸多核糖核苷酸。优选每20微升中掺入1ng-300ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸，优选每20微升中掺入10ng-150ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸，尤其优选每个反应中掺入25-100ng聚胞苷酸多核糖核苷酸，最优选每20微升反应物中掺入50ng-75ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸。
本发明的反应物可包含其它试剂，例如体积排阻物、单链结合性蛋白、DTT和/或竞争性核酸。
如果使用体积排阻物，它选自葡聚糖、聚乙二醇，在EP 1411133A1中提到了本发明的体积排阻物。
在一优选例中，竞争性核酸是同聚核糖核酸，最优选聚腺苷酸核糖核酸。US6,300,069中公开了例子。
本发明的方法优选包含额外的聚胞苷酸多核苷酸。本发明的方法尤其优选包含额外的聚胞苷酸多核糖核苷酸。优选每20微升中掺入1ng-300ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸，优选每20微升反应物中掺入10ng-150ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸，尤其优选每个反应中掺入25-100ng聚胞苷酸多核糖核苷酸，最优选每20微升反应物中掺入50ng-75ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸。
对于本领域技术人员来说明显的是，防止竞争性核酸本身被用作聚腺苷酸聚合酶活性的底物是有利的。可能的解决方案是封闭竞争性核酸的3′OH基团。相应的方案，例如使用3′磷酸，掺入双脱氧核苷酸或反向碱基是本领域技术人员已知的。
对于本领域技术人员来说明显的还有，能够防止竞争性核酸本身被当做反转录酶活性的底物是有利的。这可通过选择不能在给定反应条件下被转换成cDNA的竞争性核酸来确保。另一种可能的方案是封闭竞争性核酸的3′-OH基团。相应的方案，例如使用3′磷酸，掺入双脱氧核苷酸或反向碱基是本领域技术人员已知的。
另外，本发明涉及一种反应混合物，含有具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、可任选的缓冲液、可任选的至少一种核糖核苷酸、可任选的至少一种脱氧核糖核苷酸、和可任选的锚定寡核苷酸。锚定寡核苷酸优选包含同聚部分，锚定序列和/或尾。反应混合物还优选包含随机引物。额外使用随机引物的优点是甚至长转录物的5′-端都能够有效被转化，这在定量分析中是重要的。反应混合物可含有本发明的方法所用的相同试剂。
在本发明的一个实施例中，锚定寡核苷酸是一种同聚寡核苷酸，选自聚腺苷酸化寡核苷酸、聚胞苷酸化寡核苷酸、聚胸苷酸化寡核苷酸、聚鸟苷酸化寡核苷酸、聚尿苷酸化寡核苷酸，额外含有5′-尾的聚腺苷酸化寡核苷酸，额外含有5′-尾的聚胞苷酸化寡核苷酸、额外含有5′-尾的聚胸苷酸化寡核苷酸、额外含有5′-尾的聚鸟苷酸化寡核苷酸、和额外含有5′-尾的聚尿苷酸化寡核苷酸。如上所述，优选可任选的额外具有5′-尾的聚胸苷酸化寡核苷酸。
本发明的锚定寡核苷酸通常长6-75个核苷酸。然而它也可长达约150个核苷酸。如果锚定寡核苷酸是合成的，最大长度符合DNA合成的技术限制。锚定寡核苷酸可任选含有5′-尾和/或锚定序列。5′-尾是在寡核苷酸5′-端的额外核苷酸序列，其用于例如引入克隆序列、引物和/或探针结合位点或任何其它序列。本领域技术人员可根据不同应用的需要鉴定合适的5′-尾序列。
在锚定寡核苷酸的3′-端，可包含通常为1-5个额外核苷酸的额外锚定序列。锚定序列可长至少一个碱基，在一优选例中第一位是简并碱基，其含有所有碱基，除了用于锚定寡核苷酸同聚部分的碱基。然后可跟其它的碱基。后者也可以是简并的。在本文的一个优选例中，使用N变量，其中N＝A，C，G，T或相应的类似物。
可任选的5′-尾包含额外的1-100个核苷酸，可用于随后的分析。因此在一个优选例中，5′-尾可含有寡核苷酸的结合序列，例如一或多个DNA探针和/或一或多个PCR引物。用于5′-尾的序列优选的选择是其与本发明的方法相容。这包含例如，选择在发明方法中和随后的分析过程中不导致任何不需要的二级反应的序列。
本发明的反应混合物含有本发明的锚定寡核苷酸，其长度为10-150个核苷酸之间，任选在3′-端携带本发明的锚定序列，其长1-5个核苷酸。本发明的反应混合物含有锚定寡核苷酸，其如上所述例如是脱氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)或锁闭核酸(LNA)。在一个优选例中，本发明的反应混合物含有本发明的锚定寡核苷酸，它是聚胸苷酸寡核苷酸，还携带5′-尾，其中寡核苷酸是脱氧核糖核酸，长10-75个核苷酸，以混合物存在；在3′-端，存在锚定序列，其在每种情况下由一个核苷酸构成，选自A、G和C，可任选的后随5个额外的核苷酸，所述额外的核苷酸包括所有4种碱基A、C、G和T或对应的类似物。
本发明反应混合物的锚定寡核苷酸如图12所示。
本发明的反应混合物还包含如上对于本发明的方法所述的至少一种核糖核苷酸。特别是，本发明的反应混合物含有至少一种选自ATP，TTP，CTP，GTP，UTP或其对应碱基类似物的核糖核苷酸。核糖核苷酸可任选的如上所述被修饰或标记。本发明的反应混合物含有脱氧核糖核苷酸，如对于本发明的方法所述。特别是，本发明的反应混合物含有一种或多种脱氧核糖核苷酸，例如dATP，dCTP，dGTP，dUTP，和/或dTTP。在优选例中，使用能实现cDNA合成的脱氧核糖核苷酸混合物。可任选修饰或标记这些脱氧核糖核苷酸。
如果标记本发明的反应混合物中的脱氧核糖核苷酸，标记可选自：32P，33P，35S，3H；荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)、(夹)氧杂蒽、罗丹明、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明110；Cy3、Cy5、Cy7；香豆素，例如7-羟基香豆素；苯甲亚胺，例如Hoechst 33258；菲啶，例如德克萨斯红、溴乙啶、氮蒽染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染料；花青染料，例如Cy3，Cy5，BODIPY染料、喹啉染料和Alexa染料；包含生物素或一种或多种半抗原，能直接或间接检测核酸的标记(如地高辛)；通过例如抗体，然后通过与抗体偶联的酶进行的酶检测等间接检测。此外，通过引入纳米颗粒(与抗体或亲和配体等偶联)也可以进行间接检测。
本发明反应混合物中在每种情况下包含浓度为0.01mmol-10mmol的脱氧核糖核苷酸。在每种情况下，每种脱氧核糖核苷酸A、C、G和T优选以0.2mmol-2mmol的浓度存在。特别优选的是脱氧核糖核苷酸A、C、G和T一起存在。在优选例中每种以0.5mmol的浓度存在。
另外，本发明的反应混合物含有缓冲液。缓冲液pH为6-10。另外，在本发明的反应混合物中发现Mg2+离子。在一个特别优选例中，本发明的反应混合物含有pH为6.8-9的缓冲液。反应混合物还可包含额外的离子，可选自Mn2+，K+，NH4+，和Na+。两种不同酶活性的存在对于本发明的反应混合物来说是必要的。本发明的反应混合物含有至少第一种具有聚腺苷酸化活性的酶活性和其次，具有反转录酶活性的第二种酶活性。这些活性的优选例已在上文关于方法处进行了描述。另外，与上述方法相似，反应混合物可含有其它物质，例如体积排阻物、单链结合蛋白、DTT或一种或多种竞争性核酸。
