一种树枝状有机荧光染料生物探针及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及化学及生物技术交叉领域，特别是一种树枝状荧光染料生物探针及制备方法。
背景技术
众所周知，癌症已成为威胁人类健康的第一杀手，如何有效地控制其发生和发展已成为当务之急。多数学者认为，在肿瘤的防治中，肿瘤得到二级预防，即早查、早诊、早治将是未来相当长时期实体瘤获得大幅度提高疗效的方向。由于分子生物标记具有价廉、安全、准确等优点，在医学早期诊断方面越来越受到人们的关注。目前该技术已在癌症和艾滋病的识别方面有较好的应用。
生物荧光探针在生物领域的相关检测方法和技术与传统的同位素检测相比具有速度快、重复性好、用量少及无辐射等特点。目前用于细胞标记的生物荧光颜料探针主要有吖啶、菲啶类、荧光素类，二氟烷硼类，二苯乙烯类、萘酰亚胺类、菁染料类等。但除菁染料类外，其他染料自身都会产生强的荧光背景干扰。作为生物荧光探针，如何在增大其灵敏度的同时提高光稳定性，减少荧光猝灭，并使其具有很好的癌细胞靶向性，是生物荧光染料探针修饰研究的关键问题。
树枝状化合物是一种结构完整、高度枝化的大分子。其分子在结构上具有高度的几何对称性、精确的分子结构、大量的官能团、分子内存在空腔及分子链增长具有可控性等特点，广泛用于医学、催化、染料、生物材料等领域。由于树枝状化合物的中心以及内部存在活性点，在这些活性点上接上荧光染料探针分子，可制备出树枝状荧光染料探针，该探针有特定 的空间、立体结构，且具备良好的稳定性和荧光特性。树枝状化合物具有大量的反应活性点，可以进行各种功能基转化，功能化位点不同，树枝状化合物表现出的性质也有所不同，如外层功能化时，官能团直接键接到树枝状化合物的表面，负载量大，局部浓度高，有时还表现出官能团之间的协同效应。树枝状化合物官能团之间可实现相互隔离，表现出“高度稀释效应”。在以上研究基础上，拟在多糖分子上组装不同级次的树枝状化合物并用于修饰菁染料，研究染料‑多糖化合物由线状改变为立体结构后，将提高对探针分子荧光增强的贡献率。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种树枝状荧光染料探针，有利于提高探针的光稳定性，同时增加染料与细胞的生物相容性以及在于生物组织结合及成像时表现出荧光加合效应，使探针分子与DNA或细胞相互作用的光学灵敏度得到显著提高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种树枝状荧光染料生物探针，其中：该生物探针结构包括在一个壳聚寡糖分子上连接1至15个树枝状荧光染料分子，同时再与一个叶酸分子结合形成的探针；同时还提供一种树枝状荧光染料生物探针的制备方法。
本发明的效果为：
1.本发明生物探针制备方法简单，对变异细胞初步表示研究表明，该探针具有较好的标记靶向性，为采用该类生物探针标记变异细胞进行构效关系研究提供了一种方法。
2.对检测物的毒性低，灵敏度高，使用量少。由于一个壳聚寡糖分子上可连接众多树枝状荧光染料分子，本发明探针在标记过程中表现出明显的荧光加合效应，在提高其光稳定性的同时增大了其标记灵敏度，使用量减少。
3.树枝状化合物的应引入，使荧光染料分子之间的距离增大，从而减少荧光染料分子相互碰撞猝灭的几率，增强了光稳定，起到荧光加合效应，同时，增加了生物探针和细胞的生物相容性。
4.具有光谱范围广、摩尔消光系数大、无荧光背景、两资产率高和灵敏度高等特点。
【附图说明】
图1为本发明的探针的叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料结构简图；
