提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表达载体及其应用 【技术领域】
本发明属于植物基因工程领域，具体地，涉及一种提高植物同化和吸收甲醛能力所需植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi及其在提高植物吸收和耐受外源甲醛能力中的应用。
背景技术
甲醛目前已被认为是一种主要的室内空气污染气体，它的污染源来自烟雾，家具，工业粘胶剂及varnishes等(shah and singh 1988)。甲醛反应能力极强，能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应，是一种非常活泼的化合物(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1973，13：1-49)，因此对所有的生物来说都有很高的毒性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种：一是使用环保材料；二是开窗通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese等，1994，Plant Physiol.104：1301-1309)。
在生物体内通过各种脱甲基化反应，也会产生低浓度的甲醛，所以几乎所有的生物对甲醛都有各自的解毒机制。微生物应对甲醛毒性有不同的方法，总体上可归纳为两种机制：氧化甲醛最终生成CO2；利用同化途径固定甲醛。甲基营养菌是一类能利用CO2的各种还原态形式如甲烷、甲醇、甲胺作为碳源和能源生长的微生物。甲基营养型细菌同化甲醛的途径有三种：核酮糖单磷酸途径(RuMP)，丝氨酸途径，核酮糖二磷酸途径(Ribulose bisphosphate pathway，RuBP)。RuMP途径作为高效捕捉游离甲醛的一个系统，在甲醛浓度极低的情况下还能发挥作用，在该途径中固定甲醛的关键酶是6-磷酸己酮糖(Hexulose-6-P)合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)，目前已从多种甲基营养型细菌中克隆到hps和phi基因。由于RuMP途径的所有反应均是放能的，所以它同化甲醛的效率比丝氨酸途径或核酮糖二磷酸途径高得多。
通过基因工程手段，可以将RuMP途径的两个关键基因hps和phi导入一些非甲基营养菌中，增强其甲醛代谢能力。
1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50％。Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基因编码，控制rbcS基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)，PrbcS的作用有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表达最强。用报告基因的研究结果表明在叶片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍，因此PrbcS是一种很强的光诱导型启动子(Jefferson等，1987，EMBO，6：3901-3907)，常被用来实现目的基因在叶片中的高水平表达。rbcS的转移肽可以将其定位到叶绿体中，因此也在植物基因工程中经常被用于把表达的目标蛋白定位到叶绿体中。
迄今为止，现有技术中未见有提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服天然植物代谢甲醛能力和速度非常有限的缺陷，利用基因工程技术在观赏植物叶片细胞的叶绿体中过量表达hps/phi基因，从而构建一条有效代谢甲醛的同化途径(图1)，利用植物的光合作用同化甲醛，以提高植物吸收和耐受甲醛的能力，创造有净化室内甲醛污染的特殊观赏植物，维护人体的健康。
本发明提供的提高植物代谢甲醛能力的植物表达载体是pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi载体，它是含有甲基营养菌Mycobacterium gastriMB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶融合而成的双功能酶HPS/PHI基因hps/phi的植物表达载体。该载体中，hps/phi基因由番茄Rubisco 3C小亚基的光诱导型启动子和叶绿体转移肽控制其在植物叶片叶绿体中过量表达。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi，为含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)3C小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)及其转移肽序列和甲基营养菌Mycobacterium gastri MB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖异构酶融合而成的双功能酶HPS/PHI基因的植物表达载体。
其中hps/phi基因地GenBank登录号为AB292776。
其起始载体为pK2GW7。
所述的hps/phi基因上游添加有从番茄基因组中分离出来的光诱导型启动子PrbcS和叶绿体基质定位序列。
所述的pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi载体中含有hps/phi基因，其hps/phi基因的GenBank登录号为AB292776，所述的hps/phi基因上游都有番茄Rubisco 3C小亚基的启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T，该植物表达载体的起始载体为pK2GW7。
植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi由下述方法构建而成：
(1)hps/phi基因的扩增：