如果使用体积排阻物，它优选选自葡聚糖、聚乙二醇。在EP 1411133A1中提到了本发明其它的体积排阻物。
如果反应混合物可任选的含有竞争性核酸，其选自同聚核糖核酸和聚腺苷酸核糖核酸。US6,300,069公开了本发明的其它竞争性核酸。
本发明的反应混合物优选含有额外的聚胞苷酸多核苷酸。本发明的反应混合物尤其优选包含额外的聚胞苷酸多核糖核苷酸。优选每20微升中掺入1ng-300ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸，优选每20微升反应物中掺入10ng-150ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸，尤其优选每反应物中掺入25-100ng聚胞苷酸多核糖核苷酸，最优选每20微升反应物中掺入50ng-75ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸。
另外，本发明涉及试剂盒，其含有如上所述的反应混合物。在一优选例中，反应混合物存在于单个反应容器中。在另一个实施例中，试剂盒包含一反应容器，含有本发明的具有聚腺苷酸化活性的酶、具有反转录酶活性的酶、可任选的脱氧核糖核苷酸、可任选的至少一种核糖核苷酸、可任选的含有Mg2+的缓冲液，和可任选的一种或多种寡脱氧核糖核苷酸。可任选的，本发明试剂盒中的反应容器可含有额外成分，如对于本发明的反应混合物中所述的那样。另外，试剂盒可含有本发明锚定寡核苷酸的5′-尾的探针。另外，试剂盒可含有一种或多种额外的脱氧核糖核苷酸，例如检测反转录引入的尾序列的通用引物。反应混合物可以“片层形式”即冻干形式存在。其它的不含例如液体形式的制备方法也是本领域技术人员已知的。
另外，试剂盒可任选的与PCR反应或实时PCR反应必需的试剂组合。这些试剂优选是为了至少一次PCR反应，其能实现本发明方法中产生的cDNA中至少一种的检测。
另外，试剂盒可含有可任选的随机引物，以及可任选的一种或多种引物，或引物/探针，来检测一元或多元PCR反应和/或实时一元或多元PCR反应中的额外靶基因。
反应混合物、本发明的方法或试剂盒可含有额外的靶特异性引物。靶特异性引物的长度的选择应当能实现PCR反应中的特异检测；靶引物的序列应当是特异性的，从而实现仅结合在产生的cDNA序列的一个位点上。一般说，这样的引物长15-30个核苷酸，优选17-25个核苷酸。
在一个特别优选例中，反应混合物含有具有聚腺苷酸化活性的酶和具有反转录活性的酶，它们是二酶预混合物。在这样的特别优选例中，试剂盒在一个反应容器中含有二酶预混合反应混合物，在一个分开的容器中含有缓冲液、Mg2+、rNTP、dNTP、可任选的本发明的一种锚定寡核苷酸，和可任选的随机引物，以及可任选的体积排阻试剂和/或竞争性核酸。
本发明的方法如上所述可在一或多个温度步骤下进行。在一优选例中，本发明的方法在单个温度步骤下温育，在另一个温度步骤下灭活酶。因此，在产生酶活性的温育步骤的一个优选例中，温度为约37℃。温育时间为约1-120分钟，优选5-90分钟，更优选10-75分钟，甚至更优选15-60分钟，还更优选20-60分钟，至最优选50-70分钟。正常情况下，过度温育时间并无害。在另一个酶变性的步骤中，温度为至少65℃，但最高使用100℃。优选使用约80-95℃的温度。变性进行至少1分钟，但最长30分钟。在一优选例中，变性5分钟。
本发明产生cDNA的方法随后还可包含聚合酶链式反应。如果是这种情况，优选在本发明的反应混合物中加入对在cDNA合成中引入的尾特异的引物和/或一特异性引物。然后反应混合物还可含有热稳定DNA-聚合酶。
随后进行的PCR反应还可以是定量PCR反应。它可在阵列、微流系统、毛细管中进行，或还可以是实时PCR。本领域技术人员还知道其它PCR的变化形式，它们也相等的包括在本发明的方法中。
本发明还涉及反转录RNA为DNA的方法，其中该方法包括下列步骤：制备含有RNA的样品，加入具有反转录酶活性的第一种酶、缓冲液、至少一种脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸，在一个或多个温度步骤中温育试剂，温度步骤的选择使酶显示活性，其中反应物含有额外的聚胞苷酸多核苷酸。
优选具有反转录酶活性的酶是HIV反转录酶、M-MLV反转录酶、EAIV反转录酶、AMV反转录酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶I、M-MLVRNA酶H、Superscript、Superscript II、Superscript III、MonsterScript(艾比中心)、Omniscript反转录酶(恰根公司)、Sensiscript反转录酶(恰根公司)、ThermoScript、Thermo-X(都来自英外特根公司)，或两种或多种具有反转录酶活性的酶与大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶的混合物。特别优选的是HIV反转录酶。
反应物优选含有聚胞苷酸多核糖核苷酸。每20微升中掺入1ng-300ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸，优选每20微升反应物中掺入10-150ng聚胞苷酸多核糖核苷酸，尤其优选的是每反应物中掺入25ng-100ng聚胞苷酸多核糖核苷酸，最优选每20微升反应物中掺入50ng-75ng的聚胞苷酸多核糖核苷酸。
在本发明的一个优选例中，样品是核糖核酸，其选自原核核糖核酸、真核核糖核酸、病毒核糖核酸、来源于太古生物的核糖核酸、小核糖核酸(miRNA)、小核仁核糖核酸(snoRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、一般的未聚腺苷酸化的核糖核酸，以及核糖体核糖核酸(rRA)，和上述两种或更多种核糖核酸的混合物。当然，样品中可已经包含聚腺苷酸化RNA。
作为模板，可用的RNA选自真核核糖核酸、mRNA、原核核糖核酸、miRNA、snoRNA和rRNA。在本发明最优选例中，样品含有选自miRNA和snoRNA的核糖核酸。优选其它来自伴随有其它物质的不同量的不同类的核糖核酸的混合样品。
基于本发明的方法的这些优点，发明人可以显示可以有效和无污染的制备和定性miRNA。可轻易的用该方法反转录少量RNA。
本发明还涉及一种用于反转录的试剂盒，其含有具有反转录酶活性的酶和聚胞苷酸多核苷酸，优选聚胞苷酸多核糖核苷酸。
在一个实施例中，RNA在样品被反转录前先被聚腺苷酸化。
实施例
实施例1
证明在同一反应容器中聚腺苷酸化反应和反转录的联合的一步法的可行性；各种缓冲液对于检测22聚RNA寡核苷酸的效力的影响
在本实验中，证明了在同一反应容器中聚腺苷酸化反应和反转录的联合的一步法的可行性。为此，在不同条件下进行联合一步法。这在一方面，是补充了聚腺苷酸聚合酶的缓冲液，在另一方面是补充了反转录酶的缓冲液。此外，还测试了聚腺苷酸聚合酶和反转录酶缓冲液混合物。作为对照，用与图1A类似的二步法进行了反应。
如表1所示，整理了反应。
表1：聚腺苷酸反应和反转录
温育 1小时，37℃ 5分钟，93℃ 1小时37℃，然 后在2)反转录反应时再 一小时 1小时，37℃ 5分钟，93℃
PAP：聚腺苷酸聚合酶
RT：反转录
rATP：腺嘌呤5’-三磷酸
为此，使用了表2所示的试剂。
表2：聚腺苷酸化反应和反转录的材料
