草鱼呼肠孤病毒逆转录聚合酶链式反应核酸检测方法 【技术领域】
本发明涉及病毒学领域，特别是一种草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，缩写GCRV，又称草鱼出血病病毒Grass carp hemorrhagic virus，缩写GCHV)逆转录聚合酶链式反应(简称RT-PCR)的核酸检测方法。本发明是基于草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株GCRV873(又称草鱼出血病病毒湖南邵阳株GCHV873)的研究成果，该毒株已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏编号是CCTCC NO：V200414。
背景技术
水生动物病毒病是严重危害水产养殖及疾病传播的主要病原。随着水产集约化养殖业的迅速发展，病毒性流行病频频发生，这些疾病在世界范围内对水产养殖造成了极大的危害。GCRV隶属于呼肠孤病毒科水生动物呼肠孤病毒属，该病原曾一度引起我国长江中下游地区淡水养殖区大规模暴发草鱼流行性出血病，造成严重的经济损失。GCRV形态结构为二十面体对称的无包膜球形颗粒，基因组由11条(S1-S11)分段的双链RNA组成。
研究病原及其诊断手段，是预防病毒病发生与蔓延的重要环节。此外，随着国际间鱼苗、鱼卵以及鱼制品进出口的日益增多，由于检疫制度的不完善，水生动物呼肠孤病毒病也随之在世界各地传播开来。为规范与杜绝外来带毒水生生物苗种进入我国及我国带毒苗种的出境，制定有效的诊断与预防措施十分必要。
目前在GCRV病原检测方面虽有ELISA等血清学检测方法，也有RT-PCR相关检测方法的报道，但是现有的检测手段都存在耗时较长(通常需要12小时以上)，且灵敏度与特异性欠佳等弊端，适应不了临床检测准确、快速、灵敏的要求。基于GCRV s10基因片段编码病毒外衣壳蛋白及宿主特异性强等特性，为此，我们建立了快速检测GCRV感染细胞或患病草鱼组织的RT-PCR核酸检测方法。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于快速灵敏检测编码GCRV外衣壳蛋白VP7的s10基因的RT-PCR核酸检测方法。GCRV VP7蛋白为组成病毒的外衣壳组分，在病毒进入细胞过程中具有十分重要的作用，其编码基因s10是病毒基因组核酸的重要组成部分。在草鱼育种期、鱼苗的出入境检疫及草鱼出血病流行期间对s10基因进行快速检测，将为防治出血病的发生与蔓延、杜绝外来病毒的侵害以及防止带毒鱼苗的传播提供标准的检测方法。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的草鱼呼肠孤病毒逆转录聚合酶链式反应核酸检测方法，该方法是：采用RNA吸附柱离心法直接提取待测样品中总RNA，通过逆转录酶链式反应从待测样品中检测编码GCRV外衣壳结构蛋白VP7的s10基因片段；所述待测样品包括正常细胞和病毒感染的细胞，及正常鱼组织和病鱼组织。
上述的检测方法包括以下步骤：
(1)取少许细胞或鱼体组织作为待测样品，将所述待测样品研磨冻融后进行离心沉淀，采用蛋白酶K和SDS对待测样品进行处理，然后用RNA吸附离心柱对蛋白酶K和SDS处理的待测样品RNA进行抽提。由此获得待测的RNA样品。
(2)根据GCRV s10基因片段序列，分别设计用于RT-PCR扩增的特异性正反向引物，采用Superscript II逆转录酶系统与高保真Taq酶，及s10基因片段特异引物序列进行s10基因片段的RT-PCR核酸扩增。
(3)采用所建立的RT-PCR方法，进行扩增产物的灵敏度测定与特异性分析。
本发明可以由以下方法得到上述的待测样品：
(1)取0.5～1ml GCRV待测样品进行研磨，制成待测匀浆液；
(2)对于待测鱼体组织样品，按1∶3重量体积比加入1xPBS，进行待测样品研磨，研磨的待测样品重复冻融3次，即在-20℃低温冰箱中快速结冻，然后取出于37℃快速解冻，得到待测匀浆液；
(3)将上述待测匀浆液通过离心得到沉淀物，该沉淀物为所述待测材料。
所述待测匀浆液可由离心机以12500g离心5分钟得到沉淀物，在该沉淀物中加入150～200μl的pH值为8.0的TE，TE用DEPC处理的去离子水配置，高压灭菌，然后依次加入蛋白酶K和SDS，使其终浓度分别为100μg/ml和0.5％；经充分混匀后，于60～68℃水浴孵育1h，以进行细胞裂解；再用RNA吸附柱离心法获得RNA提取物，用于后续RT-PCR扩增。
本发明可以采用以下方法进行后续RT-PCR扩增，其步骤包括：
(1)根据GCRV s10基因序列设计引物，GenBank序列号为AF403396；
(2)RT反应或cDNA合成：采用s10基因反向特异引物与待测RNA样品混合，65℃反应5分钟后立即放置冰上，然后在20μl反应体积依次加入变性的RNA模板引物混合物，5×RT Buffer，10mMdNTP混合物，10U/μl的RNase Inhibitor，200U/μl的逆转录酶1μl；于42℃保温30min，进行cDNA第一链的合成，cDNA产物置-20℃保存备用；取2μl cDNA产物为模板，用GCRV s10基因序列正反向特异引物进行PCR扩增。
所述GCRV s10基因序列的正反向特异引物的序列如下：
正向引物的序列：5’-TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3’
反向引物的序列：5’-GATGAAACGAGAGACCCCTAC-3’。
所述GCRV s10基因序列的正反向特异引物扩增RT-PCR的产物大小为515bp，该产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。RT-PCR扩增产物的阳性对照物为GCRV873，GCRV873是草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株。
