新的产生同质琥珀酸的工程微生物以及使用这些微生物制备同质琥珀酸的方法 【技术领域】
本发明涉及一种产同质琥珀酸的瘤胃细菌突变体以及使用这些瘤胃细菌突变体制备同质琥珀酸的方法，具体涉及选自在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸同时很少产生或者不产生其他有机酸的瘤胃细菌突变体，所述瘤胃细菌突变体通过使编码乳酸脱氢酶(ldhA)的基因、编码磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase，pta)的基因和编码乙酸激酶(ackA)的基因断裂但不使编码丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)的基因断裂而得到，还涉及使用这些瘤胃细菌突变体制备琥珀酸的方法。
背景技术
琥珀酸(HOOCCH2CH2COOH)，一种包括4个碳原子的二羧酸，是一种具有高度实用性的有机酸，其被广泛用于药物前体、食品、化妆品以及其他工业的化学产品(Zeikus等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，51：545，1999；Song等人，Enzyme Microbial Technol.，39：352，2006)。特别是，随着最近石油价格暴涨，预期对于将琥珀酸作为生物降解大分子的主要来源的需要急剧增加(Willke等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，66：131，2004)。
琥珀酸可通过化学合成法和发酵法生产。但是，用于工业应用的大部分琥珀酸目前由中国石化公司、日本石化公司和大的石化公司诸如BASF，DuPont，BP石化等使用来自石油的n-丁烷和乙炔作为原料通过化学合成法生产，仅仅少量用于专门用途诸如药物等的琥珀酸是通过常规微生物发酵法来生产的。上面提到的化学合成法的问题是在琥珀酸生产过程中排出了大量产生的有害废物、废水和废气(例如CO等)。特别是，极可能资源耗尽的矿物燃料被用作基本材料，因此迫切需要开发一种使用替代燃料诸如可再生资源代替矿物燃料来制备琥珀酸的方法。
为了克服由制备琥珀酸的化学合成过程引起的这些问题，许多研究者已经就通过使用各种可再生资源进行微生物发酵产生琥珀酸方面进行了深入广泛的研究。已经被用于琥珀酸生产的微生物有很多，但它们一般可被归类为重组大肠杆菌(Escherichia.Coli)和瘤胃细菌(放线杆菌，厌氧螺菌，类杆菌，Mannheimia，琥珀酸单胞菌，琥珀酸弧菌等)(Song等人，Enzyme Microbial Technol.，39：352，2006)。
在关于使用重组E.coli生产琥珀酸的研究中，试图通过制备突变AFP111(ATCC No.202021)增加琥珀酸的产量，所述突变AFP111由芝加哥大学研究组通过其中葡萄糖转运基因(ptsG)受到调控同时在E.coli中生产乳酸和蚁酸中涉及的基因(ldh和pfl)被剔除而得到(美国专利US5,770,435)。
本发明的发明人在重组E.coli NZN111菌株中扩增了在琥珀酸产生中涉及的苹果酸酶(sfcA)基因，从该菌株中剔除了ldh和pfl基因以抑制在NZN111菌株的发酵过程中积累的丙酮酸，从而增加了琥珀酸的产量(Hong等人，Biotechnol.Bioeng.，74：89，2001)。而且，佐治亚大学领导的团队的研究人员已经通过在AFP111菌株中表达丙酮酸氧化酶(pyc)基因构建了AFP111/pTrc99A-pyc菌株，然后使用该菌株生产琥珀酸(Vemuri等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，28：325，2001)。近来，为了诱导琥珀酸在厌氧条件下产生，Rice University领导的团队的研究人员报道了他们已经通过对糖酵解途径，TCA循环和乙醛酸途径中涉及的基因构建了重组E.coli菌株(Lin等人，Eng.，7：116，2005；Lin et al.，Biotechnol.Bioeng.，90：775，2005)。
已知作为瘤胃细菌的放线杆菌菌株、厌氧螺菌菌株和Mannheimia菌菌株是非常好的琥珀酸产生菌，于是对这些菌株进行了积极的研究。美国Michigan Biotechnology Institute(MBI)领导的团队的研究人员发现了琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)130Z菌株(ATCCNo.55618)，使用传统的化学诱变方法发展了用于生产琥珀酸的方法和构建的各种琥珀酸放线杆菌突变菌株，以便在发展用于生产并纯化琥珀酸的工艺中使用(美国专利US5,521,075；美国专利US5,168,055；美国专利US5,143,843)。
但是，迄今为止发展的使用微生物发酵的琥珀酸生产工艺具有不到2g/L/h的非常低的产量，尤其是其招致了极大的成本来分离并纯化琥珀酸，因为在发酵过程中琥珀酸与在某些程度上作为副产品的大量各种有机酸和乙醇一起产生。虽然上述结果显示在一些重组菌株中作为副产品的乳酸、蚁酸、醋酸和乙醇的影响减小，但没有显示它们完全被消除。另外，在其他重组的突变菌株中，存在的一些情况是它们地生长速率变得很低，总琥珀酸产量并没有增加。因此，迫切需要开发新的琥珀酸产生菌株，其具有高琥珀酸产量并防止副产品的产生(Hong等人，Biotechnol.Lett.，22：871，2000)。