聚腺苷酸聚合酶 安苄公司(Ambion)；产品号80U： 2030 Sensiscript RT试剂盒 恰根公司；产品号50rxn：205211
腺嘌呤5’-三磷酸(rATP) 阿美沙姆公司(Amersham)；产品号 25μmol：27-2056-01 RNase抑制剂 普洛美卡公司(Promega)；产品号： N2511 单GAP dT引物 5’-TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV VN-3’ 玉米RNA 来自1克土生玉米壳和恰根公司 RNeasy小制备试剂盒(目录号74106)； 植物方案和10x Upscale(Maxi Shredder和Column) mleu7a RNA寡核苷酸 5’-UGA GGU AGU AGG UGG UAU AGU U-3’
在每种情况下，反应用模板(1a，2a，3a，4a，都使用合成的RNA寡核苷酸，在玉米RNA的背景下)或不用模板(1b，2b，3b，4b，都加入了H2O代替模板)。进行不用模板的反应作为非特异性背景可能发生的对照。选择玉米RNA作为背景RNA，因为要检测的22-聚RNA的序列不存在于玉米中。
灭活酶(见表：93℃5分钟)后，用2微升各批次1a/b-4a/b在实时PCR中作为模板。如表3所示，用Quanti Tect SYBR绿色PCR试剂盒(目录号204143)和表4所示的引物以三倍批料进行了实时PCR。
表3：SYBR绿色实时PCR
终浓度 2x SYBR绿色PCR主混合物 1x Hum Uni引物，10μmol 0.5μmol miRNA引物let7/short，10μmol 0.5μmol 无RNA酶水 可变 PAP-/RT-反应物 2μl 最终反应体积 20μl
表4：SYBR绿色PCR的材料
QuantiTect SYBR绿色PCR Kit(200) 恰根公司；产品号：204143
let 7short(特异性miRNA引物) 5’-GAG GTA GTA GGT TGT ATA G-3’ Hum Uni引物 5’-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3’
包含在通用尾引物Hum Uni引物中的序列5’-AAC GAG ACG ACG ACAGAC-3’如US2003/0186288A1中所述。
PCR方案包括初步在95℃下重新活化包含在QuantiTect SYBR绿色PCR主混合物中的HotStarTaq聚合酶15分钟，然后94℃15秒，52℃30秒，和72℃30秒，共40轮(见表5)。
表5：SYBR绿色实时PCR的PCR方案
在72℃延伸步骤时，获得荧光数据。用ABI PRISM 7700(应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行PCR分析，反应体积为20μl。
然后对PCR产物进行解链曲线分析。它是在ABI PRISM 7000实时PCR仪上进行的。
表6：表1批料的实时PCR分析结果
然后在琼脂糖凝胶电泳的辅助下检测PCR产物的相同性。为此，将各10微升的PCR反应物加到2％琼脂糖凝胶上，用溴乙锭染色，并分离。使用100bp梯(英外特根公司，目录号15628-050)作为尺寸标准。结果如图3所示。
实施例2：
在同一反应容器中进行聚腺苷酸聚合酶反应和反转录的联合一步法之可再现性和特异性的证明
在本实验中，聚腺苷酸聚合酶反应和反转录的联合一步法的可行性应当能在相同的反应容器中得到再现。为此，以22聚RNA寡核苷酸的检测为例，分析了在同一反应容器中分析聚腺苷酸聚合酶反应和反转录的一步法的效力。使用采用标准条件的模板的反转录反应作为检测特异性的对照。
为此，在各种条件下进行联合一步法。在一方面，缓冲液补充有聚腺苷酸聚合酶，另一方面，缓冲液补充有反转录酶(表7、8)。
表7：所进行的反应的设计和成分
表8：联合聚腺苷酸聚合酶/反转录反应和标准反转录反应的组分
来自最终浓度的数据
试剂 反应1，2，3 PAP缓冲液 反应4，5，6 RT缓冲液 反应7，8 标准RT 5x PAP缓冲液 1x 10xRT缓冲液 1x 1x MnCl2，25mmol 2.5mmol rATP，10mmol 1mmol 1mmol 聚腺苷酸聚合酶，2U/μl 2U (0.1U/μl) 2U (0.1U/μl) dNTP Mix(dA，dT，dG，dC，各5 mmol) 0.5mmol 0.5mmol 0.5mmol UniGAPdT引物，10μmol 1μmol 1μmol 1μmol RNA酶抑制剂，10U/μl 10U 10U 10U Sensiscript反转录酶 1μl 1μl 1μl 无RNA酶水 可变 可变 可变 mleu7a；反应1，4，7 2x109拷贝 2x109拷贝 2x109拷贝 RNA：反应1，2，4，5，7，8 50ng 50ng 50ng 反应3、6中的负对照(用H2O取 代RNA) H2O H2O
总体积 20μl 20μl 20μl
温育 1小时37℃ 5分钟，93℃
所有反应批料然后分成： 批料a)取出10μl，4℃保藏； 对于所有批料b)：再次加入Uni GAP dT引物[1μmol]和0.5μl Sensiscript反转录酶至10微 升，再次进行反转录(37℃1小时)，然后灭活反转录酶(5分钟，93℃)。
此外，为了检测随后PCR检测特异性，进行了标准反转录反应(表7、8，见上)。在聚腺苷酸聚合酶反应和反转录后，分开样品。在每种情况下，在一半样品中加入Uni Gap dT引物和反转录酶(见表7上文)。其目的是为了排除由于少部分A-尾与Uni Gap dT引物意外结合而产生的假阳性信号。作为模板，加入总RNA，它是从人血用RNeasy Midi试剂盒(恰根公司，德国希尔敦市，目录号75144)分离的。
用于各反应中组分和命名如上文表7所总结的。所检测到的22-聚RNA的序列对应于人leu7a miRNA(EMBL登录号：AJ421724)，可在人血细胞，例如白细胞中表达。然而，由于用于分离RNA的RNeasy法纯化技术，只能以非常低的效率纯化这样的小RNA。RNeasy法仅能确保大于200个碱基的RNA能结合在RNeasy柱的二氧化硅膜上(恰根公司RNeasy Midi/Maxi手册，06/2001，p.9)，因此小RNA，例如miRNA会很大程度上被除去。
此外，在比所预期的内源性拷贝数多得多的浓度下使用合成的22-聚RNA。如表8(见上)所示总结了反应物。
对此，使用了如表9所述的试剂。
表9：聚腺苷酸化反应和反转录的材料
聚腺苷酸聚合酶 安苄公司；产品号80U：2030 Sensiscript RT Kit 恰根公司；产品号50rxn：205211 腺嘌呤5’-三磷酸(rATP) 阿美沙姆公司；产品号25μmol： 27-2056-01
RNA酶抑制剂 普洛美卡公司；产品号：N2511 Uni GAP dT引物 5’-TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV V(N-Q)-3’ RNA 用RNeasy Midi试剂盒(恰根公司，目录号 75144)分离的来自人血的白细胞RNA mleu7a RNA寡核苷酸 5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’
酶灭活(93℃5分钟)后，批料用水1∶2稀释，每2微升批料1a/b-8a/b在实时SYBR绿色PCR中用作模板。如表9(上文)中所示，用QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒(目录号204143)和表10所示的引物以两倍批料进行实时PCR。