以hps/phi的原核表达载体pET-23a-hps/phi质粒为模板，用hps/phi基因的特异性引物，上游引物5’rmpA：CACCGCATGCAGCTCCAAGTCGCCATCG(SphI)，下游引物3’rmpB：TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG(XbaI))进行扩增，得PCR产物；
(2)hps/phi基因的TA克隆：
回收并纯化hps/phi基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-hps/phi；
(3)入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的构建：
用SphI和EcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pMD-hps/phi，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和hps/phi基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和hps/phi基因片断，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi；
(4)hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建：
通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-hps/phi片段亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得hps/phi基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi。
植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建方法，包括下述步骤：
(1)hps/phi基因的扩增：
以hps/phi的原核表达载体pET-23a-hps/phi质粒为模板，用hps/phi基因的特异性引物，上游引物5’rmpA：CACCGCATGCAGCTCCAAGTCGCCATCG(SphI)，下游引物3’rmpB：TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG(XbaI))进行扩增，得PCR产物；
(2)hps/phi基因的TA克隆：
回收并纯化hps/phi基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-hps/phi；
(3)入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的构建：
用SphI和EcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(见本发明人的另一申请专利，申请号为200710066422.9)和pMD-hps/phi，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和hps/phi基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和hps/phi基因片断，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi；
(4)hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建：
通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-hps/phi片段亚克隆到植物表达载体pK2GW7(Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中，获得hps/phi基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi。
植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi在制备提高植物吸收和耐受外源甲醛的能力的转基因植株中的应用。
因为HPS和PHI依次催化的反应的底物和产物都是植物开尔文循环的中间产物，所以本发明技术方案的提出是基于甲基营养型细菌的甲醛同化途径可以安装成高等植物开尔文羧化反应的一个支路，基于在植物的叶绿体中过量表达来自M.gastri MB19的HPS和PHI可以增强转基因植物对甲醛的抗性，并提高植物吸收和同化外源甲醛的能力。
本发明载体中，hps/phi基因的上游添加有光诱导型启动子PrbcS和叶绿体基质定位序列。本发明使用的光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体定位序列是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子和叶绿体基质定位序列，是一个由HindIII切割产生的1.7kb的DNA片断(Sugita et al.，1987，MGG，209：247-256)。
本发明利用光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(*T)构建hps/phi基因的植物表达载体，以便在转基因植物叶片的叶绿体基质中过量表达6-磷酸己酮糖合成酶/6-磷酸果糖异构酶的融合蛋白HPS/PHI，通过该融合蛋白在转基因观赏植物的叶绿体中构建甲醛的光合作用同化途径，增强植物同化甲醛的效率，进而提高了植物吸收和耐受外源甲醛的能力。
附图说明：
图1使用HPS/PHI构建甲醛同化途径的原理示意图；
在叶绿体中过量表达双功能酶HPS/PHI，那么HPS/PHI就可利用开尔文循环的中间产物Ru5P为固定甲醛的受体，催化以Ru5P和甲醛为底物的缩合反应产生6-磷酸己酮糖(Hu6P)，HPS/PHI再催化Hu6P的异构化，生成6-磷酸果糖(Fructose 6-P，F6P)，其可作为开尔文循环的中间产物，重新进入开尔文循环途径。
图2本发明中间载体pMD-hps/phi的构建策略图；
图3本发明中间载体pMD-hps/phi的检测图；
A：hps/phi基因扩增产物的检测。M：λDNA/HindIII，1～3：hps/phi基因PCR扩增产物；
B：pMD-hps/phi质粒电泳检测。1～4：pMD-hps/phi，5：正对照(pUC18)
