由GRAS表达的食品级嗜热性阿拉伯糖异构酶以及使用其制备塔格糖的方法 【技术领域】
本发明涉及一种嗜热性阿拉伯糖异构酶和使用其制备塔格糖的方法，更准确地，涉及来自嗜热脂肪土芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)DSM22的编码阿拉伯糖异构酶的基因，含有该基因的重组表达载体，由从所述表达载体转化的重组GRAS(通常认为是安全的，Generally Recognized As Safe)菌株制备食品级嗜热性阿拉伯糖异构酶的方法，以及通过使用所述酶由半乳糖制备塔格糖的方法。
背景技术
随着对舒适或者健康生活的兴趣日益增加，塔格糖已经被建议作为糖的替代物，因为其具有更小的副作用，并且糖是引起各种成人疾病的主要因素之一。塔格糖是半乳糖的异构体并且已知具有与果糖类似的生理化学性质。塔格糖是天然的低热量糖，并且近来已经由美国FDA认证为GRAS(Generally Recognized As Safe)，于是目前其被允许作为加甜剂被加入到食品、饮料、保健品、饮食添加剂等中。
GRAS表示通常被认可为安全的物质，所述安全由具有足够经验和技能的专业人员通过科学程序并在指示条件和使用目的下检查来进行判断。GRAS是仅在美国使用来评估食品和食品化学物质的安全性(在一定条件下)的独特系统，但其在世界范围内被认可。
塔格糖还能通过半乳糖的异构化来生产，该异构化为使用催化剂制造异构体的化学方法，或者使用异构酶对半乳糖进行酶转化的生物学方法来生产。
本领域技术人员公知的一种生物学方法是使用酶将醛糖或醛糖衍生物转化成酮糖或酮糖衍生物。使用阿拉伯糖异构酶将半乳糖异构化成塔格糖一般在高温下通过热动力学来进行，并表现出成比例的高转化率。因此，开发可在高温下具有稳定作用的酶和使用其制备塔格糖的方法对于基于使用异构酶进行塔格糖的生物转化的工业应用来说是关键技术。通过筛选源自嗜热性菌的阿拉伯糖异构酶，来尝试获得工业上可应用的嗜热性异构酶，并且已经由许多研究团队付出了许多努力使用这种方法来建立异构化工艺。
在韩国，使用阿拉伯糖异构酶的酶异构化方法已经由Tong YangConfectionery Corp开发。根据该方法，来自大肠杆菌的阿拉伯糖异构酶在大肠杆菌中通过重组技术大量表达。将该重组异构酶在30℃下反应24小时，使半乳糖转化成塔格糖，此时转化率为25％，表明热稳定性和转化产量两者都非常低(申请号为99-16118的韩国专利申请)。Oh，Deok-keun教授和他的同事们(Sejong大学)通过重组技术成功地在大肠杆菌中实现了来自嗜热脂肪土芽胞杆菌的阿拉伯糖异构酶的表达，并基于此他们提出了在高温下将半乳糖转化成塔格糖的异构化过程。TongYang Confectionery Corp的研究组通过筛选嗜热性微生物文库从温泉区域分离嗜热性微生物，然后在重组大肠杆菌宿主中以活性形式对其进行表达，以便将半乳糖用于高温异构化过程。类似地，CheBiGen Inc.也在大肠杆菌中生产了来自Geobacillus dinitrificans DBG-Al的嗜热性异构酶，并使用该酶通过固定化开发了生产塔格糖的技术。
来源于土芽胞杆菌(Geobacillus)微生物的异构酶的表达水平太低而不能在工业中应用。使用源自嗜热性菌阿拉伯糖异构酶的塔格糖生产仍依赖于使用在重组大肠杆菌中重组酶的大量表达或者使用含有重组酶的宿主将半乳糖异构化成塔格糖的方法。大肠杆菌对于作为食品原料的塔格糖的生产来说是不合适的。为了生产作为食品添加剂的塔格糖，在该宿主中表达阿拉伯糖异构酶是必须的，该宿主为GRAS微生物并适于大量生产。
对于重组酶生产来说可工业应用的GRAS微生物可选自由芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和乳杆菌属(Lactobacillus sp.)组成的组。很容易操纵芽孢杆菌属和棒状杆菌属菌株用于工业化和大量培养，并且它们在各种条件下高度稳定。事实上，在GRAS微生物中，绝大多数芽孢杆菌属和棒状杆菌属菌株已经被用作用于重组酶生产的宿主。
本发明的发明人成功地在GRAS微生物诸如芽孢杆菌属和棒状杆菌属菌株中以活性形式表达了来源于土芽胞杆菌的嗜热性阿拉伯糖异构酶。本发明的发明人通过使用所述表达的GRAS重组酶进一步建立了将高浓度半乳糖诱导异构化成塔格糖的方法。
