用于筛选抗结核药物的组合物和方法 【技术领域】
本发明涉及用于药物筛选的组合物，具体地，通过建立用于筛选以泛酸合成酶为靶点的抗结核药物的组合物和方法，进而可以快速、经济地进行抗结核药物筛选。
背景技术
当前结核病卷土重来，发病与死亡人数明显回升。结核病成为与AIDS、疟疾并称的传染病三大杀手之一[10]；结核又与艾滋相互加重病情，已成为HIV感染者死亡的首要原因；而且结核耐药性(resistance)[11]日趋严重，如还不能有效控制耐药结核菌的产生与蔓延，将有可能导致世界范围内的结核病大流行[12]。我国是全球结核病疫情最为严重的国家之一，结核患者人数居世界第二，而且结核耐药形势十分严峻，所有传统的抗结核药物都出现了不同程度的耐药，多药耐药菌比例已超过WHO规定的警戒线。然而在过去的三、四十年里未开发出新型高效的抗结核药物，加速研制新型抗结核药物，克服耐药及多药耐药菌感染，迫在眉睫。
泛酸作为辅酶A和酰基载体蛋白所必需的前体物质，构成辅酶A和酰基载体蛋白分子中的磷酸泛酰巯基乙胺部分，而辅酶A和酰基载体蛋白在脂代谢、能量代谢中具有重要的作用，与细菌的生长和繁殖密切相关。对于结核杆菌而言，脂类合成具有更特殊的意义：其一，是结核杆菌对化学药剂等具有更强抵抗力得益于其细胞壁中含有大量的蜡状脂质层；另一方面结核菌的毒性和在体内组织的特异性繁殖与脂类合成密切相关。已有的研究表明：结核杆菌细胞壁中含有一种复杂的脂类物质(PDIM)决定了结核杆菌的毒性，缺乏PDIM的结核杆菌不能感染肺组织，只能在肝脏和脾脏内繁殖，不能形成肺结核[1]。由于泛酸合成途径仅存在于细菌、真菌和植物体中，人等高等动物中不存在该途径，所需的泛酸是从食物中直接摄取(Maas 1960)。因此，泛酸合成途径可能成为理想的抗结核药物作用靶点，作用于该靶点的药物不仅可抑制结核杆菌的生长与繁殖，还可降低结核杆菌毒性，同时还具有很好的选择毒性。
2003年，Shuishu Wang等的研究表明了泛酸的生物合成决定结核杆菌毒性的产生[2]；Zheng和Blanchard的研究表明抑制泛酸的生物合成，将抑制结核杆菌的脂类代谢[3]；Nature Medicine发表了Jacobs的研究结果：无论是在免疫缺陷还是在免疫正常的小鼠体内，泛酸营养缺陷型的结核杆菌都基本上丧失了其毒性，感染泛酸缺陷变株的小鼠的生存期相对于感染结核标准菌株H37Rv，延长了7倍多[4]。这些研究结果证明了泛酸的合成对于结核杆菌生存、繁殖及致病性至关重要，也证明了泛酸合成途径是理想的抗结核药物靶点。
在泛酸合成途径中，共有酮泛解酸羟甲基转移酶(ketopantoatehydroxymethylase)、泛酸合成酶(pantothenate synthetase)、L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase)和酮泛解酸还原酶(ketopantoate reductase)四个主要的酶参与，分别由panB、panC、 panD、panE编码，其中由panC编码的泛酸合成酶(PS)催化泛酸合成的最后一步反应，是该途径中的限速酶，抑制PS可有效地阻断结核杆菌的泛酸生物合成[4]。
目前对PS的基础研究已经取得了极大的进展，明确了PS为66KD，由panC编码，编码基因长度约为930bp，PS基本上是以同型二聚体的形式存在。2003年Howard Hughes Medical Institute的研究者测定了泛酸合成酶的晶体结构，发现了该酶的结构域[3]；同年Williams L等采用定位同位素交换(positional isotope exchange，PIX)的方法证明了泛酸合成酶催化泛酰基腺苷酸酯(pantoyl-adenylate)中间体的形成[5]；2004年Albert Einstein医学院的Zheng R等阐明了结核杆菌泛酸合成酶在形成和稳定腺苷酸所必需的活性位点[6]；2006年美国公共卫生研究院(PHRI)的学者鉴定了泛酸合成酶及其反应过程中酶与底物形成的各种复合物的晶体结构，为设计抑制剂提供了理论基础[7]。同年有报道说美国SRI(Southern Reseach Institute)拟开展以泛酸合成酶为靶点的抗结核杆菌药物研究，2007最新地资料报道了他们从4080个化合物中筛选出一种新的结核杆菌合成酶抑制剂[8]。与此同时，有些学者正致力于研究开发抑制泛酸激酶的抗菌药物，并发现了金黄色葡萄球菌的泛酸激酶抑制剂具有理想的抑菌和杀菌活性，其MIC值可达到1μg/ml[9]，也从另一侧面佐证了泛酸合成途径作为抗细菌药物作用靶点的可行性。此外，Jacobs等人从阻断泛酸合成，降低结核杆菌毒性的角度探讨了研制结核疫苗的可能性，实验中所构建的ΔpanCD突变株表现出了良好的应用前景[7]。国内还没见有此类研究的报道。