表10：SYBR绿色实时PCR的成分
终浓度 2x SYBR绿色PCR主混合物 1x Hum Uni引物，10μmol 0.5μmol miRNA引物let 7short，10，μmol 0.5μmol 无RNA酶水 可变 PAP-/RT反应物1∶2稀释过 2μl 终反应体积 20μl
通用尾-引物Hum Uni引物中所包含的序列AAC GAG ACG ACG ACA GAC如US2003/0186288A1所述。PCR方案包括初步在95℃下重新活化包含在QuantiTect SYBR绿色PCR主混合物中的HotStarTaq聚合酶15分钟，然后94℃15秒，52℃30秒，和72℃30秒，进行40轮循环(见表11)。
表11：SYBR绿色PCR的材料
QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒 (200) 恰根公司；产品号：204143 let 7short(特异性miRNA引物) 5’-GAG GTA GTA GGT TGT ATA G-3’
HumUni引物 5’-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3’
在72℃延伸步骤时，获得荧光数据。用Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μl。然后进行解链曲线分析。
联合一步聚腺苷酸化反应和反转录在聚腺苷酸聚合酶缓冲液和RT缓冲液中都是可能的，这得到了实时PCR分析的证实。优选缓冲条件已在文中描述(见上文)。当使用不同缓冲液时，它们在Ct值上显示有很大不同。
为了监控特异性而进行的标准反转录反应(反应3、6)都是阴性(无Ct)，不经聚腺苷酸化反应。这得到结论，即如预期的，没有22-聚RNA的聚腺苷酸化(1、4、7)或天然存在的miRNA(2、5、8)时，PCR扩增不存在模板，因此不能产生信号(“无Ct”)。
在“RT加倍”的批料中，在第一次温育后，为了产生可被RT反应检测的聚腺苷酸加尾的UniGap dT引物，可能在第一次反应中加入额外的RT酶和Uni GapdT引物。所有这些批料都显示无Ct，即检测不到不良产物。
也检测不到如用于cDNA合成的引物的聚腺苷酸加尾这类不良产物。
实施例3：
用本发明的方法检测各种miRNA
在本实验中，应证实可用miRNA特异性PCR引物从用本发明包括共同反转录的聚腺苷酸反应的方法合成的cDNA模板检测到几个目标。为此，用293RNA作为模板进行了该过程。用于标准条件的模板的反转录反应用作检测特异性的对照。
在随后的SYBR绿色PCR中，总的说在每种情况下，使用4种不同特异性miRNA引物和特异性引物尾之一。另外，位于人β-肌动蛋白转录物3′-端的引物与尾特异性引物一起使用，以检测聚腺苷酸化反应和反转录的效率。
对于聚腺苷酸化反应和反转录(PAP+RT反应)，如表16所示，一起加入表13的试剂。
表13：聚腺苷酸化反应和反转录的材料
聚腺苷酸聚合酶 安苄公司；产品号80U：2030
Sensiscript RT试剂盒 恰根公司；产品号50rxn：205211 腺嘌呤5’-三磷酸(rATP) 阿美沙姆公司；产品号25μmol： 27-2056-01 RNA酶抑制剂 普洛美卡公司；产品号：N2511 Uni GAP dT引物 5’-TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV VN-3’ 293RNA：来自人细胞系293(ATCC 号：CRL-1573) 用恰根公司RNeasy Midi试剂盒分离
表16：PAP+RT反应
试剂 终浓度 10x缓冲液RT 1x rATP，10mmol 1mmol 聚腺苷酸聚合酶2U/μl 2U dNTP Mix(ATGC，各5mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 1μmol RNA酶抑制剂，10U/μl 10U Sensiscript反转录酶 1μl 无RNA酶水 可变 a)293RNA，20ng/μl b)H2O作为负对照 5μl(100ng) 5μl 总体积 20μl 温育 1小时，37℃ 5分钟，93℃
在反应a)中，加入293RNA作为负对照(负对照)，在反应b)中，加入水作为负对照。作为检测特异性的对照，根据表17的图表进行了表14中所示试剂的标准反转录反应。
表14：反转录的材料
Sensiscript RT试剂盒 恰根公司；产品号50rxn：205211 RNA酶抑制剂 普洛美卡公司；产品号：N2511 Uni GAP dT引物 5’-TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV VN-3’ 293RNA 用恰根公司RNeasy Midi试剂盒分离
表17：标准RT反应
试剂 2.)RT反应 10x缓冲液RT 1x dNTP混合物(ATGC，各5mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 1μmol RNA酶抑制剂，10U/μl 10U Sensiscript反转录酶 1μl 无RNA酶水 可变 c)293RNA，20ng/μl d)H2O作为负对照 5μl(100ng) 5μl 总体积 20μl 温育 1小时，37℃ 5分钟，93℃
在反应c)中，加入293RNA作为负对照(负对照)，而在d)中，加入水作为负对照加入水作为负对照。然后样品在37℃下温育1小时。为了终止反应，反应物在93℃温育5分钟，用该温度步骤灭活酶。
在酶被灭活后，批料用水1∶2稀释，然后每2μl的各批料a)到d)用作实时SYBR绿色PCR的模板。PCR的材料如表15所示。
表15：SYBR绿色PCR的材料
QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒(200) 恰根公司；产品号：204143 let 7short(特异性miRNA引物) 5’-GAG GTA GTA GGT TGT ATA G-3’
hsa-miR-24(特异性miRNA引物) 5’-TGG CTC AGT TCA GCA GGA-3’ hsa-miR-15a(特异性miRNA引物) 5’-TAG CAG CAC ATA ATG GTT T-3’ hsa-miR-16(特异性miRNA引物) 5’-TAG CAG CAC GTA AAT ATT G-3’ β-肌动蛋白3’引物 5’-GTA CAC TGA CTT GAG ACC AGT TGA ATA AA-3’ Hum Uni引物 5’-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3’
吸取10个不同的反应批料。在反应1-5(表18)中，在每种情况下使用miRNA特异性或β-肌动蛋白3’引物和尾引物(Hum Uni)。
表18：SYBR绿色PCR反应1-5
SYBR绿色PCR的成分 终浓度 2x SYBR绿色PCR主混合物 1x Hum Uni引物，10μmol 0.5μmol 各一种特异性miRNA引物(10μmol) let 7short hsa-miR-24 hsa-miR-15a hsa-miR-16 或β-肌动蛋白3’引物 0.5μmol 无RNA酶水 可变 PAP+RT反应a)b)1∶2预稀释 标准RT反应c)d)1∶2预稀释 或H2O作为负对照 2μl(5ng) 2μl(5ng) 2μl 终反应体积 20μl