为了开发新的琥珀酸产生菌来满足上述需要，必须进行具有非常高的琥珀酸产量的菌株的分离，完成其基因组序列，理解其新陈代谢特性并建立对于构建重组菌株所需的遗传操作技术。到目前为止，在具有高琥珀酸产量的细菌的情况下，完成了M.succiniciproducens MBEL 55E菌株的全基因组序列，但是那些瘤胃细菌诸如放线杆菌，厌氧螺菌等仍未见报道。虽然已经报道了试图通过在E.coli中扩增A.succinogenes和A.succiniciproducens的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)基因的尝试(Kim等人，Appl.Environ.Microbiol.，70：1238，2004；Laivenieks等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：2273，1997)，但没有尝试基于基因组序列开发重组琥珀酸产生菌。
本发明的发明人已经报道了他们分离了来自韩国本土黄牛的高效产生琥珀酸的M.succiniciproducens MBEL 55E(KCTC 0769BP)，完成了基因组序列并描述了菌株的新陈代谢特性(Hong等人，Nature Biotechnol.，22：1275，2004)。而且，本发明的发明人通过使作为瘤胃细菌的一种的M.succiniciproducens MBEL 55E中编码乳酸脱氢酶(ldhA)的基因和编码丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)的基因断裂以抑制乳酸和蚁酸的产生构建了细菌突变体M.succiniciproducens LPK(KCTC 10558BP)。除此之外，本发明通过在突变菌株M.succiniciproducens LPK中使编码磷酸转乙酰酶(pta)的基因和编码乙酸激酶(ackA)的基因断裂以便抑制醋酸的产生构建了突变M.succiniciproducens LPK7(KCTC 1062BP)，以在厌氧条件下培养细菌突变体(WO 05/052135A1；Lee等人，Appl.Environ.Microbiol.72：1939，2006)，从而增加琥珀酸。但是，在所述突变菌株的情况下，虽然副产品蚁酸和醋酸的产生在一定程度上受到抑制，但在发酵过程中大量的丙酮酸作为副产品积累，与野生菌相比其中绝大多数细菌的生长速率低致不能达到很高的琥珀酸产量。
同时，据报道丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)基因参与丙酮酸到乙酰辅酶A(乙酰-CoA)的转化，从而影响细胞的生长和丙酮酸的重新分布(Wolfe，Microbial.Mol.Biol.Rev.，69：12，2005)。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力，通过将微生物生长率的降低最小化并完全抑制各种副产品包括丙酮酸的形成，构建了能够高产量产生同质琥珀酸的突变微生物，并发展了其发酵方法，结果，他们通过在作为瘤胃细菌的一种的M.succiniciproducens MBEL55E中使编码乳酸脱氢酶(ldhA)的基因、编码磷酸转乙酰酶(pta)的基因和编码乙酸激酶(ackA)的基因断裂但不使编码丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)的基因断裂而构建了细菌突变体M.succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP)，然后在厌氧条件下使用葡萄糖和甘油作为碳源发酵突变菌株，并确认突变菌株可高产量产生几乎同质的琥珀酸，从而完成了本发明。
【发明内容】
因此，本发明的一个目的在于提供突变微生物，其具有高生长率和琥珀酸产率并在厌氧发酵阶段过程中仅仅以高产量产生琥珀酸同时产生很少其他有机酸或者不产生其他有机酸。
本发明的另一目的在于提供通过使用葡萄糖和甘油作为碳源在厌氧条件下培养突变微生物产生同质琥珀酸而不积累其他副产品的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了产生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脱氢酶(ldhA)基因、磷酸转乙酰酶(pta)基因和乙酸激酶(ackA)基因而同时仅保持蚁酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃细菌突变体，其具有在厌氧条件下仅仅高浓度产生琥珀酸同时很少产生或者不产生有机酸的特性。