本发明提供的草鱼呼肠孤病毒逆转录聚合酶链式反应核酸检测方法，其用于草鱼出血病的早期诊断或出入境水产品疫情的检测。
本发明与现有技术相比，主要有以下优点：
其一.采用RNA吸附柱离心法，可从微量待检测鱼体组织或病毒感染的细胞培养液直接提取RNA，进行后续s10基因片段地RT-PCR扩增。
其二.快速，简便，从样品处理到结果读取只需要4-5h。
其三.以编码GCRV外衣壳蛋白的s10基因为靶序列，设计特异性引物，进行s10基因片段检测，可提高检测的灵敏度，其检测灵敏度可达到10-6ng。
其四.与ELISA方法相比，检测的是病毒基因组特异的核酸片段，具有较高的特异性。
其五.实用性强：可用于草鱼出血病的早期诊断及出入境水产品疫情检测。
总之，本发明不仅提供了一种草鱼出血病的快速灵敏检测手段，而且为我国进出口水生动物检疫试剂的标准化及商品化应用奠定基础。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
一.待测样品制备与病毒细胞总RNA的抽提
1.待测样品的制备：
取0.5～1ml正常细胞、病毒感染的细胞、正常鱼体组织或一定量的病鱼体组织(100-150mg)为待测样品RNA提取材料。其中，患病或正常鱼体组织按重量体积比，在鱼体组织样品中加入3倍体积1×PBS(phosphate-buffered saline，缩写PBS，其组成成分为：137mMNaCl，2.7mM KCl，8.1mMNa2HPO4，1.5mMKH2PO4，pH 7.5)，进行反复研磨。研磨的待测组织样品和待测细胞重复冻融3次，即于-20℃低温冰箱快速结冻及37℃进行快速解冻，以制成待测匀浆液。得到的匀浆液经搅拌均匀后，制成待测样品。
2.待测样品总RNA的提取：
(1)将待测细胞或组织匀浆液以12500g离心5分钟，除去上清，保留沉淀物。
(2)将离心得到的沉淀物，加入150-200μl的TE(10mmol/LTris.Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0)进行悬浮，TE用焦碳酸二乙脂(DEPC)处理的去离子水配置，高压灭菌，然后加入蛋白酶K和SDS，使其终浓度为100μg/ml和0.5％(W/V)。充分混匀后，65℃水浴孵育1h，对细胞或组织匀浆液进行裂解。
(3)采用RNA吸附柱离心法获得上述待测样品RNA提取物，用于后续RT-PCR扩增。
(4)采用分光光度计对所提取的RNA进行定量测定。
二.RT-PCR扩增
1.采用RT-PCR方法进行GCRV衣壳蛋白s10基因片段扩增。基于GenBank序列进行s10基因片段引物设计。用于扩增GCRV s10的正反向引物序列如下：
正向引物(GCRV-S10-SF1)的序列：5’-TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3’
反向引物(GCRV-S10-ASF)的序列：5’-GATGAAACGAGAGACCCCTAC-3’。
2.采用常规cDNA第一链合成试剂盒，进行cDNA合成。
cDNA合成的具体方法是：将特异引物或随机引物与待测RNA在65℃反应5min后，立即放置冰上，然后在20μl反应体积依次加入上述变性的RNA模板引物混合物，5×RT Buffer，10mM dNTP混合物，10U/μl RNase Inhibitor 1μl，200U/ml的SuperScriptIl逆转录酶1μl；42℃保温30min，进行cDNA第一链的合成，置-20℃保存cDNA产物。取2μl cDNA合成产物，加入s10正反向引物及常规PCR反应混合后进行PCR扩增。其PCR产物在1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
三.RT-PCR检测的灵敏度测定
采用RNA吸附柱离心法获得上述待测样品RNA提取物后，可用随机引物进行反转录用于后续PCR扩增，也可以用上述特异反向引物序列进行cDNA合成，其反转录产物cDNA直接用作PCR扩增的模板。以未感染病毒的正常CIK细胞及正常鱼组织作为阴性对照，GCRV873为扩增产物的阳性对照。结果显示，待测的感染GCRV细胞或病鱼组织样品均应有约500bp阳性扩增产物，阴性对照无任何扩增产物出现，本方法能检测出的GCRV dsRNA最低含量为10-6ng。
四.待测样品RT-PCR检测的特异性分析
用s10特异引物对不同养殖地区的正常草鱼与感染GCRV的患病草鱼进行了RT-PCR检测，其待测RNA样品及RT-PCR检测均按上述方法进行，同时应设置未感染GCRV的健康鱼组织提取液为阴性对照，阴性对照样品中应无特异性核酸扩增产物。本方法已对从我国南方不同地方淡水养殖区收集到的患草鱼出血病鱼组织和分离保存的GCRV分离株进行了检测，结果显示该RT-PCR检测方法具有很强的特异性。其阳性与阴性对照符合率为100％。
五.草鱼呼肠孤病毒逆转录聚合酶链式反应核酸检测方法的用途
该检测方法用于草鱼出血病的早期诊断，或出入境水产品疫情的检测。
<110>中国科学院武汉病毒研究所
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>正向引物GCRV-S10-SF1
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5’-TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3’
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>反向引物GCRV-S10-ASF
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5’-GATGAAACGAGAGACCCCTAC-3’