一种纤细裸藻的培养基及其开放式高密度养殖方法 【技术领域】
本发明涉及一种养殖纤细裸藻的培养基以及开放式高密度养殖纤细裸藻的方法。
背景技术
纤细裸藻(Euglena gracilis)属裸藻门，为淡水性的单细胞真核生物，细胞裸露无壁，呈纺锤形，长35-66μm，宽8-18μm，有8-28个片状或圆盘状的色素体，1根鞭毛，约为体长的0.15-1倍，眼点明显。纤细裸藻蛋白质的氨基酸组成是比较平衡的，其中水产动物所必需的10种氨基酸含量占其总氨基酸含量的50％左右，并且富含高级不饱和脂肪酸和基础脂肪酸，是海淡水生物的优质饵料。其次，纤细裸藻还能用来生产维生素C、维生素E和β-胡萝卜素等高附加值产品。另外，纤细裸藻由于生长迅速，能耐受酸性环境，在pH3.5时生长良好，可耐受高浓度的CO2，因此，可作为吸收工业排放CO2纤细裸藻资源进行开发培养。
通常情况下，纤细裸藻的培养方法有自养培养和异养培养两种。自养培养生长速度缓慢，不利于高生物量的积累。异养培养目前多采用Euglena人工培养基，其中含有酵母浸膏、牛肉膏和蛋白胨等有机营养物质，虽然在该培养基中纤细裸藻生长速度较快，但在开放培养时极易受到细菌等微生物污染，难以实现工业化生产。
【发明内容】
为了提高纤细裸藻的细胞密度和生长速度，防止纤细裸藻在开放培养过程中受到细菌等微生物的污染而造成环境污染，本发明提供了一种添加不同种类的无机营养物质，特别是加入氯化铵和尿素的混合物等营养成分，在开放培养过程中，通入一定浓度的CO2气体，为纤细裸藻生长提供无机碳源，达到异养培养时的细胞数目积累水平，来实现开放式高密度养殖。
本发明的第一个目的是提供一种能使纤细裸藻快速生长的培养基。
本发明的第二个目的是提供一种应用本发明所提供的培养基培养纤细裸藻的方法。
本发明提供的能使纤细裸藻快速生长的培养基，主要包括氮源和磷源，以及少量的无机盐、微量元素、维生素和水。其中氮源为氯化铵和尿素的混合物，磷源可以为磷酸二氢钾，无机盐可以为铁盐、钠盐、钙盐、镁盐的一种或几种，微量元素可以为氯化锰、硫酸钴、硫酸锌、钼酸钠和硫酸铜中的一种或几种，本发明所述的培养基还可以根据不同的用途添加其他有益营养成分。
本发明所提供的纤细裸藻培养基命名为EM，其配方包括：
氯化铵 0.2～1.6g/L 尿素 30～120mg/L
磷酸二氢钾 0.4～1.5g/L 硫酸镁 0.2～0.8g/L
氯化钙 0.01～0.05g/L 柠檬酸钠 0～1.0g/L
硫酸铁 3～30mg/L 维生素B1 0.1～3mg/L
微量元素 0.5～2ml/L 维生素B12 0.5～25μg/L
乙二胺四乙酸二钠 0.1～5mg/L。
其中微量元素的配制方法为：
氯化锰 1.4～1.8g 硫酸钴 0.3～1.6g
硫酸锌 0.3～0.5g 钼酸钠 0.1～0.4g
硫酸铜 0.01～0.4g 加蒸馏水定容1L。
本发明所提供的纤细裸藻培养基，较好的配方包括：
氯化铵 0.5～1.4g/L 尿素 30～90mg/L
磷酸二氢钾 0.8～1.3g/L 硫酸镁 0.4～0.6g/L
氯化钙 0.02～0.04g/L 柠檬酸钠 0～0.8g/L
硫酸铁 10～25mg/L 维生素B1 0.5～2mg/L
微量元素 0.5～2ml/L 维生素B12 2～15μg/L
乙二胺四乙酸二钠 1～3mg/L。
其中微量元素的配制方法为：
氯化锰 1.5～1.6g 硫酸钴 0.6～1.2g
硫酸锌 0.3～0.5g 钼酸钠 0.2～0.3g
硫酸铜 0.05～0.2g 加蒸馏水定容1L。
若非特指，本发明培养基配方中所述的化学成分，均为分析纯的市售商品。