而且，本发明提供了在M.succiniciproducens中缺乏乳酸脱氢酶(ldhA)基因、磷酸转乙酰酶(pta)基因和乙酸激酶(ackA)基因而同时保持蚁酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃细菌突变体Mannheimiasucciniciproducens PALK(KCTC 10973BP)，其具有在厌氧条件下仅仅高浓度产生琥珀酸同时很少产生或者不产生有机酸的特性。
另外，本发明提供了用于生产瘤胃细菌突变体的方法，所述方法包括下列步骤：(a)使用同源重组法再琥珀酸产生瘤胃细菌的基因组中通过使乳酸脱氢酶(ldhA)基因断裂得到缺乏编码乳酸脱氢酶(ldhA)基因的瘤胃细菌突变体；和(b)通过同源重组从缺乏编码乳酸脱氢酶(ldhA)基因的瘤胃细菌突变体的基因组中使编码磷酸转乙酰酶(pta)的基因和编码乙酸激酶(ackA)的基因断裂得到缺乏编码乳酸脱氢酶(ldhA)基因、编码磷酸转乙酰酶(pta)的基因和编码乙酸激酶(ackA)的基因的瘤胃细菌突变体。
此外，本发明提供了用于生产琥珀酸的方法，所述方法包括下列步骤：在厌氧条件下培养瘤胃细菌突变体；并且从培养液中回收琥珀酸。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施例将更加明显。
【附图说明】
图1是显示根据本发明的在突变微生物中的琥珀酸产生途径的示意图。
图2显示了通过同源重组构建用于断裂ldhA(pMLKO-sacB)的置换载体的过程。
图3显示了通过同源重组使Mannheimia succiniciproducensMBEL55E中的ldhA基因断裂构建细菌突变体(M.succiniciproducensLK)的过程。
图4显示了通过同源重组构建用于断裂pta和ackA(pPTA-sacB)的置换载体的过程。
图5显示了通过同源重组使M.succiniciproducens PALK中的ldhA和pta-ackA基因断裂构建细菌突变体的过程。
图6使显示M.succiniciproducens PALK中的pta-ackA的断裂的电泳照片，其中M代表1kb的标记物，第1-6道代表使用引物PAU1和SP1的PCR片段(1.1kb)；A-F道代表使用引物SP2和PAD2的PCR片段(1.5kb)。
图7显示了本发明的M.succiniciproducens PALK在CO2饱和的厌氧条件下的培养特性。
【具体实施方式】
在一个方面，本发明涉及产生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脱氢酶(ldhA)基因、磷酸转乙酰酶(pta)基因和乙酸激酶(ackA)基因断裂而同时仅保持蚁酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃细菌突变体，其具有在厌氧条件下仅仅高浓度产生琥珀酸同时很少产生或者不产生有机酸的特性。
在本发明中，产琥珀酸的微生物指的是与乙醇或者其他有机酸相比能够产生超大量琥珀酸的微生物，其可通过发酵被用于琥珀酸生产的工业用途。
典型的产琥珀酸微生物包括瘤胃细菌。通过部分遗传信息(16srRNA)，酶分析，作为瘤胃细菌属琥珀酸放线杆菌、厌氧螺菌和到目前为止已知的各种琥珀酸产生瘤胃细菌的发酵结果，发现在瘤胃细菌中用于通过碳源进行琥珀酸生产的主要生物合成途径与作为瘤胃细菌属的一种的Mannheimia sp中用于琥珀酸产生的合成途径几乎相同(表1；Vander Werf等人，Arch Microbiol.，167：332，1997；Laivenieks等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：2273，1997；Samuelov等人，App.Environ.Microbiol.，65：2260，1999；Kim等人，Appl.Environ.Microbiol.，70：1238，2004))。尤其是在琥珀酸生产中涉及的所有的瘤胃细菌在琥珀酸生产时使用CO2固定酶将磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸、C3化合物转化成草酰乙酸盐和苹果酸盐、C4化合物，从而产生琥珀酸。另外，瘤胃细菌在厌氧条件下产生醋酸、蚁酸和乳酸作为发酵副产品，从而建议所有的瘤胃细菌包括Mannheimia sp具有相同的琥珀酸生物合成途径。
表1
产琥珀酸瘤胃细菌
菌株 参考文献 产琥珀酸噬纤维菌 (Cytophaga succinicans) Anderson等人，J.Bacteriol.，81：130， 1961 琥珀酸纤维杆菌 (Fibrobacter succinogenes) Wood et al.，J.Cereal.Sci.，19：65，1994 黄色瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens) Iannotti等人，Appl.Environ.Microbiol.， 43：136，1973 溶淀粉琥珀酸单胞菌 (Succinimonas amylolytica) Bryant，Bacteriol.Rev.，23：125，1959 Succinivibrio dextrinisolvens Bryant，Bacteriol.Rev.，23：125，1959 琥珀酸放线杆菌 (Actinobacillus succinogenes) Glutter等人，Int.J.Syst.Bacteriol.， 49：207，1999 产琥珀酸Mannheimia菌 (Mannheimia succiniciproducens) Hong等人，Nature Biotechnol.，22：1275， 2004