在反应6-10(表19)，每种情况下仅使用一种引物，即miRNA特异性引物或尾特异性引物。
在反应6-10(表19)，每种情况下仅使用一种引物，即miRNA特异性引物或尾特异性引物。
表19：仅用一种引物的对照反应6-10
SYBR绿色PCR的组分 终浓度 2x SYBR绿色PCR主混合物 1x 各一种特异性miRNA引物(10μmol) let 7short hsa-miR-24 hsa-miR-15a hsa-miR-16 每种都加3’Hum Uni引物 0.5μmol 无RNA酶水 可变 PAP+RT反应a)b)1∶2预稀释 标准RT反应c)d)1∶2预稀释 或H2O作为负对照 2μl(5ng) 2μl(5ng) 2μl 终反应体积 20μl
在反应中使用的引物的序列可见表20。实时PCR以两倍批料进行。
表20：引物
引物 反应1 β-肌动蛋白3’引物+Hum Uni 反应2 let 7short+Hum Uni 反应3 hsa-miR-24+Hum Uni 反应4 hsa-miR-15a+Hum Uni 反应5 hsa-miR-16+Hum Uni 反应6 HumUni 反应7 let 7short 反应8 hsa-miR-24 反应9 hsa-miR-15a 反应10 hsa-miR-16
包含在通用尾引物Hum Uni引物中的序列AAC GAG ACG ACG ACA GAC如US2003/0186288A1中所述。
PCR方案包括初步在95℃下重新活化包含在QuantiTect SYBR绿色PCR主混合物中的HotStarTaq聚合酶15分钟，然后94℃15秒，52℃30秒，和72℃30秒，进行40轮循环(见表21)。在72℃延伸步骤时，获得荧光数据。用Applied Biosystems7000快速实时PCR系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μl，然后进行解链曲线分析。
表21：3-步PCR方案
显示了在标准条件下进行的反转录的效率和本发明方法对于β-肌动蛋白系统(选来举例说明)的效率是相当的，由实时PCR中相当的Ct值证明(图6)。
当使用标准条件下产生的cDNA时，实时PCR得到了大于38的非常高的Ct值，意味着用SybrGreen进行的实时PCR检测具有非常高的特异性(图6)。在PCR产物的琼脂糖凝胶分析中，检测到预期值的PCR产物(图8)，当使用在标准条件下产生的cDNA时，没有检测到产物。
miR24产物代表获得物。在此，当使用在标准条件下产生的cDNA时，产生了错误大小的PCR产物(图8，还见图6)。一旦使用本发明方法产生的cDNA，不能检测到该产物(图8)。
用于反转录或本发明方法的对照反应(其中水代替了RNA模板)都不显示信号，即在所述的实时PCR中不能获得Ct值(图7，上部)。这也出现在仅使用一种引物的反应中(图7，上部)。对于负对照，不获得Ct值，其中在PCR中用水代替了cDNA(图7)。
实施例4：
使用聚腺苷酸化反应和反转录的联合一步法，随后用尾特异性探针检测实时PCR产生的cDNA，来检测miRNA
在此实验中，进行了实时PCR，其中使用了Taqman探针，它在尾引物(Uni GapdT)上有一特异性结合位点。通过探针检测代表了通过SYBR绿色实时PCR检测的一种可信的代替方法。使用探针还提供了多重PCR的可能性，即共扩增一种或多种额外的靶核酸，例如内部对照，其可以是例如管家基因。
对于聚腺苷酸化反应和反转录(PAP+RT反应)，如表24中所示一起加入来自表22的试剂。
表22：聚腺苷酸化反应和反转录的材料
表24：PAP+RT反应
试剂 终浓度 10x缓冲液RT 1x rATP，10mmol 1mmol 聚腺苷酸聚合酶，2U/μl 2U dNTP混合物(ATGC，各5mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 1μmol RNA酶抑制剂，10U/μl 10U Sensiscript反转录酶 1μl 无RNA酶水 可变 mleu7(109拷贝/μl) 2μl(2x109拷贝) 总体积 20μl
温育 1小时，37℃ 5分钟，93℃
然后，反应批料在37℃温育，然后93℃灭活酶5分钟。
灭活酶后，用2微升未稀释的批料作为实时PCR模板，其含有用于检测的Taqman探针。PCR的材料如表23所示，如表25所示一起加入。
表23：QT探针PCR的材料
QuantiTect Probe PCR试剂盒(200) 恰根公司Material No.：204343 let 7short(特异性miRNA引物) 5’-GAG GTA GTA GGT TGT ATA G-3’ Hum Uni引物 5’-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3’ Hum Uni探针 5’-HEX-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-BHQ-3’ 5’报道染料：HEX 3’淬灭剂：黑洞淬灭剂1
表25：QuantiTect探针PCR
QuantiTect探针PCR的材料 终浓度 2x QuantiTect探针PCR主混合物 1x Hum Uni引物，10μmol 0.5μmol let 7short(特异性miRNA引物) 0.5μmol 无RNA酶水 可变 PAP+RT反应，未稀释 2μl(2x 10^8拷贝) 终反应体积 20μl
以两倍批料进行每批实时PCR。
包含在通用尾引物Hum Uni引物中的序列AAC GAG ACG ACG ACA GAC如US2003/0186288A1中所述。从人GAPDH基因座中取出Taqman探针序列；它不包含在US2003/0186288A1中。
PCR方案包括初步在95℃下重新活化包含在QuantiTect探针PCR主混合物中的HotStarTaq聚合酶15分钟，然后94℃15秒，52℃30秒，进行45轮循环(见表26)。
表26：2-步PCR方案
在52℃退火步骤时，获得荧光数据。用7700序列检测系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μl。PCR结果如表27所示
表27：PCR结果
可以使用尾特异性探针检测，得到预期结果。
实施例5：
聚腺苷酸聚合酶浓度和温育时间在聚腺苷酸化反应和反转录的联合一步法中的影响
在此试验中，在本发明的方法中使用两种浓度的聚腺苷酸聚合酶(2U或0.5U)，各15分钟或1小时。在每种情况下，在RT缓冲液(恰根公司)和聚腺苷酸聚合酶缓冲液中测试所有条件。
对于聚腺苷酸化反应和反转录(PAP+RT反应)，如表30中所述一起加入来自表28的试剂：反应a)2U聚腺苷酸聚合酶，反应b)0.5U聚腺苷酸聚合酶)。
表28：聚腺苷酸化反应和反转录的材料
聚腺苷酸聚合酶 安苄公司；产品号80U：2030 Sensiscript RT试剂盒 恰根公司；产品号50rxn：205211 腺嘌呤5’-三磷酸(rATP) 阿美沙姆公司；产品号，25μmol： 27-2056-01
RNA酶抑制剂 普洛美卡公司；产品号：N2511 Uni GAP dT引物 5’-TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV VN-3’ 玉米RNA 使用恰根公司RNeasy小制备试剂盒 (目录号74106)根据植物方案获自1克 土生玉米壳 mleu7a寡核苷酸 5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’