【发明内容】
技术问题
本发明的目地在于由GRAS微生物表达来源于嗜热性菌作为活性形式的阿拉伯糖异构酶，并提供通过半乳糖异构化制备食品级塔格糖的方法。
技术方案
本发明的上述和其他目的通过本发明的下列实施方式来实现。
为了实现上述目的，本发明的发明人通过将源自嗜热性脂肪土芽胞杆菌的嗜热性阿拉伯糖异构酶基因引入到GRAS微生物中生产了食品级重组酶，并由此从半乳糖生产了塔格糖。
此后，将详细描述本发明。
本发明的GRAS(Generally Recognized As Safe)微生物优选包括芽孢杆菌属和棒状杆菌属菌株，并且谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)KCTC 13032和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168是更优选的。
本发明的阿拉伯糖异构酶基因优选来源于嗜热性菌，更优选来源于脂肪土芽胞杆菌DSM22。
本发明的阿拉伯糖异构酶基因可由本领域技术人员使用任何常规基因突变方法来修饰，诸如定向进化和定点基因突变。因此，与GRAS宿主具有一定同源水平的任何宿主细胞，例如与GRAS宿主具有至少70％的同源性，但优选至少为80％，更优选至少为90％，和在宿主细胞中以活性形式表达的重组酶和含有该酶的任何宿主细胞都包括在本发明的标准内。
本发明的实施例还提供了含有编码本发明的阿拉伯糖异构酶的基因的载体。本发明的载体是用于克隆或表达的典型载体。载体不限于特定载体，并且本领域技术人员已知的任何载体都是可接受的。
在本发明中，在芽孢杆菌(Bacillus)和棒状杆菌(Corynebacterium)中具有活性的启动子被用作载体来表达活性形式的嗜热性异构酶。
在棒状杆菌中用于基因表达的启动子序列不像工业微生物诸如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌中使用的其他启动子那样已被鉴定。这里，来自棒状杆菌这种流行的工业微生物的并能够在大肠杆菌中表达的强启动子已经被开发。tac启动子已知为最强的启动子之一。tac启动子通过将大肠杆菌的色氨酸操纵子启动子的-35区与大肠杆菌的乳糖操纵子启动子的-10区序列融合来制备。在本发明中由CJ-1组成的启动子被认为在棒状杆菌属细菌细胞中表达目标基因比tac启动子更为有效(韩国专利公开10-2006-0068505)。
本发明的芽孢杆菌启动子不仅在芽孢杆菌属微生物中显示了启动子活性，而且在乳杆菌属微生物诸如乳酸菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)中也显示了启动子活性。棒状杆菌启动子还在棒状杆菌属和大肠杆菌属(Escherichia sp.)以及大肠杆菌细胞中都显示启动子活性。特别是，本发明的启动子在大肠杆菌细菌细胞中显示了比tac启动子的活性至少高两倍的活性。
根据本发明，重组菌株通过使用载体转化芽孢杆菌和棒状杆菌来制备，转化菌株然后被培养以提供食品级阿拉伯糖异构酶。培养基和培养条件取决于宿主的种类。
根据本发明，塔格糖可通过使用重组阿拉伯糖异构酶由半乳糖来制备。
【附图说明】
本发明的优选实施例的应用参照附图被最佳理解，在附图中：
图1是示出含有来自嗜热脂肪土芽胞杆菌DSM 22菌株的嗜热性阿拉伯糖异构酶的基因的重组表达载体pHT01-GSAl的构建的示意性图示，
图2是示出含有来自嗜热脂肪土芽胞杆菌DSM 22菌株的嗜热性阿拉伯糖异构酶的基因的重组表达载体pCJ-1-GSAI的构建的示意性图示，
图3是示出在重组芽孢杆菌宿主细胞中产生的嗜热性阿拉伯糖异构酶的酶活性的图表。A表示仅在宿主细胞(枯草芽孢杆菌168)培养物的粗酶溶液中测定的酶活性，B表示在含有穿梭载体的重组宿主细胞(GSAIB-1)中测定的酶活性，所述穿梭载体含有(harboring)阿拉伯糖异构酶基因，
图4是示出用于重组菌株GSAIB-1的表达的最佳条件和用于酶活性的最佳条件的图表，
图5是示出在最佳培养基中重组菌株GSAIC-1的生长的图表。
【具体实施方式】
本发明的实际和现有优选实施例如在下列例子中显示的那样被示出。