在本发明中，能够高浓度产生琥珀酸同时很少或者不产生其他有机酸的具有高生长速率的产琥珀酸突变微生物通过操作产琥珀酸微生物的瘤胃细菌基因组构建。换言之，乳酸脱氢酶(ldhA)基因、磷酸转乙酰酶(pta)基因和乙酸激酶(ackA)基因在M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)的基因组DNA中被断裂，从而构建了细菌突变体M.succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP)，其显示了高生长率并产生高浓度琥珀酸同时产生很少或者不产生其他有机酸。
在本发明中，为了每个基因的断裂，采用了通过同源重组置换基因使其失活的方法，但任何方法都可无限制地被使用，只要其为其中相应基因可被修饰或者剔除使不产生由相应基因编码的酶的基因操作方法。
在本发明中，瘤胃细菌选自由Mannheimia属、放线杆菌属和厌氧螺菌属所组成的组。
在本发明中，突变微生物优选仅仅产生琥珀酸同时形成很少或者不形成其他有机酸副产品的同质发酵菌株，所产生的其他有机酸的量优选少于产生的琥珀酸量的1wt％，其他有机酸优选为任何一种或多种有机酸，其选自由乳酸、醋酸、蚁酸和丙酮酸所组成的组。
在另一方面，本发明涉及在M.succiniciproducens中缺乏乳酸脱氢酶(ldhA)基因、磷酸转乙酰酶(pta)基因和乙酸激酶(ackA)基因同时保持丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃细菌突变体M.succiniciproducensPALK(KCTC 10973BP)，其具有在厌氧条件下高浓度产生琥珀酸同时很少产生或者不产生有机酸的特性。
通过使用在Mannheimia属的基因组中使编码乳酸脱氢酶(ldhA)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)基因，磷酸转乙酰酶(pta)基因和乙酸激酶(ackA)基因断裂构建的M.succiniciproducens LPK7(KCTC 10626BP)以便将根据本发明的Mannheimia succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)的琥珀酸产率和生长率与传统细菌突变体进行比较。这里，细菌突变体M.succiniciproducens LPK7(KCTC 10626BP)具有在根据本发明的M.succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP)中编码丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)的基因另外的断裂(WO2005/052135；Lee等人，Appl.Environ.Microbiol.72：1939，2006)。
根据本发明的M.succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP)具有高琥珀酸产率并产生很少或者不产生副产品诸如乳酸、醋酸、蚁酸和丙酮酸，从而与用于琥珀酸生产的野生型M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)和以前构建的细菌突变体M.succiniciproducens LPK7(KCTC 10626BP)相比显示了优异的性能，与以前构建的细菌突变体M.succiniciproducens LPK7(KCTC 10626BP)相比通过防止丙酮酸积累，由于其高生长率、高琥珀酸产率和同质琥珀酸产生从而可产生高浓度琥珀酸。
在还一方面，本发明涉及用于构建瘤胃细菌突变体的方法，所述方法包括下列步骤：(a)使用同源重组法在产琥珀酸瘤胃细菌的基因组中通过使乳酸脱氢酶(ldhA)基因断裂得到缺乏编码乳酸脱氢酶(ldhA)基因的瘤胃细菌突变体；和(b)通过同源重组从缺乏编码乳酸脱氢酶(ldhA)基因的瘤胃细菌突变体的基因组中使编码磷酸转乙酰酶(pta)的基因和编码乙酸激酶(ackA)的基因断裂得到缺乏编码乳酸脱氢酶(ldhA)基因、编码磷酸转乙酰酶(pta)的基因和编码乙酸激酶(ackA)的基因的瘤胃细菌突变体。
在本发明中，同源重组步骤(a)优选使用含有断裂的ldhA的基因交换载体进行，同源重组步骤(b)优选使用含有断裂的pta-ackA的基因交换载体进行。
在本发明中，含有断裂的ldhA的基因交换载体优选pMLKO-sacB，含有断裂的pta-ackA的基因交换载体优选pMPKO-sacB。
本发明还提供了用于生产琥珀酸的方法，所述方法包括下列步骤：在厌氧条件下培养上述突变微生物；并且从培养液中回收琥珀酸。