表30：PAP+RT反应
试剂 终浓度 10x缓冲液RT 1x rATP，10mmol 1mmol 聚腺苷酸聚合酶，2U/μl a)2U b)0.5U dNTP混合物(ATGC，各5mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 1μmol RNA酶抑制剂，10U/μl 10U Sensiscript反转录酶 1μl 无RNA酶水 可变 mleu7a 109拷贝/μl 2μl(2x109拷贝) 玉米RNA，25ng/μl 2μl(50ng) 总体积 20μl 1.)温育 1小时，37℃ 5分钟，93℃ 2.)温育 15分钟，37℃ 5分钟，93℃
然后，样品在37℃温育(1.1小时/2.15分钟)。然后反应加热到93℃5分钟，灭活酶。
然后在每种情况下，对于每个反应，在SYBR绿色PCR掺入未稀释的2微升。反应各进行两次。为此，如表31所示加入来自表29的试剂，然后如表32所示进行PCR。
表29：SYBR绿色PCR的材料
QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒 (200) 恰根公司；产品号：204143 let 7short(特异性miRNA引物) 5’-GAG GTA GTA GGT TGT ATA G-3’ Hum Uni引物 5’-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3’
表31：SYBR绿色PCR
SYBR绿色PCR的组分 终浓度 2x SYBR绿色PCR主混合物 1x HumUni引物，10μmol 0.5μmol let 7short(特异性miRNA引物) 0.5μmol 无RNA酶水 可变 PAP+RT反应la)b)/2a)b) 2μl(2x10^8拷贝) 终反应体积 20μl
表32：3-步PCR方案
PCR方案包括初步在95℃下重新活化HotStarTaq聚合酶15分钟，其包含在QuantiTect SYBR绿色PCR主混合物中，然后94℃15秒，52℃30秒，72℃30秒进行40轮循环(见上文表32)。在72℃延伸步骤过程中，获得荧光数据。用AppliedBiosystems 7000实时PCR系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μl，接着进行解链曲线分析。
可见聚腺苷酸化反应和反转录的一步法的效率对于聚腺苷酸聚合酶的浓度和温育时间都有依赖性(图9)。
实施例6：
用各种反转录酶进行本发明的方法
本发明的方法使用RT缓冲液(恰根公司)(反应1-5)中的总共5种不同的反转录酶(见表35)，此外，为了比较，在每种情况下缓冲液中都加有反转录酶(反应6-9)。
表35：所用的反转录酶和缓冲液
1.)AMV反转录酶 2.)SuperScriptIII反转录酶 3.)HIV反转录酶 4.)M-MuLV反转录酶 5.)Sensiscript反转录酶 AMV反转录酶5x反应缓冲液 5x第一链缓冲液 10x第一链合成缓冲液 10x反转录酶反应缓冲液 10x缓冲液RT
对于聚腺苷酸化反应和反转录的一步法(PAP+RT反应)，对于反应1-5(反应缓冲液：缓冲液RT(恰根公司))如表36所述，对于反应6-9(额外的反转录酶，每种情况下在缓冲液中补充)如表37所述加入表33的试剂。
表33：聚腺苷酸化反应和反转录的材料
聚腺苷酸聚合酶 安苄公司；产品号80U：2030 AMV反转录酶 普洛美卡公司；产品号300U：M5101 SuperScript III反转录酶 英外特根公司；产品号10,000U： 18080-044 HIV反转录酶 安苄公司；产品号500U：#2045 M-MuLV反转录酶 生物实验室公司(BioLabs)；产品号 10,000U：M0253S Sensiscript RT试剂盒 恰根公司；产品号50rxns：205211
腺嘌呤5’-三磷酸(rATP) 阿美沙姆公司；产品号25μmol： 27-2056-01 RNA酶抑制剂 普洛美卡公司；产品号：N2511 Uni GAP dT引物 5’-TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV V-3’ 玉米RNA 使用恰根公司RNeasy小制备试剂盒 (目录号74106)和10倍Upscale(Maxi Shredder和Column)根据植物方案，， 来自1克土生玉米壳 见上 mleu7a寡核苷酸 5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’
表36：缓冲液RT(恰根公司)中的PAP+RT反应
试剂 终浓度 10x缓冲液RT 1x rATP，10mmol 1mmol 聚腺苷酸聚合酶，2U/μl 1U dNTP混合物(ATGC，各5mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 1μmol RNA酶抑制剂10U/μl 10U 1.)AMV反转录酶 2.)SuperScript III反转录酶 3.)HIV反转录酶 4.)M-MuLV反转录酶 5.)Sensiscript反转录酶 24U 10U 1U 10U 1μl 无RNA酶水 可变 Mleu7a 10^9拷贝/μl 2μl(2x10^9拷贝) 玉米RNA，20ng/μl 2μl(40ng) 总体积 20μl 温育 1小时，37℃
5分钟，93℃
表37：补充有反转录酶的缓冲液中的PAP+RT反应
试剂 终浓度 6.)AMV反转录酶5x反应缓冲 液 7.)5x第一链缓冲液 8.)10x第一链合成缓冲液 9.)10x反转录酶反应缓冲液 1x 1x 1x 1x rATP，10mmol 1mmol 聚腺苷酸聚合酶，2U/μl 1U dNTP混合物(ATGC，各5mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 1μmol RNA酶抑制剂，10U/μl 10U 6.)AMV反转录酶 7.)7.)SuperScript III反转录酶 8.)HIV反转录酶 9.)M-MuLV反转录酶 24U 10U 1U 10U 无RNA酶水 可变 mleu7a 109拷贝/μl 2μl(2x109拷贝) 玉米RNA，20ng/μl 2μl(40ng) 总体积 20μl 温育 1小时，37℃ 5分钟，93℃
然后，样品在37℃温育1小时。然后反应加热到93℃5分钟，灭活酶。
然后在每种情况下，对于每个反应，在SYBR绿色PCR掺入2微升。反应各测试两次。为此，如表38所示加入来自表34的试剂，然后如表39所示进行PCR。
表34：SYBR绿色PCR的材料
QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒 (200) 恰根公司；产品号：204143 Let 7short(特异性miRNA引物) 5’-GAG GTA GTA GGT TGT ATA G-3’ Hum Uni引物 5’-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3’
表38：SYBR绿色PCR
