一种定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒 【技术领域】
本发明涉及一种定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒。
背景技术
95％的慢性髓性白血病(CML)、25-30％的成人急性淋巴细胞性白血病(ALL)及2-5％的儿童ALL患者均具有特征性的Ph染色体，由t(9；22)交互异位形成，分子水平表现为22号染色体上的BCR基因与9号染色体上的ABL基因形成BCR/ABL融合基因。ABL基因上的断裂点集中于外显子1b上游、1b与1a之间或a2上游，在mRNA水平上ABL融合部分均为a2。BCR基因上的断裂点主要集中于以下三个区域：跨越外显子12-16的5.8kb区域，即M-BCR区；第1内含子上的55kb区域，即m-BCR区和第19内含子上，即μ-BCR区。由于BCR基因上断裂点的不同导致翻译出不同分子量大小的BCR/ABL融合蛋白，分别为：P210BCR/ABL融合蛋白、P10BCR/ABL融合蛋白和P230BCR/ABL融合蛋白。CML患者BCR/ABL融合基因基本为M-型，个别为μ-型，m-型极少见。35％成人及20％儿童Ph(+)ALL的BCR/ABL融合基因大多为M-型，其余为m-型。采用PCR技术检测BCR/ABL融合基因对于在CML和ALL的诊断及治疗过程中微小残留病(MRD)的监测具有重要的应用价值。
近几年发明的实时定量PCR技术(RQ-PCR)实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃。与普通PCR相比，RQ-PCR除了能够定量之外还具有以下优点：(1)通过在PCR反应体系中加入探针或通过制作熔解曲线，使特异性增强、灵敏度提高；(2)扩增过程中闭管操作，实时收集数据，降低了污染机会，减少假阳性结果；(3)无需电泳，缩短了操作时间；(4)通过定量内参基因来评价样本质量，减少了假阴性结果。基于TaqMan探针的RQ-PCR技术关键之处在于：PCR反应体系中除了上、下游引物外还加入了TaqMan探针，该探针的5′端和3′端分别标有荧光报告基团(如FAM或TET)和荧光淬灭基团(如TAMRA)。PCR反应前，探针完整，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团淬灭；随着PCR反应的进行，Taq酶发挥5’→3’的外切活性，使切下来的荧光报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号，荧光信号的强度与初始模板DNA的量成正比，当荧光信号强度大于阈值(基线以上10个SD)时，即可被荧光探测器定期实时监测，每个样本的CT值(PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数)与起始模板量的对数值成正比，可以根据CT值利用标准曲线分别计算出目的基因及内参基因的量，二者相除的比值即为目的基因的相对水平。
要计算出起始模板的量必须利用标准曲线，标准曲线的制作是采用经过系列稀释的已知起始量的标准品进行RQ-PCR，标准品可以是已知质量的cDNA或已知拷贝数的质粒，前者制作比较简单，但是得到的未知样品结果不直观，较难理解；而质粒标准品尽管制备比较繁琐，但是利用它可以计算出未知样品的拷贝数，且结果直观，是目前应用最广泛的标准品类型。
内参基因选择的目的是为了消除不同样本之间mRNA质量、数量以及逆转录效率等方面的差异，内参基因的选择有以下三大要求：(1)在所有有核细胞中均稳定表达，与分化系列及分化阶段无关，不受实验处理的影响；(2)不存在假基因；(3)表达水平及降解水平与目的基因一致。
采用RQ-PCR技术检测BCR/ABL mRNA水平的临床应用价值主要体现在以下三大方面：(1)诊断：最新的WHO诊断标准要求，必须检测到Ph染色体或BCR/ABL mRNA才能诊断为CML，因此所有的CML患者分子水平都应存在BCR/ABL融合基因。RQ-PCR技术检测BCR/ABL mRNA水平与染色体核型分析可以互为补充，克服隐匿异位等影响，大大提高CML的正确诊断率。(2)预后：Ph(+)ALL患者的预后很差，必须进行造血干细胞移植才能长期存活。采用RQ-PCR技术检测患者BCR/ABL mRNA水平可以将患者分层，有助于临床治疗方案的选择。(3)MRD的监测：目前对CML及Ph(+)ALL患者的治疗已经有造血干细胞及ABL酪氨酸激酶抑制剂(如格列卫Glivec)等有效方法，可以使相当多的患者获得遗传学完全缓解，其后MRD的监测只能依靠目前公认的最敏感的RQ-PCR技术。RQ-PCR技术检测出的BCR/ABL mRNA水平不仅反映出患者体内地白血病负荷，而且特定时间里BCR/ABL mRNA水平的下降程度与长期疗效相关。MRD水平的确定是疗效评价、治疗方案选择(如提高药物剂量、针对移植患者的供者淋巴细胞输注等临床干预措施)的重要依据，对于预防临床复发、提高患者缓解率、治愈率及生存率具有重要的意义。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒。
本发明所提供的定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系和下述三种实时定量PCR体系中的至少一种：M-型BCR/ABL实时定量PCR体系、m-型BCR/ABL实时定量PCR体系和μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系；
所述M-型、m-型和μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系均包括上游引物、下游引物和TaqMan探针，所述M-型BCR/ABL实时定量PCR体系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述m-型BCR/ABL实时定量PCR体系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示；所述μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系中，上游引物的核苷酸序列如序列表中序列7所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列8所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列9所示。