申请人密切跟踪了有关结核菌基础研究的动态，并将研究成果应用于抗结核药物的研究中。于2006年开始了建立以泛酸合成酶为靶点的用于抗结核杆菌药物筛选的组合物和模型的研究，成功的克隆表达了结核杆菌的泛酸合成酶，获得了具有天然酶活性的表达产物，并在此基础上得到了用于筛选抗结核药物的组合物，并建立了以泛酸合成酶为靶点的抗结核药物筛选模型。所述组合物和模型的优点是：1.通量高，适用于大规模筛选：采用荧光仪的酶标板进行测定，每板可测八十个样品，每小时可测定十二板；2.操作简单，使用方便，成本较低：所需测定仪器只需具有340nm波长可控温的普通酶标仪即可，所使用的溶液稳定一次配制可长期使用，每个样品测定的成本不足一元；3.获得的药物具有高效低毒的特性：泛酸合成的代谢途径特殊并且是微生物所必需的，已有研究证明泛酸营养缺陷型的结核杆菌都基本上丧失了其毒性[4]。
【发明内容】
筛选体系的建立是通过泛酸合成酶与肌激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及相应底物混合反应，应用荧光仪测定340nm处的吸收变化。其原理如图1所示。
具体地，本发明提供了：
1.用于筛选抗结核药物的组合物，其中含有泛酸合成酶、肌激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及反应底物。
2.1的组合物，其中所述底物是ATP、β-丙氨酸、D-泛解酸、NADH和磷酸烯醇式丙酮酸钾。
3.1的组合物，其中的泛酸合成酶的终浓度50μg/mL，肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶均为3.6U/孔，反应体系的pH为7.5～8.0，反应体系的温度为37℃。
4.含有权利要求1的组合物的筛选抗结核药物的试剂盒。
5.使用1的组合物筛选抗结核药物的方法，所述方法包括步骤：
A：建立泛酸合成酶、肌激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及底物的反应体系，同时设立阳性对照和阴性对照，
B：将候选物加入到反应体系中，
C：混合后，应用荧光仪测定340nm处的吸收变化，
D：根据如下公式计算抑制率：
IR=ΔN-ΔSΔN-ΔP×100%,]]>其中：
ΔN：是阴性对照孔首次OD值与1hr后测得OD值差的平均值；
ΔP：是阳性对照孔首次OD值与1hr后测得OD值差的平均值；
ΔS：是样品孔首次OD值与1hr后测得OD值差；
E：根据抑制率选择目标候选物。
6.5的方法，其中的阳性对照是由六个梯度组成，每个梯度有两个平行，梯度中泛酸合成酶的含量由低到高分别为0μL，0.3μL，0.6μL，1.0μL，1.4μL，1.7μL分别代表对泛酸合成酶的抑制率为100％，85％，70％，50％，30％，15％，其他成分与反应体系相同。
7.5的方法，其中的阴性对照是筛选体系中用培养基或者缓冲液代替发酵液或化合物的反应体系，将其对酶的抑制率定为0％。
8.5的方法，还包括初筛和复筛步骤。
9.8的方法，其中的初筛是指：应用5所建立的反应体系对化合物或发酵液筛选，获得对泛酸合成酶、肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶中至少有一种酶有抑制作用样品的筛选过程。
10.5的方法，其中的复筛是指：在初筛基础上排除排除假阳性结果的筛选过程，具体将初筛过程中的泛酸合成酶用AMP替代。
11.5的方法，其中所述候选物包括发酵液和化合物。