但是，本领域技术人员应当理解，在考虑公开内容的基础上，可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例
在本发明的优选实施例中来自超嗜热脂肪土芽胞杆菌DSM 22的编码嗜热性阿拉伯糖异构酶的基因被插入到pCJ-1(大肠杆菌-棒状杆菌穿梭载体，韩国专利公开10-2006-0068505)和pHT10(大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体，Mo Bi Tech.，Goettingen，德国)。谷氨酸棒杆菌KCTC 13032和枯草芽孢杆菌168用上述载体转染，其中所述蛋白质最终被过表达。重组菌株谷氨酸棒杆菌GSAIC-1和枯草芽孢杆菌GSAIB-1被培养并且从细胞培养物的每个阶段得到细胞抽提物。塔格糖的生产活性通过测定活性重组蛋白的量逐阶段被测定。最佳表达的合成培养物被分离并通过细胞裂解、热处理、离子交换树脂和凝胶色谱纯化。最后，氨基末端的氨基酸序列被检查并且通过测定蛋白质的活性来确认塔格糖的生产活性。
实施例1：阿拉伯糖异构酶的克隆
在需氧条件下培养嗜热脂肪土芽胞杆菌DSM 22。在8000xg下离心10分钟以回收培养的细胞。通过使用细胞培养物DNA Midi Kit(Qiagen，美国)从得到的细胞提取基因组DNA。通过使用具有Xbal和BamHi限制酶位点序列插入的寡核苷酸5′-TCTAGAATGATGCTGTCATTACGTCCTTATGAATTTTG-S′(SEQ.ID.NO：1)和5′-TCTAGATTACCGCCCCCGCCAAAACACTTCGTTCC-S′(SEQ.ID.NO：2)作为引物，使用基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)。PCR产物1通过从嗜热脂肪土芽胞杆菌扩增含有阿拉伯糖异构酶基因的1494bp的DNA得到。再次通过使用具有EcoRV和PstI限制酶位点序列插入的寡核苷酸5′-CCCGAT ATCATGCTGT-CATT ACGTCCTTATG-S′(SEQ.ID.NO：3)和5′-TGCACTGCAGTTACCGCCCCCG CCAAAACAC-3′(SEQ.ID.NO：4)作为引物，使用基因组DNA再次进行PCR。PCR产物2通过从嗜热脂肪土芽胞杆菌扩增含有阿拉伯糖异构酶基因的1512bp的DNA得到。为了过表达由上述两个扩增基因编码的阿拉伯糖异构酶，来自芽孢杆菌属的穿梭载体pHT01和来自棒状杆菌属的穿梭载体pCJ-1被使用。穿梭载体pHT01被引入到大肠杆菌DH5α，其于2004年11月6日被保藏在国际保藏单位(IDA)Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(保藏号：KCCM-10611)。穿梭载体pHT01得自Mo Bi Tech Cb.(PBS001)(表1)。
表1
载体 启动子 载体 保藏/分配号 源自蛋白质 pCJ-1 Pcj1 pECCG117 KCCM-10611 热休克蛋白hsp60 pHT01 Pgrac - PBS001 -
将由限制酶XbaI和BamHI消化的PCR产物1插入到由相同酶消化的穿梭载体pHT01中，导致重组表达载体pHT01-GSAI的构建(见图1)。将由限制酶EcoRV和Pstl消化的PCR产物2插入到由相同酶消化的穿梭载体pCJ-1中，导致重组表达载体pCJ-1-GSAI的构建(见图2)。谷氨酸棒杆菌KCTC 13032和枯草芽孢杆菌168使用重组表达载体pHT01-GSAl和pCJ-1-GSAl转染以制备重组菌株，它们被命名为谷氨酸棒杆菌GSAIC-1和′枯草芽孢杆菌GSAlB-1′。重组菌株于2006年10月18日被保藏在地址为#361-221，Hongje 1-Dong，Seodaemun-Gu，Seoul，Korea的国际保藏单位(IDA)Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(保藏号：KCCM10789P和KCCM10788P)。
实施例2：阿拉伯糖异构酶在芽孢杆菌中的表达