应用本发明所提供的EM培养基养殖纤细裸藻的方法，包括如下步骤：1、配制EM培养基；2、按纤细裸藻与培养基体积比为1∶4～1∶10的比例将纤细裸藻接种到培养基中，以0.5-1.5L/min的流量通入浓度为5～20％的CO2，在温度为22～27℃，光照强度为5000-30000LUX，光照时间为10-14小时/天，培养6～9天即可达到培养终点。
应用EM培养基养殖纤细裸藻的方法，较好的培养条件为：按纤细裸藻与培养基体积比为1∶6～1∶9的比例将纤细裸藻接种到培养基中，以0.8-1.3L/min的流量通入浓度为15～20％的CO2，在温度为24-26℃，光照强度为13000-25000LUX，光照时间为11-13小时/天，培养6～8天即可达到培养终点。
应用EM培养基养殖纤细裸藻的方法，最佳培养条件为：按纤细裸藻与培养基体积比为1∶8的比例将纤细裸藻接种到培养基中，以1.2L/min通入浓度为18％的CO2，在温度为25-26℃，光照强度为15000-20000LUX，光照时间为12小时/天，培养7天即可达到培养终点。
本发明所提供的纤细裸藻的培养基及培养方法，由于加入了特别适用于纤细裸藻繁殖的氯化铵和尿素的混合物，既克服了现有技术中养殖纤细裸藻易受微生物、细菌污染而给环境带来污染等缺陷，又可使纤细裸藻在不添加有机碳源的情况下，快速利用培养基的营养成分，促使细胞加速分裂，生长周期比传统培养基缩短了2～5天，而且非常有利于纤细裸藻生物量的积累，用本发明所述地培养基养殖的纤细裸藻的生物量的积累比使用传统培养基高1～1.5倍。本发明提供的培养基还去除了传统异养培养基中的有机碳源，以通入CO2的形式补充碳源，既能有效达到避免微生物污染的目的，又能增加纤细裸藻吸收CO2的能力，在大规模生产养殖纤细裸藻的过程中，吸收大量的工业生产过程所产生的CO2废气，对节能减排、保护环境具有重要的意义。
【附图说明】
图1为纤细裸藻不同培养基中培养的生长曲线。□：EM培养基；△：Euglena培养基；
图2为纤细裸藻在不同氮源含量的EM培养基中培养的生长曲线。A、B、C、D、E、F和G分别代表添加CO(NH2)2 0、20、40、60、80、100和120mg/L。
图3为纤细裸藻在400L光生物反应器系统中，用完整的EM培养基培养，通入18％CO2培养条件下的细胞数目增长曲线和干重增长曲线。
图4为纤细裸藻在400L光生物反应器系统，用简化的EM培养基中培养，通入5％CO2培养条件下的细胞数目增长曲线和干重增长曲线。
图5为纤细裸藻在400L光生物反应器系统中，用EM培养基培养，通入10％CO2培养条件下的细胞数目增长曲线和干重增长曲线。
图6为纤细裸藻在400L光生物反应器系统中，用EM培养基培养，通入15％CO2培养条件下的细胞数目增长曲线和干重增长曲线。
【具体实施方式】
实施例1
1、EM培养基的配方如下：
氯化铵 0.8g/L 尿素 60mg/L
磷酸氢二钾 1.0g/L 硫酸镁 0.2g/L
氯化钙 0.02g/L 硫酸铁 3mg/L
乙二胺四乙酸二钠 0.48mg/L
微量元素1ml/L，其中微量元素的配制方法为：取氯化锰1.8g、硫酸钴1.5g、硫酸锌0.4g、钼酸钠0.2g、硫酸铜0.02g，加蒸馏水定容至1L。
维生素B1 0.1mg/L 维生素B12 0.5μg/L
将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，用盐酸调整pH至3.5，121℃高压灭菌20min。