在本发明中，对于培养而言，葡萄糖和甘油优选被用作碳源，作为副产品的其他有机酸的量优选小于所产生的琥珀酸的量的1wt％。
在又一方面，本发明涉及制备琥珀酸的方法，所述方法包括下列步骤：在厌氧条件下培养瘤胃细菌突变体；并且从培养液中回收琥珀酸。
根据本发明的产琥珀酸突变微生物的培养和琥珀酸的回收过程可通过常规发酵过程中已知的培养方法和分离并纯化琥珀酸的方法来进行。
在本发明中，对于培养而言，葡萄糖和甘油优选被用作碳源，作为副产品的其他有机酸的量优选小于所产生的琥珀酸的量的1wt％。
实施例
此后将通过实施例进一步详细描述本发明。但是，对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅用于解释的目的而提供，本发明不限于这些实施例或者不由这些实施例限制。
特别是，下面的例子仅仅示出了作为产琥珀酸微生物的Mannheimiasp.作为宿主菌以便根据本发明剔除基因。但是，对本领域技术人员来说显而易见的是，即便是使用其他种类的产琥珀酸微生物，也可获得产生同质琥珀酸的突变微生物。
实施例1：ldhA断裂载体(pMLKO-sacB)的构建
为了通过同源重组使产琥珀酸微生物的基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)断裂，按照下列方式构建了基因交换载体。首先，以M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)作为模板使用在下面的序列号：1和序列号：2中阐明的引物进行PCR，然后将得到的含有ldhA-同源区1(L1)的PCR片段用SacI和PstI酶切并引入到pUC18载体中(New England Biolabs，Inc.，USA)，从而构建pUC18-L1。
序列号：1：5’-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG
序列号：2：5’-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA
另外，M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)的基因组DNA作为模板使用在下面的序列号：3和序列号：4中阐明的引物进行PCR，然后将得到的含有ldhA-同源区2(L2)的PCR片段用PstI和HindIII酶切并引入到pUC18载体中，从而构建pUC18-L1-L2。
序列号：3：5’-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC
序列号：4：5’-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG
为了将抗-卡那霉素基因作为选择标记插入到pUC18-L1-L2中，并用PstI酶切pUC4K载体(Pharmacia，Germany)，将得到的抗-卡那霉素基因与用PstI酶切的pUC18-L1-L2融合，从而构建pUC18-L1-KmR-L2。将在序列号：5中阐明的接头插入到用SacI酶切的pUC18-L1-KmR-L2中，从而形成新的XbaI酶切位点。
序列号：5：5’-TCTAGAAGCT
为了将sacB基因插入到其中已经被插入XbaI酶切位点的pUC18-L1-KmR-L2中，以pKmobsacB(Schafer等人，Gene，145：69，1994)作为模板使用在序列号：6和7中阐明的引物进行PCR。然后得到的含有sacB的PCR片段用XbaI酶切，并插入到其中已经插入了上述XbaI酶切位点的pUC18-L1-KmR-L2的新XbaI限制酶位点中，从而构建用于断裂ldhA基因的交换载体pMLKO-sacB(图2)。
序列号：6：5’-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG
序列号：7：5’-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC
实施例2：M.succiniciproducens LK菌株的构建
通过使用在实施例1中构建的pMLKO-sacB作为断裂ldhA基因的交换载体断裂M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)基因组中的ldhA基因构建突变菌株(图3)。
换言之，将M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)接种于(plated on)含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖平板培养基中，并37℃培养36小时。形成的菌落接种到(inoculated)10ml LB-葡萄糖液体培养基中，并培养12小时。将已经充分生长的1％的培养液接种到100ml LB-葡萄糖液体培养基中并在摇床中以200rpm、在37℃下培养。
当在4-5小时之后培养液的OD600达到大约0.3-0.4时，将其在4℃下以4500rpm离心20分钟以收集细胞。然后，将细胞在4℃下悬浮于200ml 10％甘油溶液中。将悬液在4℃下以5500rpm离心20分钟，并收集细胞。以上面描述的过程相同的方式在一半的上述甘油溶液中悬浮并收集两次之后，以1∶1的体积比将细胞悬浮在甘油中，得到浓缩的细胞。