C：pMD-hps/phi质粒的酶切检测，M：λDNA/HindIII，1～3：SphI+XbaI酶切pMD-hps/phi的产物；
D：pMD-hps/phi的PCR检测。M：λDNA/HindIII，1～3：PCR扩增产物。
图4本发明入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的构建策略图；
图5本发明入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的检测图；
A：pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi质粒电泳检测。M：λDNA/HindIII，1～2：pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi，3：正对照(pUC-r-rmpAB)；
B：pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的酶切检测。M：λDNA/HindIII，1～2：XhoI酶切pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的产物，3：正对照(pUC-r-hps/phi)，4：负对照(pMD-hps/phi)；
C：pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的PCR检测，上游引物为5’PrbcS-2，下游引物为3’rmpB。M：D2000 DNA marker，1～3：pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的PCR扩增产物，4：正对照(以pMD-hps/phi为模板的PCR扩增产物)。
图6用Gateway的LR反应构建hps/phi基因的植物表达载体的策略图；
图7植物表达载体pK2-35S-PrbcS-T-hps/phi的检测图；
A：重组质粒pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的电泳检测。M：λDNA/HindIII，1～2：pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi质粒样品，3：正对照(pK2GW7)，4：负对照(pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi)；
B：pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的XhoI酶切检测。M：λDNA/HindIII，1：pUC-r-rmpAB(正对照)，2：pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi；
C：pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的PCR检测。M：λDNA/HindIII，1～2：以pK2-35S-PrbcS-T-hps/phi重组质粒为模板，上游引物为5’PrbcS-2，下游引物为3’rmpB扩增得到的产物。3～4：以pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi重组质粒为模板，上游引物为5’rmpA，下游引物为3’rmpB扩增得到的产物。
图8农杆菌转化子菌落的PCR检测图；
上下游引物分别使用5’rmpA和3’rmpB。M：Marker III，1～2：菌落PCR样品，3：正对照(模板为pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi质粒)；
图9基因组PCR检测hps/phi在转基因天竺葵中的插入情况示意图；
扩增时上下游引物分别使用5’rmpA和3’rmpB。AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6、AB7、AB8、AB9、AB10：转基因天竺葵，WT：野生型天竺葵，+：pMD-hps/phi作为模板。
图10western blot检测HPS/PHI在转基因天竺葵中的表达水平图；
A：用HPS蛋白抗体作的Western分析；
B：用PHI蛋白抗体作的Western分析。WT：野生型天竺葵叶片总蛋白；AB5，AB7，AB8：转基因株系天竺葵叶片总蛋白；control：表达重组HPS/PHI的大肠杆菌粗蛋白。
图11转基因天竺葵对液体甲醛抗性能力的检测图；
WT：野生型天竺葵，AB5：转hps/phi天竺葵株系。
图12转基因天竺葵对气体甲醛抗性能力的检测图；
WT：野生型天竺葵，AB5：转hps/phi天竺葵株系，AB8：转hps/phi天竺葵株系。
图13转基因天竺葵吸收液体甲醛速率测定图。
WT：野生型天竺葵，AB5：转hps/phi天竺葵株系，AB7：转hps/phi天竺葵株系，AB8：转hps/phi天竺葵株系。
具体实施方式：
下面结合附图用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明。
本发明下述实施例中所用到的试剂与仪器为：试剂主要为分子生物学实验试剂，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建
(1)hps/phi基因的扩增及TA克隆：
