一种蜡状芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用 【技术领域】
本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种杨树根际高效解磷的蜡状芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用。
背景技术
磷在植物生长发育过程中发挥着重要作用，是植物必需的重要营养元素之一。我国耕地土壤中有1/3～1/2的土壤缺磷，但这种缺磷是“遗传学缺磷”而非“土壤学缺磷”，即土壤有效磷含量很低，而大部分土壤磷处于植物不能吸收利用的有机和无机磷化物状态。其中，有机磷化物是土壤磷的重要组成部分，约占土壤总磷量的1/3～1/2，主要有核酸、植素和磷脂三大类，它们一般必须经过降解、矿化才能被植物吸收利用。土壤有机磷的矿化和积累是以土壤解有机磷微生物为中介，在磷酸酶的作用下进行的。土壤解磷微生物分泌的酸性或碱性磷酸酶，将核酸、植酸盐、磷脂等有机磷化物水解，转化为简单的无机磷化物被植物吸收利用。研究表明，土壤解有机磷微生物一般约占土壤微生物总数的30％～60％。与真菌、放线菌相比，植物根际细菌被认为是最有效的解有机磷微生物。
解有机磷细菌的研究可以追溯到20世纪初，1935年前苏联学者蒙金娜从土壤中分离到一种解磷巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium var.phosphaticum)分解核酸和卵磷脂的能力很强，并于1947年大量生产使用。结果表明，接种土壤后使得P2O5含量提高了15％以上。我国对解磷细菌的研究起步于上世纪50年代。1950年，前东北农科所从东北黑土中分离出能分解有机磷的巨大芽孢杆菌。同年，中国科学院前林业土壤研究所从东北黑土中分离出一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)也具有分解核酸和卵磷脂的能力。据不完全统计，目前报道的具有降解有机磷化物的细菌种类主要有：芽孢杆菌属的一些种，如巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等；变形菌属的一些种(Proteusspp.)；沙雷氏菌属的一些种(Serratia spp.)。20世纪80年代以后，国内许多单位相继开发出了有多种芽孢杆菌组成的复合解磷菌制剂，微生物肥料的研究及开发得到了高度重视。目前，国内外有不少文献指出，向土壤或作物根系接种解磷菌，能够促进小麦、青菜、玉米、莜麦、甘蓝、花生、油菜、柱花草等农作物的生长，但至今未见向多年生作物接种解磷微生物的研究报道。
杨树是我国中纬度平原地区栽培面积最大、木材产量最高的速生用材树种之一。目前，我国杨树人工林面积居世界首位，对缓解我国的工业用材不足和改善我国生态环境起到了不可替代的作用。但杨树因生长快，轮伐期短且频，大量消耗了土壤养分，我国部分地区杨树人工林出现了地力衰退现象，严重影响了杨树人工林的健康发展。其中，磷素供应不足是突出而具普遍性的问题。解决这一问题有两条途径：增加磷源投入和提高土壤难溶性磷利用率。但对于林业生产，大面积施用磷肥不仅受到资金限制，且耗竭有限磷矿资源，引发能源危机、环境污染等问题。因此，如何提高土壤磷的利用率已经越来越受到人们的重视。其中，从土壤中筛选高效解磷微生物，研制解磷菌剂施入土壤，活化土壤中难溶性磷以供植物吸收利用是低投入高产出的可持续发展途径。由于微生物具有强烈的根际效应，不同土壤、不同作物根际及不同环境条件下，解有机磷细菌的种类和数量均有所不同。因此，为了获得与杨树亲和性好，易于根际定殖的高效解有机磷细菌，本发明从我国山东临沂杨树人工林根际土壤中分离、筛选获得了一株高效解有机磷蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)JYZ-SD1，通过接种试验表明其对杨树具有明显促生作用。目前，国内外未见有关杨树解有机磷细菌的筛选及应用方面的报道。
【发明内容】
本发明提供了一种杨树根际高效降解有机磷化物的蜡状芽孢杆菌；
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述蜡状芽孢杆菌在促进杨树生长中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
从山东省临沂市杨树根际土壤中，筛选获得了一株高效降解卵磷脂的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)JYZ-SD1，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：M209096，保藏日期：2009年5月4日。
菌株JYZ-SD1鉴定程序如下：
JYZ-SD1菌株主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较大，颜色乳白，圆形、边缘整齐；菌体长杆状，革兰氏染色阳性，大小约0.98×1.47μm～2.70×3.48μm，中生芽孢，周生鞭毛；好氧，氧化酶反应阴性，接触酶试验阳性，淀粉水解试验阳性，发酵葡萄糖，明胶水解试验阳性，硝酸还原试验阳性，柠檬酸盐生长试验阴性；经伴胞晶体染色，未见伴胞晶体出现。
通过Biolog系统对JYZ-SD1进行鉴定，该菌株在GP2鉴定板上培养4～6h和16～24h时的读数相似值(SIM值)均为0.930，符合Biolog系统关于理想结果的要求且鉴定结果的相似性(PROB)均为99％。因此，采用Biolog系统鉴定菌株JYZ-SD1为蜡状芽孢杆菌和苏云金杆菌(Bacillus cereus/thuringiensis)。
JYZ-SD1菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No.1所示。