SYBR绿色PCR的组分 终浓度 2x SYBR绿色PCR主混合物 1x Hum Uni引物，10μmol 0.5μmol let 7short(特异性miRNA引物) 0.5μmol 无RNA酶水 可变 PAP+RT反应物，未稀释 2μl(2x108拷贝) 终反应体积 20μl
表39：3步PCR方案
PCR方案包括初步在95℃下重新活化HotStarTaq聚合酶15分钟，其包含在QuantiTect SYBR绿色PCR主混合物中，然后94℃15秒，52℃30秒，72℃30秒进行40轮循环(见表39)。在72℃延伸步骤过程中，获得荧光数据。用AppliedBiosystems 7000实时PCR系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μl，接着进行解链曲线分析。
对于标准反转录反应优化反转录酶的用量，可能可解释观察到的Ct值中的差异。
实施例7：
证明在同一反应容器中聚腺苷酸化反应、反转录和PCR的联合三步法的可行性；各种添加物对于检测22聚RNA寡核苷酸的效率的影响
在此实验中，证明了在同一反应容器中聚腺苷酸聚合酶反应、反转录、和PCR的联合三步法的可行性。为此，在下列条件下用所示批料进行联合三步法。
作为对照，用图1B所示的二步法进行反应。
对于聚腺苷酸化反应、反转录和PCR(PAP+RT反应+PCR)的三步法，如表41所示使用表40的材料。
表40：聚腺苷酸化反应，反转录和PCR的材料
聚腺苷酸聚合酶 艾比中心生物技术公司(Epicenter Biotechnologies)；产品号400U： PAP5104 QuantiTect多重RT-PCR试剂盒 恰根公司；产品号200rxns：204643. 腺嘌呤5’-三磷酸(rATP) 阿美沙姆公司；产品号，25μmol： 27-2056-01 dNTP混合物(ATGC，各10mmol) 阿美沙姆公司；产品号恰根公司 Intern 1007430 RNA酶抑制剂 普洛美卡公司；产品号：N2511 Uni GAP dT引物 5’-TGG AAC GAG ACG ACG ACA GAC CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV VN-3’ 玉米RNA 使用恰根公司RNeasy小制备试剂盒 (目录号74106)的植物方案和10倍 Upscale(Maxi Shredder和Column)，得 自1克土生玉米壳 见上 mleu7a寡核苷酸 5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’ let 7short(特异性miRNA引物) 5’-GAG GTA GTA GGT TGT ATA G-3’ Hum Uni引物 5’-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3’ GAPDH-TM-HEX_BHQ 聚腺苷酸 RNA 5’HEX-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-BHQ 3’，阿美沙姆生物科学 公司(Amersham Biosciences)产品
随机N8引物 寡dT 12 号27-4110-01，以25μg/μl溶于无 RNA酶的水 NNNNNNNN TTTTTTTTTTTT-3’磷酸
表41：PAP+RT反应+PCR，使用QuantiTect多重RT-PCR主混合物(恰根公司)中的批料
试剂 终浓度 2x QuantiTect多重RT-PCR主混合物 1x rATP，10mmol 100μmol 聚腺苷酸聚合酶，4U/μl 1U dNTP混合物(ATGC，各10mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 0.05μmol RNA酶抑制剂，40U/μl 10U QuantiTect多重RT混合物 0.2μl Hum Uni引物，10μmol 0.5μmol let 7short(特异性miRNA引物) 0.5μmol GAPDH-TM-HEX_BHQ 0.2μmol 无RNA酶水 可变 Poly A RNA，25μg/μl 10ng/μl N8随机引物 0.05μmol 寡dT12 5μmol mleu7a 109拷贝/μl 2μl(2x109拷贝) 玉米RNA，20ng/μl 2μl(40ng) 总体积 20μl
反应各进行三次。为此，如表41所述加入表40的试剂，如表42所述进行反应。
表42：三合一反应的反应方案
反应方案首先包括聚腺苷酸聚合酶和用QuantiTect多重反转录酶混合物的联合反应的条件(45分钟，37℃，和15分钟，50℃)。然后，95℃温育15分钟，以灭活聚腺苷酸聚合酶和反转录酶，并活化包含在QuantiTect多重RT-PCR主混合物中的HotStarTaq DNA聚合酶。然后是94℃15秒，52℃30秒，共45轮PCR循环(见表43)，以在实时PCR中扩增产生的let7a-cDNA。为了检测，使用对Uni Gap dT引物特异性的荧光标记探针。在52℃退火/延伸步骤中获得荧光数据。用AppliedBiosystems 7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)以20微升的反应体积进行该“三合一”反应。
如图14所示，“三合一”反应能特异性检测玉米RNA背景下的合成性22聚RNA寡核苷酸。在玉米RNA背景下含有合成性22聚RNA寡核苷酸的样本提供了20.61的Ct值，而玉米RNA的对照反应得到了309.65的Ct值。实验显示在给定的条件下可技术性使用“三合一”反应。
实施例8：
用手工PCR引物“Hot Starts”进行本发明的“三合一”反应，以促进联合三步法的反应。作为对照，基于图1B进行了两步法的反应。
如表44所示，用表43所示材料进行了反应。
表43：聚腺苷酸化反应，反转录和PCR的材料
表44：QuantiTect多重RT-PCR主混合物(恰根公司)中的PAP+RT反应+PCR
试剂 终浓度 2xQuantiTect多重RT-PCR主混合物 1x rATP.10mmol 100μmol 聚腺苷酸聚合酶，4U/μl 1U dNTP混合物(ATGC，各5mmol) 0.5mmol Uni GAP dT引物，10μmol 0.05μmol
RNA酶抑制剂，40U/μl 10U QuantiTect多重RT Mix 0.2μl 无RNA酶水 可变 Poly A，25μg/μl 10ng/μl N8随机引物 0.05μmol 寡dT12 5μmol mleu7a 109拷贝/μl 2μl(2x109拷贝) 玉米RNA，20ng/μl 2μl(40ng) 总体积 20μl
使用表45的PCR引物，制备了引物混合物，将每个反应所需的量加入到光学帽的顶盖上(实时PCR容器的盖，应用生物系统公司；产品号4323032)。然后，在加热块上37℃温育盖20分钟，直到液体蒸发，从而干燥引物。
盖中PCR引物干燥完成后，如表44所示将试剂加到一起，并加到光学管(实时PCR容器，应用生物系统公司；产品号4316567)中，密封并预处理光学帽，如表47所示进行PCR。
反应每次测试三次。
表45：PCR盖中干燥的寡核苷酸混合物的组成
Oligo/rxn量 重溶解后PCR中的终浓度 Hum Uni引物 10pmol 0.5μmol let 7short(特异性miRNA引物 10pmol 0.5μmol GAPDH-TM-HEX_BHQ 4pmol 0.2μmol
表46：“三合一”反应的反应方案