图2为本发明的树枝状荧光染料‑壳聚寡糖‑叶酸探针化学结构式。
【具体实施方式】
下面结合附图以及实施例进一步对本发明的一种树枝状荧光染料生物探针及其制备方法加以说明，但不局限于本发明。
本发明的一种树枝状荧光染料生物探针是基于以壳聚寡糖分子作为叶酸配体和树枝状染料分子之间的桥梁，增加了染料的细胞相容性、降低了对生物标记物的毒性。且由于壳聚寡糖具有很好的化学活性，很容易对其进行化学改性并修饰具有特定基团的荧光染料，和可根据特定的对象选择合适的生物分子进行修饰，如修饰配体定位受体及修饰探针DNA检测目标DNA等。树枝状化合的引入提高了生物探针的灵敏度、降低了探针标记的使用量，同时也提高了探针分子的生物相容性。
本发明的一种树枝状荧光染料生物探针，该生物探针结构包括在一个壳聚寡糖分子上连接1至15个树枝状荧光染料分子，同时再与一个叶酸分子结合形成的探针。
所述树枝状荧光染料是由一个树枝状化合物(dendrimer)分子与2～8个荧光染料连接而成。所述壳聚寡糖(chitosan)分子的分子量为195～6000，所述壳聚寡糖分子的分子量也可为为200～2000。
本发明的树枝状荧光染料生物探针的制备方法包括有以下步骤：
1)树枝状荧光染料的制备
①将摩尔比为1∶3的2，2‑二甲氧基乙胺及丙烯酸甲酯，置于甲醇溶剂中，搅拌均匀，在温度为35～50℃的条件下反应两天，用柱层析分离，得到甲基酯化合物1；
②取摩尔比为1∶3的上述甲基酯化合物1及乙二胺溶于甲醇溶剂，置于反应瓶中搅拌，氮气保护下，避光反应2～3天，用油泵抽滤除去过量的乙二胺，得到一代树枝状化合物2。产物直接用于下一步反应；
③取摩尔比为1∶2的上述第一代树枝状化合物2及荧光染料，溶于甲醇溶剂，在氮气保护下，避光反应2～3天，析出红色针状晶体；
重复一次上述①、②步骤的化学反应，得到二代树枝状化合物；二代树枝状化合物与荧光染料反应可得到二代树枝状荧光染料；
2)壳聚寡糖‑树枝状荧光染料的制备
①取适量树枝状荧光染料固体溶于摩尔比为0.03∶1的三氟醋酸和盐酸溶液中，室温搅拌，室温搅拌1天后，将搅拌的混合物旋蒸，干燥彻底后，得到醛基树枝状荧光染料；
②将80～100mg聚氨基多糖溶于含有适量冰醋酸水溶液中，向其中加入上述2)中①步骤制得的醛基树枝状荧光染料，得到混合物；向该混合物中加入25～30mL甲醇进行稀释，并室温搅拌充分后，加入100～120mg氰基硼氢化钠，并继续搅拌1天；
③经上述②步骤反应后的混合液用100～150mL的饱和碳酸氢钠溶液和丙酮处理，得到沉淀后的沉淀物通过过滤收集，将收集到的沉淀物分散在5～10mL的1mol/L的氢氧化钾水溶液中，渗析2～3天，在‑8～‑15℃温度下冻干，得到壳聚寡糖‑树枝状荧光染料；
3)叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料探针的制备
将上述2)制备的壳聚寡糖‑树枝状荧光染料的干品与叶酸按摩尔比为 1∶1溶解于二甲基亚砜溶液中，于室温下搅拌反应10小时后加入乙醚，产生沉淀物，经过滤所得到的沉淀物用乙醚洗涤后于25～35℃下真空干燥，即得叶酸‑可壳寡糖‑树枝状化荧光染料探针干品。
所述荧光染料的简式为：TO‑COOH，CY
3‑COOH。
实施例1：叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料生物探针I号的制备。
1.制备树枝状荧光染料
(1)将3g(28.6mmol)2，2‑二甲氧基乙胺及30ml甲醇置于50ml圆底烧瓶，搅拌均匀，加入9.8g丙烯酸甲酯，在温度为50℃的条件下反应48h，停止反应，用减压旋蒸仪除去溶剂，残留物进行柱层析分离，得到甲基酯化合物1。