将由此得到的浓缩细胞与在实施例1中构建的pMLKO-sacB基因交换载体混合，然后通过在1.8kV、25μF和200欧姆条件下电穿孔将pMLKO-sacB引入到培养的M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)中。将1ml LB-葡萄糖液体培养基加入到引入了pMLKO-sacB的菌株中，在37℃下以200rpm在摇床中预培养一小时。将培养液接种于含有抗生素卡那霉素(终浓度为25μg/ml)的LB-葡萄糖固体培养基中并在37℃培养48小时或更长。为了选择其中仅仅发生双交换的菌落，将形成的菌落在含有卡那霉素(25μg/ml)和100g/L蔗糖的LB-蔗糖固体培养基上划线。24小时之后，形成的菌落在相同的培养基上再次划线。
将在培养基上形成的菌落(突变体)在含有抗生素的LB-葡萄糖液体培养基中培养，从培养的菌株中通过Rochelle等人描述的方法(Rochelle等人，FEMS Microbiol.Lett.，100：59，1992)分离基因组DNA。使用分离的突变体基因组DNA作为模板进行PCR，并且将PCR产物进行电泳以确认基因组DNA中的ldhA基因断裂。
为了确认ldhA基因的断裂，按照下列方式进行两次PCR。第一，突变体基因组DNA作为模板使用在序列号：8和序列号：9中阐明的引物进行PCR。
序列号：8：5’-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC(KM1)
序列号：9：5′-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC(LU1)
然后，突变体基因组作为模板使用在序列号：10和序列号：11中阐明的引物进行PCR。
序列号：10：5’-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG(KM2)
序列号：11：5’-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC(LD2)
将两次PCRs中得到的PCR片段进行凝胶电泳，通过它们的大小确认ldhA基因的断裂。具有断裂的ldhA基因的基因组DNA的PCR片段通过下列事实确认：使用序列号：8(KM1)和序列号：9(LU1)引物的PCR得到的产物具有1.5kb的大小，同时使用序列号：10(KM2)和序列号：11(LU2)引物的PCR得到的产物具有1.7kb的大小。每种引物的位置在图3中显示。
突变菌株M.succiniciproducens LK根据上述方法通过将M.succiniciproducens MBEL55E的基因组中的ldhA基因断裂而构建。
实施例3：用于断裂pta和ackA的基因交换载体(pPTA-sacB)的构建
为了通过同源重组断裂M.succinicproducens LK菌株的基因组中的pta和ackA基因，按照下列方式构建基因交换载体。将含有sacB基因作为模板的pKmobsacB使用在序列号：12和序列号：13中阐明的引物进行PCR。得到的sacB产物用PstI和BamHI酶切并插入到pUC19(StratageneCloning Systems.USA)中，从而构建pUC19-sacB(FIG.4)。
序列号：12：5′-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG
序列号：13：5′-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC
同时，以M.succiniciproducens LK的基因组DNA作为模板使用在序列号：14和序列号：15中阐明的引物进行PCR，将得到的含有pta-ackA同源区1的PCR片段用XbaI和BamHI酶切。另外，M.succiniciproducensLK的基因组DNA作为模板使用在序列号：16和序列号：17中阐明的引物进行PCR，将得到的含有pta-ackA同源区2的PCR片段用XbaI和SacI酶切。然后，将这些片段插入到pUC19的BamHI和SacI位点，从而构建pUC19-PTA12。
序列号：14：5′-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC
序列号：15：5′-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG
序列号：16：5′-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCATGTTTCC
序列号：17：5′-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC
为了将作为选择标记的抗-壮观霉素基因(GenBank X02588；SpR)插入到pUC19-PTA12中，将含有抗-壮观霉素基因(GenBank X02588)作为模板的质粒pIC156(Steinmetz等人，Gene，142：79，1994)使用在序列号：18和序列号：19中阐明的引物进行PCR，并且将得到的含有SpR基因的PCR片段用EcoRV酶切并引入到pUC19-PTA12中，从而构建具有抗-壮观霉素基因的pUC19-PTA1S2。将构建的pUC19-PTA1S2用SacI和BamHI酶切并引入到上述构建的pUC19-SacB中，从而构建交换载体(pPTA-sacB)用于断裂pta和ackA(图4)。
序列号：18：5’-GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC
序列号19：5’-CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC
实施例4：M.succiniciproducens PALK菌株的构建
通过使用在实施例3中构建的用于断裂磷酸转乙酰酶(pta)基因和醋酸激酶(ackA)基因的交换载体pPTA-sacB断裂M.succiniciproducensLK基因组中的pta和ackA基因(图4)。
换言之，将在实施例2中构建的M.succiniciproducens LK接种于含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖琼脂培养基中并在37℃下培养36小时。形成的菌落接种到10ml LB-葡萄糖液体培养基中，并培养12小时。将已经充分生长的1％的培养液接种到100ml LB-葡萄糖液体培养基中并在摇床中以200rpm在37℃下培养。
以与实施例2中描述的相同方式从得到的培养液中收集浓缩的细胞。将收集的浓缩细胞与在实施例3中构建的基因交换载体pPTA-sacB混合，然后通过在2.5kV、50μF和200欧姆条件下电穿孔将pPTA-sacB引入到M.succiniciproducens LK中。将800ml LB-葡萄糖液体培养基加入到引入了pPTA-sacB的菌株中，并在最高37℃下培养一个半小时。为了诱导双交换，将培养液接种到含有抗生素壮观霉素(终浓度为50μg/ml)的TSB-蔗糖固体培养基(含有100g/L蔗糖的Tryptic Soy Broth(Becton，Dickinson and Company)固体培养基)中，并在37℃下培养48小时或者更长。为了选择其中仅仅发生双交换的菌落，将形成的菌落分别在含有50μg/ml壮观霉素的TSB蔗糖培养基和含有50μg/ml氨苄青霉素的TSB琼脂培养基上划线，并在37℃下培养12小时。然后，选择在含有50μg/ml壮观霉素的TSB蔗糖培养基上形成但不在含有50μg/ml氨苄青霉素的TSB培养基上形成的菌落并再次在含有50μg/ml壮观霉素的TSB蔗糖培养基上划线。使用含有壮观霉素的培养基和氨苄青霉素的培养基再次筛选在这里形成的菌落，然后最终选择显示所要求的结果的菌落。分离的突变体基因组DNA作为模板通过PCR扩增，将PCR产物电泳以确认pta-ackA基因的断裂。
为了确认pta-ackA的断裂，以下列方式进行两次PCR。首选，以突变体基因组DNA作为模板使用在下面的序列号：20和序列号：21中阐明的引物进行PCR，然后将突变体基因组DNA作为模板使用在在下面的序列号：22和序列号：23中阐明的引物进行PCR。
序列号：20：
5’-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC(SP1)
序列号：21：
5′-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC(PAU1)
序列号：22：
5’-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG(SP2)
序列号：23：
5’-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG(PAD2)
将在两种PCRs中得到的产物进行凝胶电泳，通过它们的大小确认pta-ackA的断裂(图6)。pta-ackA的断裂通过下列事实确认：使用序列号：20和序列号：21(SP1引物和PAU1引物)得到的产物具有1.1kb的大小，同时使用序列号：22和序列号：23(SP2引物和PAD2引物)得到的产物的具有1.5kb的大小。每种引物的位置在图5中显示。
通过如上述方法从M.succiniciproducens LK的基因组中断裂pta-ackA构建的突变菌株，即通过从M.succiniciproducens的基因组中断裂ldhA，pta和ackA得到的突变菌株被命名为“M.succiniciproducensPALK”并在2006年7月26日以保藏号“KCTC 10973BP”保藏于作为国际保藏单位的韩国典型菌种保藏中心(KCTC；52，Eoeun-dong，Yuseong-gu，Daejeon-si，Republic of Korea)，韩国生命科学与生物技术研究所。
实施例5：使用M.succiniciproducens PALK生产同质琥珀酸