反应方案首先包括聚腺苷酸聚合酶和用QuantiTect多重反转录酶混合物的联合反应的条件(45分钟，37℃，和15分钟，50℃)。然后，95℃加热3分钟，以灭活聚腺苷酸聚合酶和反转录酶。然后，从装置中简单取下PCR管，并将其倒置，使存在于盖中的干燥的PCR引物重新溶解，并使其能用于随后的PCR反应。随后95℃温育12分钟，以活化包含在QuantiTect多重RT-PCR主混合物中的HotStarTaqDNA聚合酶。在此选择短3分钟的重新活化，因为反应混合物先前已经为了灭活聚腺苷酸聚合酶和反转录酶而在95℃加热了3分钟。接着进行45轮的PCR循环，即94℃15秒，52℃30秒(见表47)，以在实时PCR中扩增产生的let7a-cDNA。为了检测，使用对Uni Gap dT引物特异性的荧光标记探针。在52℃退火/延伸步骤中获得荧光数据。用Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)以20微升的反应体积进行该“三合一”反应。
附图
图1显示了本发明的一步法(B)和现有技术已知的两步法(A)之间的比较。聚腺苷酸聚合酶：本发明具有聚腺苷酸化活性的酶；反转录酶：本发明具有反转录酶活性的酶；rATP：核糖核苷酸，在此例如腺嘌呤-5’-三磷酸；dNTPs：脱氧核糖核苷酸；寡dT尾引物：锚定寡核苷酸，根据本发明有不同可能的例子；Uni GAP dT引物：锚定寡核苷酸的特定实施例；尾：作为锚定寡核苷酸可选部分的5’尾；
w：定义为通过聚腺苷酸化活性结合的同聚物尾在本发明中的长度(大于10-20个碱基)；x，y：定义为本发明锚定寡核苷酸的3′-锚定序列在本发明中的类型和长度；z：定义为本发明锚定寡核苷酸的同聚部分的长度。
图2显示了表6的Ct值的图解：情况a)包含每一种情况下的模板，情况b)仅加入H2O而不是模板(PAP反应中的H2O)。在b)中，PCR40轮循环(进行的最大循环数)也没有得到信号，因此表示为“无Ct”。
图3显示了实施例1的实时PCR产物的琼脂糖凝胶分析。M：100bp梯(英外特根公司，目录号15628-050)。2％琼脂糖用TAE中的溴乙锭染色，作为跑胶缓冲液。加样图：1号泳道：标记，然后在每种情况下彼此相邻点3个测试点：1a，1b，2a，2b，3a，3b，4a，4b。
图4显示了实时PCR分析表8所述批料的反应产物的Ct值的表格。在3和6中，PCR40轮循环(进行的最大循环数)也没有得到信号，因此表示为“无Ct”。
图5显示了实时PCR分析表8所示批料的反应产物的Ct值的图示。
图6显示了用表18所述的批料b)和e)的反应产物进行实时PCR分析获得的Ct平均值的表格。
在标准RT的2、4和5中，仅在38轮循环后最早检测到信号，或在2)中，无信号，因此表示为“无Ct”。
图7显示了表18批料b)和d)，表19仅一个引物的对照，批料a)-d)的实时PCR结果的表格。PCR40轮循环(进行的最大循环数)也没有得到信号，因此表示为“无Ct”。
图8显示了实施例3的实时PCR产物的琼脂糖凝胶分析。M：100bp梯(英外特根公司，目录号15628-050)。2％琼脂糖，用溴乙锭染色，用TAE作为跑胶缓冲液。
图9显示了表30中所述的批料1a、b)和2a)、b)的反应产物通过实时PCR分析获得的Ct平均值的表格。
下部：表30所述批料的反应产物通过实时PCR分析获得的Ct平均值的图示。
图10显示了表36，1-5和表37，6-9中所述的批料的反应产物通过实时PCR分析获得的Ct平均值的表格。
下部：表36，1-5和表37，6-9中所述的批料的反应产物通过实时PCR分析获得的Ct平均值的图示。
图11显示了所用的核酸序列清单。
图12显示了本发明的锚定寡核苷酸。
图13显示了本发明的一步“三合一”法(B)和现有技术已知的三步法(A)之间的比较。聚腺苷酸聚合酶：本发明具有聚腺苷酸化活性的酶；
反转录酶：本发明具有反转录酶活性的酶；
rATP：核糖核苷酸，本文中以腺嘌呤-5′-三磷酸为例；
dNTP：脱氧核糖核苷酸；
寡dT尾引物：本发明中具有各种可能例子的锚定寡核苷酸；
Uni GAP dT引物：锚定寡核苷酸的特定例子；
尾：作为锚定寡核苷酸一可选部分的5’-尾；
w：定义为通过聚腺苷酸化活性结合的同聚物尾在本发明中的长度(大于10-20个碱基)；
x，y：定义为本发明锚定寡核苷酸的3′-锚定序列在本发明中的类型和长度；
z：定义为本发明锚定寡核苷酸的同聚部分的长度；
PCR引物：用于特异性检测cDNA的至少一个寡核苷酸，可任选至少一个探针；
PCR酶：使样本中所含cDNA被特异性检测的酶活性。
图14显示了实施例7中的反应批料(对应于表41)和表42的反应批料的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值表格。
下部：实施例7中的反应批料(对应于表41)和表42的反应批料的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值图示。
图15显示了实施例8中的反应批料(对应于表44)和表46的反应批料的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值表格。
下部：“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值图示。
图16显示了不同量的miRNAeasy RNA(10pg到1μg)，其用miScript在存在或不存在100ng聚腺苷酸或聚胞苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试了miR-16和let-7a。
图17显示了不同量的miRNAeasy RNA(10pg到1μg)，其用miScript在存在或不存在不同量的聚腺苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试了miR-16。
图18显示了不同量的miRNAeasy RNA(10pg到1μg)，其用miScript在存在或不存在不同量的聚胞苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试了miR-16。
图19显示了使用10pg miRNAeasy RNA，其用miScript RT试剂盒在存在或不存在50ng聚胞苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA用于实时PCR检测GADPH。
图20显示了不同量的miRNAeasy RNA的(1-100ng)，其用miScript在存在或不存在不同量的聚胞苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA用于实时PCR，在这种情况下，测试GADPH。
图21显示了使用10pg和100pg miRNAeasy RNA，其用miScript RT试剂盒在存在或不存在50ng聚胞苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA在实时PCR中测试，用于检测GADPH。
图22显示了不同量的miRNAeasy RNA(1-100ng)，其用miScript在存在或不存在不同量的聚胞苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试了CDC2。
图23显示了用1ng miRNAeasy RNA，其用miScript RT试剂盒在存在或不存在50ng聚胞苷酸的情况下反转录。如此产生的cDNA在实时PCR中测试，用于检测CDC2。