在250ml摇瓶中加入100ml EM培养基，接种浓度为5×105个细胞/毫升，在温度25℃、光∶暗＝12∶12、光强5000LUX，摇床转速150r/min等条件下进行培养。经7天培养，纤细裸藻的最大生物量能达3.6×107个细胞/毫升(见图1)。
2、Euglena培养基配方如下：
乙酸钠 1g/L
牛肉浸膏 1g/L
蛋白胨 2g/L
酵母提取物 2g/L
氯化钙 0.01g/L
将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，用盐酸调pH至3.5，121℃高压灭菌20min。在250ml摇瓶中加入100ml Euglena培养基，接种浓度为5×105个细胞/毫升，在温度25℃、光∶暗＝12∶12、光强5000LUX，摇床转速150r/min等条件下进行培养。培养7天后，纤细裸藻的最大生物量能达2.4×107个细胞/毫升(见图1)。
根据上述两种培养基培养纤细裸藻的结果可以得知，使用本发明所提供的EM培养基，能使纤细裸藻在光自养条件下，生长周期比传统培养基缩短了2～5天，并且其生物量的积累比使用传统异养培养基高1～1.5倍。克服了传统光自养培养基培养纤细裸藻生长缓慢和生物量极低等缺点。用EM培养基可以获得比使用传统光自养培养5倍以上的纤细裸藻生物量。
本发明所提供的EM培养基与Euglena异养培养基相比，其配方中不含有牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏等有机营养物质，在大规模开放培养时，不易受细菌等的微生物的侵染，但也能积累较高的生物量，达到高密度培养的效果。
实施例2
EM培养基配方如下：
氯化铵 0.2g/L
尿素分别为0、20、40、60、80、100和120mg/L
磷酸氢二钾 1.2g/L 硫酸镁 0.2g/L
氯化钙 0.02g/L 硫酸铁 3mg/L
乙二胺四乙酸二钠 0.48mg/L
微量元素0.5ml/L，其中微量元素的配制方法为：取
氯化锰1.8g、硫酸钴1.6g、硫酸锌0.5g、钼酸钠0.2g、硫酸铜0.02g，加蒸馏水定容至1L。
维生素B1 0.25mg/L 维生素B12 20μg/L
将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，用盐酸调pH至3.5，121℃高压灭菌20min。在250ml摇瓶中加入100ml的EM培养基，其中CO(NH2)2的初始浓度分别为0、20、40、60、80、100和120mg/L，接种浓度为4.5×105个细胞/毫升，在温度25℃、光周期为12∶12、光强5000lux，摇床转速150r/min条件下进行培养。细胞增长情况如图2所示，图中A、B、C、D、E、F、G、H和I分别代表添加CO(NH2)2量分别为0、20、40、60、80、100和120mg/L的生长情况。其中，在不含尿素和含有较高浓度尿素(120mg/L)的培养基中，该纤细裸藻生长较缓慢，生物量也较低，培养7天后，只能达到0.9×107和1.2×107个细胞/毫升。但随着添加的尿素量的增加，纤细裸藻的生长较迅速，当培养基中的尿素含量达60mg/L时，纤细裸藻生长最快，3天即进入对数生长期，经7天培养后，纤细裸藻的最大生物量达2.63×107个细胞/毫升。但随着尿素量的进一步增加(＞60mg/L)，纤细裸藻的生长反而变得缓慢。可见，添加适当的尿素(以60mg/L为佳)能大大促进纤细裸藻生物量的积累，但过量的尿素也会抑制纤细裸藻的生长。
实施例3
EM培养基的配方如下：
氯化铵 1.6g/L 尿素 60mg/L