(2)取1.0g甲基酯化合物1溶于15mL甲醇，加入1.5g乙二胺，置于50mL反应瓶中搅拌，氮气保护下，避光反应3d，用油泵抽滤除去过量的乙二胺，得到一代树枝状化合物2。产物直接用于下一步反应。
(3)取65.5mg化合物2及20mg羧基TO，溶于30mL的甲醇溶液，置于50mL圆底烧瓶中，在氮气保护下，避光反应3d，析出得树枝状荧光染料。
2.制备壳聚寡糖‑树枝状荧光染料
①将1.15mmol树枝状荧光染料溶于4.9g三氟醋酸和16.85mL的2M盐酸溶液中，室温搅拌。室温搅拌1天后，混合物旋蒸，干燥彻底后得到醛基树枝状荧光染料；
②将100mgNH
2聚氨基多糖溶于含有30mg醋酸0.5mmol的10mL水溶液中，向其中加入上步制得的醛基树枝状荧光染料，得到混合物。向混合物中加入30mL甲醇进行稀释，并室温搅拌1小时后，加入120mg氰基硼氢化钠，并继续搅拌1天。
③反应后的混合液用5mL的饱和碳酸氢钠溶液和100mL的丙酮处理，得到沉淀后。沉淀通过过滤收集，将收集到的沉淀分散在5mL的1mol/L的 氢氧化钾水溶液中，渗析2天，在‑15℃温度下冻干得到壳聚寡糖‑树枝状荧光染料。
3.叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料探针的制备
将上述壳聚寡糖‑树枝状荧光染料干品与0.02mmol叶酸(flate acid)溶解于10ml二甲基亚砜(DMSO)溶液中，于室温下搅拌反应10小时后加入乙醚，产生沉淀，过滤；所得到沉淀用乙醚洗涤后于25‑35℃下真空干燥，即得叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状化荧光染料探针干品。
实施例2：叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料生物探针II号的制备。
将实施例1步骤1变为：
1.制备树枝状荧光染料
(1)将3g(28.6mmol)2，2‑二甲氧基乙胺及30ml甲醇置于50ml圆底烧瓶，搅拌均匀，加入9.8g丙烯酸甲酯，在温度为50℃的条件下反应48h，停止反应，用减压旋蒸仪除去溶剂，残留物进行柱层析分离，得到甲基酯化合物1。
(2)取1.0g甲基酯化合物1溶于15mL甲醇，加入1.5g乙二胺，置于50mL反应瓶中搅拌，氮气保护下，避光反应3d，用油泵抽滤除去过量的乙二胺，得到一代树枝状化合物2。产物直接用于下一步反应。
(3)取33.3mg一代树枝状化合物2及30ml甲醇置于50ml圆底烧瓶，搅拌均匀，加入35.4mg丙烯酸甲酯，在温度为50℃的条件下反应48h，停止反应，用减压旋蒸仪除去溶剂，残留物进行柱层析分离，得到甲基酯化合物3。
(4)取66.7mg甲基酯化合物3溶于30mL甲醇，加入60mg乙二胺，置于50mL反应瓶中搅拌，氮气保护下，避光反应3d，用油泵抽滤去过量的乙二胺，得到二代树枝状化合物4。产物直接用于下一步反应。
(5)取103.6mg羧基TO，溶于30mL的甲醇溶液，置于50mL圆底烧瓶 中，缓慢滴加入78.9mg二代树枝状化合物4，在氮气保护下，避光反应3d，析出得二代树枝状荧光染料。
其余步骤不变，得到叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料生物探针II号。
实施例3：叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料生物探针III号的制备。
将实施例1步骤1的(3)中荧光染料TO‑COOH换成同摩尔的CY
3‑COOH，其余步骤不变，得到叶酸‑壳聚寡糖‑树枝状荧光染料生物探针III号。