一种表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌及其构建方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种表达木聚糖酶的工程菌及其构建方法与应用，具体地说，是涉及一种能够表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌株及其构建方法与应用。
背景技术
木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1，4木聚糖苷键的酶系。该酶是一种重要的工业用酶，可广泛应用于食品、饲料、酿造、医药和造纸等行业。特别是在制浆造纸工业中该酶用于纸浆漂白，能够增加纸张白度，改善纸张性能，降低漂白用化学物质的用量，从而有效减轻造纸业对环境造成的巨大污染。
目前商业化的木聚糖酶多为酸性或中性木聚糖酶，而生物漂白时在60℃左右、碱性条件下进行纸浆处理，生物漂白工艺从技术经济性方面考虑要求使用木聚糖酶在较高温度和宽泛pH条件下具有较高活性。因此，筛选或者构建耐热、耐碱的木聚糖酶成为当今研究的热点之一。
中国农科院姚斌等人对Streptomyces olivaceoviridis的木聚糖酶XYNB进行定点突变，发现突变酶N13D和S40E在70℃处理5min，热稳定性比原酶分别提高了24.76％和14.46％；突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22％，最适pH从5.2上升到5.8。
2008年江南大学李武等人对宇佐美曲霉(Aspergillus usam ii)E001的木聚糖酶Xyn II进行定点突变，结果显示Xyn IID37N的最适pH由4.2升高到5.3，pH稳定范围由3.0～7.5缩减为3.0～5.5，但最适温度和热稳定性基本保持不变。这一结果说明第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点第37位Asp，该位点与木聚糖酶的pH特性有关。
2004年Fred等人，对Trichoderma reesei的木聚糖酶II进行了定点突变，构建了突变子Y5(T2C，T28C，K58R，+191D)，结果显示，突变酶在65℃的半衰期由40s升高到20min，在70℃时的半衰期由小于10s升高到6min，而pH稳定性和野生型酶保持一致。随后，Fred等人在Y5的基础上，又构建了几个突变子：P9(N97R+F93W+H144K)，P12(H144C+N92C)，P15(F180Q+H144C+N92C)和P21(H22K+F180Q+H144C+N92C)。这几个突变酶的pH稳定性都有不同程度的提高，β-折叠片的B6b和B9区域对于酶的稳定性十分重要，尤其是对耐热性。
2005年Jian-Yi Sun等人，用Thermomonospora fusca木聚糖酶A(TfxA)的N-末端替代Aspergillus niger木聚糖酶A(AnxA)的相应位置，构建一个杂合的木聚糖酶，叫做ATx。试验结果表明，杂合酶的耐热性提高，在pH3.0～10.0，25℃条件下保育1h，ATx的残留酶活全部在80％以上，因此，AnxA的耐热性和催化活性都提高了。
2008年Seok等人，认为催化残基的pKa值直接影响着酶的最适pH，因此通过pKa的计算可以确定突变位点并且预测突变酶所具有的pH稳定性。他们以Bacillus circulans木聚糖酶(BCX)为基础构建了两个突变子：A115X和S84X。其中A115X突变酶的活性下降，可能是破坏了酶与底物结合过程中酶结构恰当的改变。因此也说明了，离催化位点远的氨基酸残基对催化位点的氨基酸残基的pKa值和BCX的最适pH也具有十分重要的作用。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌，以实现有效节约酶应用中pH和温度控制带来的酸碱和能耗成本、实现木聚糖酶在纸浆漂白和低聚木糖生产的工业化应用价值。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述酵母工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述酵母工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)。已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：武汉武汉大学；邮编：430072；登记入册的编号：CCTCCNO：M209148；保藏日期：2009年7月14日。
上述的表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌，为分泌型巴氏毕赤酵母重组菌株。在分泌型巴氏毕赤酵母重组菌株中转化有重组突变质粒pPIC9KXYN17，该重组突变质粒pPIC9KXYN17以三磷酸甘油醛脱氢酶基因(DQ465985)为启动子，并含有木聚糖酶基因(XYN II)(S67387)和ZeocinTM抗性基因(Z46234)。
一种构建上述表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌的方法，包括以下步骤：
(1)应用常规重组质粒构建方法构建出重组质粒pPIC9K-XYN II；
(2)应用引物设计软件，以重组质粒pPIC9K-XYN II为模板，设计三个突变引物，分别为：
T2C-gtggagaagcgccagtgcattcagcccggcacg；