将在实施例4中构建的M.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)接种于含有5g/L葡萄糖的10ml合成培养基中，并在厌氧条件下39℃培养8小时，然后再次将它们转移到含5g/L葡萄糖的250ml合成培养基并在39℃下培养。此时将50μg/ml壮观霉素加入到培养基中作为抗生素。将250ml M.succiniciproducens PALK培养液接种到含有2.25L合成培养基(1g/L NaCl，2g/L(NH4)2HPO4，0.02g/L CaCl2·2H2O，0.2g/L MgCl2·6H2O，8.709g/L K2HPO4，0.5g/L半胱氨酸，0.5g/L甲硫氨酸，0.5g/L甘氨酸，0.5g/L天冬酰胺，0.5g/L天冬氨酸，0.5g/L脯氨酸(praline)，0.5g/L丝氨酸，0.005g/L烟酸，0.005g/L泛酸钙，0.005g/L维生素B6·HCl，0.005g/L维生素B1，0.005g/L维生素C，和0.005g/L生物素)的生物反应器中，并在39℃下在第一葡萄糖浓度18.2g/L(100mM)，第一甘油浓度9.2g/L(100mM)条件下进行发酵。在发酵过程中，通过使用氨水将培养物的pH调节到6.5，并将50μg/ml壮观霉素加入到培养基中作为抗生素。为了高浓度生产琥珀酸，当葡萄糖被完全耗尽时，通过加入浓缩的葡萄糖溶液将培养液的葡萄糖浓度调节到大约18.2g/L(100mM)。
将M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)和产琥珀酸突变菌株M.succiniciproducens LPK7(KCTC 10626BP)发酵，以上面描述的相同方式生产琥珀酸。
培养液中的细胞浓度使用分光光度计测定，然后使用现有测定的分光光度计的光吸收和用于细胞干重的验证试验进行计算。在发酵过程中，从生物反应器中有规律地收集样品。收集的样品以13000rpm离心10分钟，然后通过使用高效液相色谱将上清液用于分析有机酸、葡萄糖和甘油的浓度。结果，当本发明的M.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)与M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)和M.succiniciproducens LPK7(KCTC 10626BP)相比时，比M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)和M.succiniciproducensLPK7(KCTC 10626BP)显示了更高的琥珀酸产率同时更少产生或者不产生其他有机酸副产品(如图7和表2中所示)。虽然检测到了0.45g/L的醋酸和0.24g/L的丙酮酸，对本领域技术人员来说显而易见的是这些量对于细菌生长来说是产生的很少量的有机酸量，并且可以被忽略，因为与产生的琥珀酸相比它们产生的量不到其1wt％。
表2
M.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)的琥珀酸产率
菌株 MBEL55E (KCTC0769BP) LPK7 (KCTC10626BP) PALK (KCTC10973BP) 琥珀酸的终浓度 (g/L) 10.49 13.40 45.79 葡萄糖消耗(g/L) 22.50 19.98 53.00 琥珀酸产率(琥珀 酸g/葡萄糖g) 0.47 0.67 0.86
与野生型相比琥珀 酸的增加率 (MBEL55E)(％) 42.55 82.98 醋酸终浓度(g/L) 4.96 0.53 0.45 乳酸终浓度(g/L) 3.47 0.27 0.00 丙酮酸终浓度(g/L) 0.00 2.47 0.24 细胞特定生长率 (1/h) 0.81 0.30 0.69
工业实用性
如同上面详细描述的那样，本发明提供了具有高生长率的产琥珀酸的突变微生物，其在厌氧条件下培养过程中产生高浓度的琥珀酸同时很少产生或者不产生其他有机酸，并提供了使用突变微生物生产琥珀酸的方法。与现有的产琥珀酸菌株相比，本发明的突变微生物具有高生长率和琥珀酸产率同时很少产生或者不产生有机酸的能力。因此，本发明的突变微生物对于生产琥珀酸的工业应用来说是有用的。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是该描述仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同物限定。
【序列表】
随附电子版序列表。
【序列表】
<110>韩国科学技术院
<120>新的产生同质琥珀酸的工程微生物以及使用这些微生物制备同质琥珀酸的方法
<130>FP09KR769
<140>PCT/KR2007/003574
<141>2007-07-25
<150>10-2006-0071666
<151>2006-07-28
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<170>PatentIn version 3.2
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