在上述实施例1中制备的重组菌株枯草芽孢杆菌GSAlB-1(保藏号：KCCM10788P)被接种在含有20μg/mL的氯霉素的LB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中，接着在37℃下230rpm摇瓶培养12小时。产生预培养液。然后将预培养液接种到具有浓度为0.1％的相同成分的主培养基中，接着在37℃下230rpm摇瓶培养直到OD600达到1，以诱导重组阿拉伯糖异构酶的表达。为了测定所表达的阿拉伯糖异构酶的酶活性，培养物溶液在12000xg下离心10分钟，并回收细胞。细胞被悬浮在50mM Tris-HCl(pH8.2)缓冲液中，接着超声(170瓦，以1秒/2分钟的间隔在冰上冷却)裂解细胞。在12000xg下再次离心12分钟，使用上清液作为粗酶溶液诱导半乳糖的异构化。
半乳糖的异构化，使用25μl 100mM的半乳糖和100μl的粗酶溶液的混合物作为底物在60℃下进行1小时。为了测定半乳糖异构化的活性，将含有40mM的100μl的粗酶溶液作为底物与1ml的反应缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.0)混合，接着在65℃下反应20分钟。此时，将5mM MgCl2和1mM MnCl2加入到反应混合物中。异构酶的活性通过半胱氨酸-咔唑-硫酸法(Dische，Z.和E.Borenfreund.，A New Spectrophotometric Methodfor the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses，J.Biol.Chem.，192：583-587，195)测定。粗酶溶液中含有的蛋白质使用Bradford测定试剂盒(Biorad，美国)定量。结果，异构酶活性为0.2045±0.0078(mg-塔格糖/mg-蛋白质·h)，表明半乳糖异构化产物塔格糖成功产出(图3)。
为了提供用于根据每种培养液的成分的酶表达的最佳条件，通常被用于芽孢杆菌培养的MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨10g/L)和LB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)被用作基本培养基。将重组菌株GSAIB-1接种在含有浓度为20μg/ml的氯霉素的LB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中，接着在摇床中37℃下230rpm摇瓶培养12小时。该培养液被用作预培养液。将预培养液接种到含有10g/L碳源(果糖，葡萄糖，琥珀酸盐，山梨醇或者蔗糖)的LB培养基和浓度为0.1％的MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨10g/L)中，接着在37℃下230rpm摇瓶培养直到OD600达到1，OD600达到1表明重组阿拉伯糖异构酶的表达被诱导。在MB培养基中酶的表达水平比在LB培养基中低30％。根据加入的不同碳源的蛋白质表达模式也被研究，工业上可接受的碳源诸如分别为10g/L的葡萄糖、果糖、琥珀酸盐、山梨醇和蔗糖加入到LB培养基中用于该研究。酶的表达水平被研究。结果，酶表达随着琥珀酸盐或山梨醇的加入而略微增加(图4)。
实施例3：在棒状杆菌中表达重组阿拉伯糖异构酶
在上述实施例1中制备的重组菌株谷氨酸棒杆菌GSAIC-1(保藏号：KCCM10789P)被接种在含有10μg/mL的卡那霉素的MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨5g/L)中，接着在30℃下200rpm摇瓶培养24小时以制备预培养溶液。将得到的预培养液接种到具有浓度为1％的主培养基中，接着在30℃下200rpm摇瓶培养直到OD600达到0.1，以诱导重组阿拉伯糖异构酶的表达。为了测定所表达的阿拉伯糖异构酶的酶活性，培养物溶液在8000xg下离心10分钟，并回收细胞。细胞被悬浮在50mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液中，接着超声裂解细胞。在8000xg下再次离心12分钟，使用上清液作为粗酶溶液诱导半乳糖的异构化。包含在粗酶溶液中的蛋白质使用使用Bradford测定试剂盒(Biorad，美国)定量。结果，异构酶活性为1.387(mg-塔格糖/mg-蛋白质·h)，表明半乳糖异构化产物塔格糖成功地被生产。