T28C-cggcgtgacgta ctgcaatggtcccggc；
S156F-cggcgaaccacttcaacgcgtgggc；
(3)采用Stratagene公司的多重定点突变试剂盒，以重组质粒pPIC9K-XYN II为模板，应用步骤(2)中设计的引物，将模板的第2和28位的苏氨酸突变为半胱氨酸，进而在这两个氨基酸之间形成二硫键将该酶地N-末端序列与相邻的β-链相连，并且将第156位丝氨酸突变为苯丙氨酸；制备出重组突变质粒pPIC9KXYN17；
(4)将重组突变质粒pPIC9KXYN17用Sal I酶切线性化后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，即构建成表达木聚糖酶的毕赤酵母重组菌株。
(5)将步骤(4)构建的重组菌株，经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即选出高效表达木聚糖酶的重组工程菌。
其中，步骤(1)中，所述的重组质粒pPIC9K-XYNII是目的基因XYNII插入到质粒pPIC9K中形成的重组质粒。具体方法参见Invitrogen公司的Multi-Copy PichiaExpression Kit操作手册。
步骤(2)中，引物设计软件采用Stratagene公司的在线引物设计软件Primer Design Program。
步骤(4)中，在将重组突变质粒pPIC9KXYN17用Sal I酶切线性化之后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中之前，可将突变质粒pPIC9KXYN17导入大肠杆菌进行扩增。
上述表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌在生产高稳定性木聚糖酶中的应用。
将制备的高效表达木聚糖酶的重组工程菌在BMG培养基中，28～30℃培养至细胞密度OD600达到2～6，用BMM重悬细胞至OD600＝1.0，进行诱导表达。经72小时诱导培养(每隔24小时向培养基添加100％甲醇至终浓度为1.0％)，将完成培养的酵母基因工程菌经离心除去菌体，收集上清液，以分子量为10KD的超滤管，滤去小分子量蛋白和盐，经过分子筛Superdex 75prep grade纯化，使用去离子水，流速0.5ml/min洗脱，分布收集洗脱峰中的样品，经过酶活测定，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目标蛋白。
本发明使用基因突变的方法提高木聚糖酶基因XYN II编码产物的工业应用稳定性；通过定点诱变，获得突变基因，该突变的木聚糖酶基因在毕赤酵母表达后热稳定性和pH稳定性大幅度提高，通过基因工程的手段构建高效表达重组木聚糖酶的酵母基因工程菌，并从中培养分离纯化制取耐热耐碱的重组木聚糖酶。
有益效果：本发明所得到的突变木聚糖酶(以下记为HA17)与未突变木聚糖酶(以下记为H9K+-3)进行酶学性质比较，比酶活由原来的203IU/mg增加到856IU/mg，最适反应pH不变，为5.0(pH5.0-6.0基本一致)；最适反应温度由50℃提高到60℃(55-65℃基本一致)，原酶60℃2min酶活降至59％，突变酶60℃20min酶活没有下降；70℃半衰期由1分钟提高到14分钟，在50℃60min下的pH稳定范围由5.0～7.0扩展到4.0～10.0。
【附图说明】
图1是重组质粒pPIC9K-XYN II的结构示意图。
图2是多重定点突变方法的流程图。
图3是经纯化酶液的SDS-PAGE图谱。
图4是突变木聚糖酶与未突变木聚糖酶的最适反应温度。
图5是pH对木聚糖酶活的影响。
【具体实施方式】
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：重组质粒的构建。
构建出重组质粒pPIC9K-XYN II(Invitrogen公司的Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册)，其结构示意图如图1所示，该重组质粒pPIC9K-XYN II是目的基因XYN II插入到质粒pPIC9K中形成的重组质粒，以后的突变操作就是在该重组质粒上完成的。
实施例2：重组质粒的定点突变。
应用Stratagene公司的在线引物设计软件Primer Design Program，以重组质粒pPIC9K-XYN II为模板，设计三个突变引物，分别为：
T2C-gtggagaagcgccagtgcattcagcccggcacg；
T28C-cggcgtgacgta ctgcaatggtcccggc；
S156F-cggcgaaccacttcaacgcgtgggc；
对重组质粒pPIC9K-XYN II的第2位、28位和156位氨基酸进行定点突变，制备出重组突变质粒pPIC9KXYN17。其中，第2位和28位的苏氨酸突变为半胱氨酸，进而在这两个氨基酸之间形成二硫键将该酶的N-末端序列与相邻的β-链相连；第156位丝氨酸突变为苯丙氨酸；基因定点突变反应体系如表1所示，PCR反应参数如表2所示。
PCR结束后，经过Dpn I消化，将突变质粒转化进大肠杆菌体内，采用TaKaRa公司的质粒DNA小量纯化试剂盒提取质粒，送到金思特公司测序，选出想要得到的质粒。
该多重定点突变方法流程如图2所示。第一步，以设计好的突变引物为指导并以质粒pPIC9K-XYN II为模板进行PCR扩增；第二步，将扩增好的质粒用DpnI酶进行消化，除去和母链相同的DNA链，得到只含有突变位点的DNA链；第三步，将消化好的质粒DNA转化进XL10-Gold感受态细胞中进行扩增。