hps/phi基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，以pET-23a-hps/phi质粒为模板，设计hps/phi基因的特异性引物(上游引物5’rmpA：CACCGCATGCAGCTCCAAGTCGCCATCG(SphI)，下游引物3’rmpB：TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG(XbaI))进行扩增。用hps/phi基因上下游特异性引物5’rmpA和3’rmpB作PCR，在PCR反应混合液中加入50ng的pET-23a-hps/phi质粒作为模板，同时加入75ng的特异性引物5’rmpA和3’rmpB、4μldNTP(2.5mM)，25μl的2×GC BufferI和0.25μl的LA taq(5U/μl)聚合酶(Takara)，加双蒸水使反应终体积为50μl。在PCR仪上于94℃加热2分钟，然后按照94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、2分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到hps/phi基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离hps/phi的PCR扩增产物(图3A)。回收并纯化hps/phi全长基因(1.2kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒将其连接到pMD18-T(大连宝生物公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5α(购自天根生化科技公司)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳(图3B)，选取大小和理论值相符的重组质粒pMD-hps/phi做进一步的PCR检测，用hps/phi基因上下游特异性引物5’rmpA和3’rmpB作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出1.2kb左右的hps/phi基因DNA片段(图3D)。根据阳性重组质粒pMD-DAS载体两端的多克隆位点，用SphI和XbaI双酶切重组质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD-hps/phi产生2条带，一条为1.2kb左右的hps/phi基因DNA插入片段，另一条为2.3kb的载体片断(图3C)。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD-hps/phi。
(2)入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的构建：
pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的构建策略如图4所示，用SphI(Takara)和EcoRI(Takara)切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP(见本发明人的另一发明专利申请，申请号为200710066422.9)和pMD-hps/phi，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的载体片断pENTR*-PrbcS-*T(4.0kb)及pMD-hps/phi被切割产生的hps/phi基因的DNA片断(1.2kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*-PrbcS-*T和hps/phi基因的DNA片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图5A)，用XhoI(Takara)进行酶切检测，连接成功的质粒和对照质粒pUC-r-hps/phi及pMD-hps/phi在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条1.1kb大小的条带(图5B)。选出连接成功的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi作为模板，上游引物为5’PrbcS-2(根据PrbcS光诱导启动子下游序列设计的上游引物，其序列为AAGCCTTATCACTATATATACAAG)，下游引物为3’rmpB进行PCR检测，获得1.4kb左右的产物，和正对照一致(图5C)。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi。
(3)hps/phi基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的构建：
hps/phi基因植物表达载体的构建策略如图6所示，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-hps/phi亚克隆到植物表达载体pK2GW7(Gateway的目的载体，购自比利时VIB/Gent公司)中。具体的做法是：用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi和pK2GW7各150ng，1μl LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen)，混均于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-*T-hps/phi整合到pK2GW7中获得hps/phi的植物表达载体质粒pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi。用反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图7A)。XhoI单酶切pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi质粒和对照质粒pUC-r-hps/phi，二者均出现一条1.1kb左右大小的条带(图7B)。以pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi为模板，下游引物为3’rmpB，上游引物分别为5’rmpA和5’PrbcS-2进行PCR扩增，hps/phi基因上下游引物扩增的片段大小为1.2kb，上游用5’PrbcS-2引物扩增产物约为1.4kb(图7C)。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例2：用含有hps/phi基因的植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi转入农杆菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μl ddH2O中，98℃处理15分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用上下游引物5’rmpA和3’rmpB作PCR检测，转化成功的菌落均能扩增出1.2kb的hps/phi基因条带(图8)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例3：用含有hps/phi基因植物表达载体的农杆菌转化植物