将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，JYZ-SD1菌株与芽孢杆菌(Bacillus)同源性都很高，其中与Bacillus cereus的相似度为100％。结合形态、Biolog、生理生化及16SrDNA序列分析，JYZ-SD1菌株鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
JYZ-SD1菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂明显促进了杨树的生长发育。
有益效果：JYZ-SD1菌株在蛋黄平板培养条件下，在菌落周围可产生明显溶磷圈；JYZ-SD1菌株在液体振荡培养条件下，对卵磷脂具有较好降解效果，与对照(CK)相比，差异显著；JYZ-SD1制成菌剂接种NL-895杨扦插苗和美洲黑杨实生苗，结果表明，该菌剂明显促进杨树苗的生长发育。因此，本发明为开发杨树磷细菌肥料提供了优良的菌株资源。
【附图说明】
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)JYZ-SD1，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：M 209096，保藏日期：2009年5月4日。
图1为液体培养条件下JYZ-SD1菌株对卵磷脂的降解能力；
图2为蛋黄平板上JYZ-SD1菌株产生的溶磷圈；
图3为JYZ-SD1菌剂对美洲黑杨实生苗促生效果。
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：菌株JYZ-SD1平板解磷能力测定
卵黄培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15.0～18.0g，pH 7.0，灭菌，待温度降至50℃左右时，每50mL中加入3～4mL新鲜蛋黄液(蛋黄与无菌生理盐水等体积混合)，混匀，倒平板。
将活化2次的JYZ-SD1菌株用灭菌牙签点接于卵黄平板上，30℃培养3天后，测量溶磷圈与菌落直径，并计算溶磷圈与菌落直径之比(图2)。
从图2中看出，JYZ-SD1菌株在卵黄平板上培养后，可产生明显不透明的溶磷圈。经测量与计算，溶磷圈直径为25.81mm，菌落直径为4.28mm，溶磷圈与菌落直径比高达6.03。
实施例2：菌株JYZ-SD1液体解磷能力测定
蒙金娜解有机磷培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸钙5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0
将活化2次的JYZ-SD1菌株接种NA培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15.0～18.0g，pH 7.2～7.4)中，30℃培养2天后，无菌水冲洗菌体制成菌悬液，取1mL菌悬液于含50mL蒙金娜培养基的100mL三角瓶中，以接1mL灭菌菌悬液的蒙金娜培养基为对照(CK)，每个处理3个重复，30℃，180r·min-1振荡培养72h后，发酵液4℃，10000r·mi-1离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量(图1)。
从图1中可看出，接种JYZ-SD1菌株发酵液中可溶性磷含量为1.94mg·L-1，是对照(0.37mg·L-1)的5.17倍。综上表明，JYZ-SD1菌株对卵磷脂具有较强地降解能力。
实施例3：菌株JYZ-SD1温室盆栽试验
将菌株JYZ-SD1活化2～3次后，用接种环挑取少量菌体接种于含有50mL NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)100mL三角瓶中，30℃，180r·min-1振荡培养72h。发酵液(4℃，6000r·min-1)离心5min，用无菌生理盐水润洗菌体2～3次后，用无菌生理盐水调节菌悬液(7～8×108cfu/mL)制成菌剂。分别接种NL-895扦插苗和美洲黑杨实生苗(苗龄60天)，以等量无菌生理盐水为对照，接种量为扦插苗15mL/株、实生苗5mL/株。每处理6个重复，置于温室统一管理，光照为12h/天，适时浇水。
NL-895杨扦插苗150天生长情况(见表1)。从表1可看出，接种JYZ-SD1菌剂明显促进了NL-895扦插苗的生长。接种处理NL-895杨的苗高、茎粗、鲜重和干重与CK相比均有不同程度的增长。其中，苗高和茎粗比CK分别增长了38.14％和15.93％；鲜重和干重比CK分别增长了83.89％和72.22％。
表1JYZ-SD1对NL-895杨扦插苗的生长及生物量
注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著
美洲黑杨实生苗90天生长情况(见表2及图2)。从表2可看出，接种JYZ-SD1菌剂明显促进了美洲黑杨实生苗的生长。接种处理的美洲黑杨实生苗的苗高、地径、鲜重和干重与CK相比均有不同程度的增长。其中，苗高和地径比CK分别增长了55.32％和24.06％；鲜重和干重比CK分别增长了121.72％和269.44％。
表2JYZ-SD1对美洲黑杨实生苗的生长及生物量
注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著
SEQUENCE LISTING
<110>南京林业大学
<120>一种蜡状芽孢杆菌及其在促进杨树生长中的应用
<130>FP090501
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1323
<212>DNA
<213>Bacillus cereus
<400>1
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