磷酸氢二钾 1.5g/L 硫酸镁 0.4g/L
氯化钙 0.02g/L 硫酸铁 10mg/L
乙二胺四乙酸二钠 5mg/L
微量元素1.5ml/L，其中微量元素的配方为：氯化锰1.8g、硫酸钴1.5g、硫酸锌0.4g、钼酸钠0.2g、硫酸铜0.02g
维生素B1 3mg/L 维生素B12 25μg/L；
在400L生物光反应器系统中，加入EM培养基，装液量为90％，接种藻种密度为2×105个细胞/毫升，以0.6-1L/min的流量通入浓度为18％的CO2气体，使系统pH控制在3～5，温度控制在25℃，光照控制在18000-30000LUX，光照时间控制在12小时/天。结果表明，纤细裸藻在该光生物反应器系统中生长良好。培养第3天即进入指数生长期，第6天时，达到最大细胞密度，为3.83×107个细胞/毫升(见图3)，干重为2.65g/L(见图3)。
实施例4
EM培养基的配方如下：
氯化铵 1.6g/L 尿素 60mg/L
磷酸氢二钾 1.5g/L 硫酸镁 0.4g/L
氯化钙 0.04g/L 硫酸铁 30mg/L
氯化锰 1.5mg/L 维生素B12 25μg/L；
在400L生物光反应器系统中，加入EM培养基，装液量为80％，接种藻种密度为3×105个细胞/毫升，以1-1.5L/mi n的流量通入浓度为5％的CO2气体，使系统pH控制在3～5，温度控制在25℃，光照控制在10000-30000LUX，光照时间控制在11小时/天。培养第5天进入指数生长期，第8天时，达到最大细胞密度，为2.53×107个细胞/毫升(见图4)，干重为1.75g/L(见图4)。
实施例5
EM培养基的配方如下：
氯化铵 1.0g/L 尿素 60mg/L
磷酸二氢钾 0.5g/L 硫酸镁 0.8g/L
氯化钙 0.01g/L 柠檬酸钠 1.0g/L
硫酸铁 15mg/L 维生素B1 1mg/L
微量元素 1.8ml/L 维生素B12 0.5μg/L
乙二胺四乙酸二钠 5mg/L。
其中微量元素的配制方法为：
氯化锰 1.5g 硫酸钴 0.4g
硫酸锌 0.4g 钼酸钠 0.2g
硫酸铜 0.02g 加蒸馏水定容至1L。
在400L生物光反应器系统中，加入EM培养基，装液量为75％，接种藻种密度为5×105个细胞/毫升，以0.8-1.2L/min的流量通入浓度为10％的CO2气体，使系统pH控制在3.5～4，温度控制在23℃-26℃，光照控制在6000-20000LUX，光照时间控制在13小时/天。培养第4天进入指数生长期，第7天时，达到最大细胞密度，为3.53×107个细胞/毫升(见图5)，干重为2.47g/L(见图5)。
实施例6
EM培养基的配方如下：
氯化铵 1.4g/L 尿素 60mg/L
磷酸氢二钾 0.6g/L 硫酸镁 0.6g/L
氯化钙 0.05g/L 柠檬酸钠 0.2g/L
硫酸铁 20mg/L 乙二胺四乙酸二钠 2.5mg/L
微量元素 1.2ml/L 维生素B12 25μg/L。
其中微量元素配制方法如下：
氯化锰 1.5g 硫酸钴 0.8g
硫酸锌 0.4g 钼酸钠 0.4g
硫酸铜 0.3g
加蒸馏水定容至1L。
在400L生物光反应器系统中，加入EM培养基，装液量为85％，接种藻种密度为9×105个细胞/毫升，以0.9-1.4L/min的流量通入浓度为15％的CO2气体，使系统pH控制在3～4，温度控制在24℃，光照控制在8000-15000LUX，光照时间控制在14小时/天。培养第3天进入指数生长期，第6天时，达到最大细胞密度，为4.53×107个细胞/毫升(见图6)，干重为3.13g/L(见图6)。