挑取携带有质粒pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe，100μg/ml)，180rpm，28℃培养24h，待菌液OD600至1.0左右，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5。制备天竺葵(Pelargonium sp.frensham)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化天竺葵，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。具体步骤如下，把无菌天竺葵的叶柄切成小段，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1(MS+NAA02.1μg/ml+BAP 0.02μg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上进行根的诱导，获得转入hps/phi基因的植株。
实施例4：hps/phi基因在转基因植物中的插入情况
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因天竺葵株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因植物作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH 7.5 100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2％)，65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)后转移上清至1.5ml EP管；再次加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA。以植物基因组DNA为模板，用hps/phi基因上下游特异性引物作PCR检测，成功转入hps/phi基因的植株均能扩增出1.2kb的hps/phi条带(图9)。经PCR确认的转基因植株用于western-blot分析。
实施例5：hps/phi在转基因天竺葵中表达水平检测
采用western-blot方法检测hps/phi在转基因天竺葵中表达水平。首先使用Plant Total Protein Extraction kit(Sigma，USA)从天竺葵叶片中抽提可溶性总蛋白，操作步骤参照说明书。再用Bradford方法测定样品中的蛋白质浓度后，每个样品取15μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后半干转膜至PVDF-P膜(GE，USA)。一抗分别为甲基营养菌Mycobacterium gastri MB19 HPS和PHI的兔抗体，二抗为辣根过氧化酶标记的猴抗兔IgG(GE，USA)。转基因天竺葵样品和正对照样品中都有一条41kD左右目标蛋白带，而在野生型样品没有出现(图10)，说明hps/phi基因编码的蛋白已在转基因植物中成功地表达。
实施例6：转hps/phi基因植物对甲醛的抗性检测：
为了检测hps/phi在转基因植物中是否发挥预期作用，将AB5株系转基因植物小苗和未转基因植物的野生型小苗移入加有甲醛(浓度为7mM)的MS固体培养基上，在25℃持续光照培养，15天后观察植物表型变化(图11)。结果说明同时转入hps/phi的植物比野生型长势好，，说明引入的甲醛同化途径能够在植物中发挥预期作用，增强植物对甲醛的同化能力，使转基因植物对于培养基中液体甲醛的抗性增强。
为了验证转基因植物对气体甲醛的抗性，将AB5和AB8株系转基因植物幼苗移入有MS培养基的密封容器中培养，约15天生根后在容器中放置一个开口的500μl离心管，并在离心管中加入一定量(30μl)37％的甲醛溶液。25℃持续光照培养15天后，观察转基因植物的生长状况，转基因天竺葵生长状况明显优于野生型天竺葵(图12)，说明转hps/phi基因可提高天竺葵对气体甲醛的抗性。
实施例7：转基因天竺葵对液体甲醛吸收速率的检测
甲醛可与Nash试剂(醋酸氨：15％，冰醋酸：0.3％，乙酰丙酮：0.2％)发生化学反应产生有颜色的物质，该物质的最大吸收波长为410nm，因此可以制备甲醛的标准曲线，根据HCHO的标准曲线即可计算出反应液中甲醛的含量，利用该方法可以测定植物对甲醛的吸收速率。取2g左右植物叶片材料放入小三角瓶中，加入150ml甲醛(4mM)溶液处理一定时间后，取出40μl处理液，加水至500μl，再加入500μl Nash试剂在30℃保温30分钟后，测定OD410，根据标准曲线计算出处理液残存甲醛浓度(图13)。处理70小时后，转基因天竺葵株系AB5、AB8已经将处理液中所有甲醛吸收完毕，转基因株系AB7处理液中残留约7％甲醛，而野生型甲醛残留高达33％。三个转基因天竺葵株系在90小时后已经将处理液中所有甲醛吸收完毕，而野生型天竺葵处理液中仍然残留约17％甲醛。因此转hps/phi天竺葵吸收甲醛的速率明显高于野生型植株，能在较短的时间内将处理液中的外源甲醛吸收完毕。
与现有技术相比，本发明的优越性在于：本发明克服了天然植物代谢甲醛能力和速度非常有限的缺陷，利用基因工程技术在观赏植物叶片细胞的叶绿体中过量表达hps/phi基因，从而构建一条有效代谢甲醛的同化途径(图1)，利用植物的光合作用同化甲醛，达到了提高植物吸收和耐受甲醛的能力，创造有净化室内甲醛污染的特殊观赏植物，维护人体的健康的目的。
本发明利用光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(*T)构建hps/phi基因的植物表达载体，以便在转基因植物叶片的叶绿体基质中过量表达6-磷酸己酮糖合成酶/6-磷酸果糖异构酶的融合蛋白HPS/PHI，通过该融合蛋白在转基因观赏植物的叶绿体中构建甲醛的光合作用同化途径，增强植物同化甲醛的效率，进而提高了植物吸收和耐受外源甲醛的能力。