为了优化阿拉伯糖异构酶在重组菌株棒状杆菌GSAIC-1中的表达，将重组菌株接种到含有10μg/mL的浓度为OD600＝0.6的的卡那霉素的MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨5g/L)中。棒状杆菌菌株在两种基本培养基，即MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨5g/L)和改良培养基(Bacto-蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 2.5g/L，牛肉膏5g/L)中的生长被研究。比较了两种培养基中的温度依赖型(25℃ 30℃，37℃)、pH依赖型、葡萄糖(碳源)和蔗糖浓度依赖型生长。另外，在平稳性条件和需氧条件下的生长也进行了比较。在各种条件下的生长和酶的表达的水平由此每小时被测定以判断用于重组阿拉伯糖异构酶的大量生长的最佳表达条件(表2和表3)。
表2
表3
为了测定重组阿拉伯糖异构酶的酶活性，酶以实施例2中描述的相同方式被处理并定量。当细胞在30℃在需氧条件下加入2.5％的蔗糖培养时，塔格糖显示大约为57.0mU/ml的酶活性，比在标准培养物中观察到的(31.6mU/ml)高1.8倍，表明酶活性随着细胞生长的增加而增加。在最佳培养基中得到的细胞生长在图5中显示。
实施例4：重组阿拉伯糖异构酶的分离和纯化
2L重组菌株的培养在上述实施例3中确定的最佳培养条件下进行。将培养液在8000xg下离心10分钟并回收细胞。将细胞悬浮在50mMTris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，并用于蛋白质纯化。使用高压细胞匀浆器T-series(4.0kW；Constant systems，英国)将细胞悬浮物进行裂解，然后在80℃下热处理20分钟。在10000xg下离心10分钟以分离表达的重组嗜热性阿拉伯糖异构酶。分离的重组酶溶液通过超过滤(MW：10,000；Sartorius，美国)纯化。过滤物被用于随后的实验。
工业实用性
如此前解释的那样，在本发明中来自嗜热性微生物土芽胞杆菌的阿拉伯糖异构酶成功并稳地在GRAS微生物棒状杆菌属菌株和芽孢杆菌属菌株中被表达。因此，本发明提供了活性重组酶和制备塔格糖的方法，所述方法包括使用重组酶有效固定的连续反应步骤。其对于食物添加剂来说本质上是安全的，特别是在使用微生物酶的生物技术食品的生产过程中。根据本发明，来源于土芽胞杆菌属菌株的阿拉伯糖异构酶被确认是安全的食品级的，于是其能够被表达并连续应用到工业生产。
本领域技术人员将会理解，前述说明书中公开的构思和特定实施例可以很容易作为基础被利用以便修改或重新设计其他实施例来实现本发明的相同目的。本领域技术人员还将会理解，这些等同实施例都不偏离在所附的权利要求数中阐明的本发明的精神和范围。
【序列表】
<110>CJ第一制糖株式会社
<120>由GRAS表达的食品级嗜热性阿拉伯糖异构酶以及
使用其制备塔格糖的方法
<130>FP09KR816
<160>4
<170>Kopatent In 1.71
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 1
<400>1
tctagaatga tgctgtcatt acgtccttat gaattttg 38
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 2
<400>2
tctagattac cgcccccgcc aaaacacttc gttcc 35
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 3
<400>3
cccgatatca tgctgtcatt acgtccttatg 31
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 4
<400>4
tgcactgcag ttaccgcccc cgccaaaaca c 31