表1基因定点突变反应体系
表2PCR反应参数
实施例3：目的DNA的准备及毕赤酵母的电转化。
将所得到的大肠杆菌转化子培养，提取质粒，采用Sal I进行酶切，通过酚抽提和乙醇沉淀得到线性的目的DNA；制取毕赤酵母的电感受态细胞；将80μl的电感受态细胞与10μl的线性化DNA混合，转入0.2cm电转化杯中，在电压2.0KV条件下进行电击。
实施例4：转化子的筛选。
(1)酵母转化子的甲醇利用表型的筛选。
用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD平板上以一定的方式划线或点His+转化子，确保先在MM平板上点；为分离Mut+及Muts表型，在MD及MM平板上各点上对照(GS115/His+MutsAblumin)及(GS115/His+Mut+β-gal)；30℃，孵育2天；两天后，观察菌落的大小并计数，筛选在MD平板和MM平板上均能正常生长的酵母转化子(表型即为His+Mut+)。
(2)外源基因多拷贝整合转化子筛选。
制备适量YPD培养基，高温灭菌后冷却至55℃～60℃，按表3加入适当体积的100mg/mlG418贮备液，立即混匀铺制平板，以制备含不同浓度G418(0mg/ml，0.25mg/ml，0.75mg/ml，1.00mg/ml，1.50mg/ml，2.00mg/ml，3.00mg/ml，4.00mg/ml)的YPD平板，注意减少气泡产生；准备96孔细胞培养板，在每个孔中加入200μl YPD；用灭菌牙签在第一组平板中每孔接种单个HIS+转化子，轻轻搅动以悬浮细胞；盖住96孔板在30℃孵育2天；2天后，取新的96孔板，每孔加入190μl YPD；用移液器从第一组板中吸取10μl培养液于对应的第二组板中；盖住第二组板，30℃孵育过夜；第二天，在第三组板中重复第二组板的操作；孵育后，取第三组板，用移液器吸取孔中的培养液上下吹打重新悬浮细胞；取10μl每孔中液体点在含遗传霉素浓度为0，0.25，0.5，0.75，1.00，2.00，3.00，4.00mg/ml的YPD平板上；待液体吸收，30℃培养2～5天，每天检查菌落生长情况；挑取具有G418抗性的菌落，在YPD平板上划线进行纯化处理。
表3G418贮备液
(3)重组酵母菌表达。
挑取单克隆，接种至25ml MGY，BMG或BMGY中，28-30℃，250-300rpm摇至OD600＝2-6；室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600＝1.0，进行诱导表达；在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布，放入摇床继续生长；每24小时，加甲醇至终浓度为1.0％以继续诱导；72小时结束表达，收集发酵液，测定酶活性。
酶活单位定义：1个木聚糖酶活性单位(IU)为1％可溶性木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma From Birchwood)为底物，每分钟在pH4.8、50℃条件下分解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量。
实施例5：重组木聚糖酶的纯化。
酵母发酵液经4000rpm/min离心10分钟，把上清液通过分子量为10KD的超滤管进行超滤，滤去一些小分子蛋白和盐，取超滤过的液体2ml，经过分子筛Superdex 75prep grade纯0化，使用去离子水，流速0.5ml/min洗脱，分布收集洗脱峰中的样品，经过酶活测定，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目标蛋白。如图3所示，是经纯化酶液的SDS-PAGE图谱。其中M为标准分子量蛋白，1为HA17，2为H9K+-3，3为HA17用去糖基化酶处理(因为未处理过的HA17有两条带，经去糖基化酶处理后只剩一条带，说明另外一条带是被糖基化了的酶)，4为去糖基化酶(Deglycosylase)。
实施例6：酶学性质的分析与比较。
将纯化后的突变酶与野生型酶进行酶学性质的比较研究。包括酶的最适温度和热稳定性、最适pH和pH稳定性、比活性等。比酶活由原来的203IU/mg增加到856IU/mg，最适反应pH不变，为5.0(pH5.0-6.0基本一致)；最适反应温度由50℃提高到60℃(55-65℃基本一致)，原酶60℃2min酶活降至59％，突变酶60℃20min酶活没有下降；70℃半衰期由1分钟提高到14分钟，在50℃60min下的pH稳定范围由5.0～7.0扩展到4.0～10.0。
图4为突变木聚糖酶与未突变木聚糖酶的最适反应温度，从图中可得知，最适反应温度由50℃提高到60℃。图5为pH对木聚糖酶活的影响，在50℃60min下的pH稳定范围由5.0～7.0扩展到4.0～10.0。其中，在不加底物条件下，将酶置于50℃水浴温育30分钟后测定酶活。
SEQUENCE LISTING
<110>南京林业大学
<120>一种表达高稳定性木聚糖酶的酵母工程菌及其构建方法与应用
<130>njfu090724
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>T2C
<400>1
gtggagaagc gccagtgcat tcagcccggc acg 33
<210>2
<211>28
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