12.5的方法，其中缓冲体系为Hepes，温度为37℃，pH范围为7.5～8.0。
13.1的组合物在体外大规模筛选抗结核药物中的用途。
14.1的组合物在制备用于筛选抗结核药物的试剂盒中的用途。
通过提供上述组合物和方法，实现了本发明的目的。
【附图说明】
图1表示泛酸合成酶模型测定原理。
图2表示发酵液筛选反应液的配制流程。
图3表示第一批样品筛选结果。
图4表示第二批样品筛选结果。
图5表示第三批样品筛选结果。
图6表示第四批样品筛选结果。
具体实施方案
实施例1.结核杆菌重组泛酸合成酶的克隆和表达
采用PfuDNA聚合酶，以含有结核杆菌H37Rv泛酸合成酶基因panC的质粒pET23a(+)：panC为模板，PCR扩增基因panC。引物分别为：5′端引物5′-ATTCCATATGACGATTCCTGCGTTC-3′和3′端引物5′-CCAAGCTTCCAGTTTCTCCAATGTGAT-3′，分别包含NdeI和HindIII酶切位点，为了能够使用表达载体pET-30a(+)上的HisTag，便于纯化，3′端引物在终止密码子处引入了点突变(由原来的TCA，对应终止密码子TGA，突变为CCA)。PCR产物被连接到载体上，得到克隆质粒T Easy：panC，并转化DH5α细胞。经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，提取并纯化质粒，质粒上所包含的panC基因用NdeI和HindIII双酶切获得并连接到用NdeI和HindIII双酶切消化过的pET-30a(+)质粒上，得到表达质粒pET-30a(+)：panC，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。所得细胞生长于37℃，含50μg/ml Kan的LB培养基中，待OD600到达0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，并在28℃诱导培养5个小时。
实施例2.重组泛酸合成酶的纯化
收获细胞培养液100ml，分装于2个50ml离心管中，4℃，10000g×10分钟，弃去上清，分别用20ml裂解缓冲液(50mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH8.0)悬浮，超声破碎(400W，工作时间3s，间隙8s，作用次数99次)，4℃，14000g×20分钟，上清用0.45μm滤膜过滤，所得滤液用Ni2+鳌合的HiTrap Chelating HP亲和层析柱进行亲和层析，用清洗液(50mM磷酸钠，500mM氯化钠，50mM咪唑，pH8.0)洗掉杂蛋白，再用洗脱液(50mM磷酸钠，500mM氯化钠，500mM咪唑，pH8.0)洗脱。收集对应洗脱峰的收集管。
实施例3.重组泛酸合成酶的活性分析
泛酸合成酶的活性测定原理是：泛酸合成酶催化反应得到的产物之一为AMP，AMP由肌激酶(myokinase)作用得到产物ADP，ADP和磷酸烯醇式丙酮酸钾经过丙酮酸激酶(pyruvate kinase)作用生成丙酮酸，丙酮酸由乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)作用，转化为乳酸，同时消耗NADH，由于还原态的NADH在340nm处有吸光值，而氧化态的NAD+在340nm处无吸光值，因此由荧光仪测得其吸光值的变化，从而测得重组泛酸合成酶的活性。340nm处NADH吸光值的减少是在37℃条件下由BMG荧光仪测得的[5]。
标准反应体系含有100mM Hepes，pH7.8，10mM MgCl2，10mM ATP，5mM D-pantoate(酮泛解酸)，5mM β-丙氨酸，1mM磷酸烯醇式丙酮酸钾，1mM NADH，3.6单位肌激酶，3.6单位丙酮酸激酶，3.6单位乳酸脱氢酶，总体积为200μL，于37℃孵育5分钟后，加入泛酸合成酶引发反应。同时设置对照。
实施例4.使用用于筛选药物的组合物建立筛选模型的
筛选体系与酶活测定体系反应条件一致，同时在此基础上设立了阳性对照(即体系不加泛酸合成酶表示泛酸合成酶被完全抑制)和阴性对照(即体系中加入泛酸合成酶，但不加任何可能抑制泛酸合成酶的成分)。
实施例5.抑制剂的筛选
对化合物和发酵液分别进行了初筛和复筛，得到的阳性样品再经野生型耻垢分枝杆菌进行活性检测。
对化合物库中化合物的稀释
首先，是将化合物稀释100倍；该步骤分两步稀释：第一步，先将化合物稀释10倍，得到浓度为1mg/ml的化合物溶液；第二步，将1mg/ml的化合物溶液再稀释10倍，得到100μg/ml的化合物溶液。第三步稀释将在筛选体系配制过程完成，即每孔200μl的测定体系中加入20μl 100μg/ml的化合物溶液，使得最终化合物浓度为10μg/ml。
具体地，初筛具体反应步骤如图2所示。包括：
按照图2将Hepes、MgCl2 ATP、β-丙氨酸、D-泛解酸、肌激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、ATP、NADH和PEP-K(磷酸烯醇式丙酮酸钾)混合(总体积达到每孔200μl)；
1.发酵液与泛酸合成酶充分混合后37℃孵育30分钟；
2.向孵育后的混合物中加入含有后三种酶的混合溶液118μl并混合均匀；
3.将96孔板置入Polarstar荧光仪中，测定340nm处的吸收值；
4.37℃孵育60分钟；
5.再次将96孔板置入Polarstar荧光仪中，测定340nm处的吸收值；
6.根据如下公式计算抑制率：
IR=ΔN-ΔSΔN-ΔP×100%]]>
其中：
ΔN：是阴性对照孔首次OD值与1hr后测得OD值差的平均值；
ΔP：是阳性对照孔首次OD值与1hr后测得OD值差的平均值；
ΔS：是样品孔首次OD值与1hr后测得OD值差。
抑制率(IR)大于或等于50％，即认定为阳性。
复筛
用AMP直接代替泛酸合成酶以引发反应，以排除体系中因抑制泛酸合成酶而产生阳性的可能。如果体系还是呈现阳性结果，则说明“初筛阳性样品”是假阳性，反之，则为阳性。
操作步骤与初筛相同，唯一不同在于用900μl的100mM的AMP代替90μl的泛酸合成酶。
五、细胞活性验证
由上述模型筛选得到的阳性样品，只能说明其是结核杆菌泛酸合成酶的抑制剂，是否能有效杀灭结核杆菌还需要进行细胞活性的验证。鉴于结核杆菌生长缓慢，且具有很强的致病性，实验室条件下用结核杆菌进行验证是不可行的。为此申请人采用了与结核杆菌具有相近遗传特性、同为分支杆菌属的耻垢分支杆菌作为替代菌，进行细胞水平的验证。具体做法是：使用营养琼脂平板法验证上述筛选步骤获得的阳性样品对耻垢分支杆菌的抑制活性。对于能抑制耻垢分支杆菌生长的样品再进行结核杆菌的细胞学验证。
六、已取得的技术效果
应用泛酸合成酶模型对化合物和发酵液样品进行了筛选(图3，4，5，6)筛选结果如下所示：
目前申请人共筛选了5600个微生物发酵液，初筛得到抑制率在50％以上的发酵液有162个，经过复筛排除掉47个假阳性结果，得到115个阳性发酵液，可以进行细胞活性实验验证，验证菌采用了野生型耻垢分支杆菌通过测定发酵液对该菌的抑菌圈大小来取舍发酵液。初步得到有活性的菌株一个编号为601(中国医学科学院医药生物技术研究所菌种保藏中心编号)。应用小纸片(直径7mm)测得抑菌圈为23mm。
对化合物库的2400个化合物进行筛选，得到17个阳性化合物，复筛排除一个假阳性化合物，得到16个有进行细胞活性检测前景的化合物。经过检测得到化合物库编号为2035-D7，2036B-F8和2026---F5具有抑菌效果，可以进行累积样品并对作用机理进一步研究。初筛时会有抑制率大于100％和负值的情况出现，是因为有些发酵液本身无法得到澄清液，在静止放置一小时后会沉淀在底部使吸收增大，依据浊度不同会得到以上两种情况。负值产生的另外一个原因是部分菌种在发酵时产生一些成分未知的物质，在反应开始时数值高于阳性对照很多，在反应进行以后340nm处的吸收改变大于了阴性对照产生负值。根据这些特殊数值产生的原因可以将这些发酵液或化合物视为阴性结果。
工业实用性
本发明提供了一种可重复使用的、成本低，噪音低的以泛酸合成酶为靶点的用于抗结核药物筛选的组合物和药物筛选方法。
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