所述内参基因优选为ABL基因，以ABL基因作为内参基因时，所述内参基因实时定量PCR体系包括上游引物、下游引物和TaqMan探针，所述内参基因实时定量PCR体系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列10所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列11所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列12所示。
上述内参基因实时定量PCR体系、M-型、m-型和μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系中还可包括荧光PCR的Master Mix。
本发明中，上述M-型BCR/ABL、m-型BCR/ABL、μ-型BCR/ABL及内参基因四种实时定量PCR体系中的TaqMan探针的3′端连接有荧光淬灭基团TAMRA，5′端连接有荧光报告基团FAM。
上述定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒中的标准品为含有ABL基因的质粒标准品，所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列13所示。
为了方便使用，上述定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒还包括阴性对照、M-型、m-型和μ-型BCR/ABL阳性对照。
本发明的定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒具有以下特点：
1、覆盖面广：本试剂盒包含检测M-型BCR/ABL、m-型BCR/ABL和μ-型BCR/ABL的引物和探针，基本覆盖了CML及ALL患者可能的BCR/ABL融合基因类型，提高了阳性检出率。
2、敏感度高：可重复敏感度为5个拷贝。
3、成本低：实验体系仅为10μl，各成分用量均减少一半以上，从而使成本明显降低。此外，检测目的基因及内参基因共用一条标准曲线，既简便又降低成本。
4、实用性强：本试剂盒同时包括内参基因实时定量PCR体系及质粒标准品，可同时定量出样本中BCR/ABL融合基因及内参基因ABL的拷贝数，最终计算出样本BCR/ABL mRNA水平。
5、使用简便：使用时只需加入待测样品的cDNA即可开始PCR反应。
6、储存期长：-20℃条件下可以长期保存(＞1.5年)，且不影响检测效果。
本发明的试剂盒可以准确、快速、定量测定各型BCR/ABL mRNA水平，用于慢性髓性白血病及表达BCR/ABL的急性淋巴细胞性白血病的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为临床疾病的确诊、治疗方案的确定、疗效评价及预后提供重要的分子依据。
【附图说明】
图1为利用内参基因实时定量PCR体系扩增1×106-1×102拷贝的ABL质粒标准品制备的标准曲线
【具体实施方式】
如果两种基因的PCR扩增效率一致，那么分别利用它们的质粒标准品制作的两条标准曲线也是一样的，即标准曲线的斜率及纵截距与基因类型无关。因此本发明在验证目的基因BCR/ABL和内参基因ABL的PCR扩增效率一致后，采用一条标准曲线同时定量目的基因和内参基因的拷贝数，这样不仅简便经济，更可以消除质粒定量带来的差异，提高RQ-PCR的准确度。
实施例1、定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒的制备
一、定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒中引物和探针的设计
M-型BCR/ABL实时定量PCR体系组成如下：
(1)上游引物(位于BCR外显子13)：5’-CCGCTGACCATCAATAAGGAA-3’(序列表中序列1)，终浓度为0.3μM；
(2)下游引物(位于ABL外显子2)：5’-CTCAGACCCTGAGGCTCAAAGT-3’(序列表中序列2)，终浓度为0.3μM；
(3)TaqMan探针(位于ABL外显子2)：5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’(序列表中序列3)，终浓度为0.2μM；
(4)荧光PCR的Master Mix(购自美国ABI公司)。
m-型BCR/ABL实时定量PCR体系组成如下：
(1)上游引物(位于BCR外显子1)：5’-CTGGCCCAACGATGGCGA-3’(序列表中序列4)，终浓度为0.3μM；
(2)下游引物(位于ABL外显子2)：5’-CACTCAGACCCTGAGGCTCAA-3’(序列表中序列5)，终浓度为0.3μM；
(3)TaqMan探针(位于ABL外显子2)：5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’(序列表中序列6)，终浓度为0.2μM；
(4)荧光PCR的Master Mix(购自美国ABI公司)。
μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系组成如下：
(1)上游引物(位于BCR外显子19)：5’-CGGACATCCAGGCACTGAA-3’(序列表中序列7)，终浓度为0.3μM；
(2)下游引物(位于ABL外显子2)：5’-CTCAGACCCTGAGGCTCAAAGT-3’(序列表中序列8)，终浓度为0.3μM；
(3)TaqMan探针(位于ABL外显子2)：5’-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-3’(序列表中序列9)，终浓度为0.2μM；
(4)荧光PCR的Master Mix(购自美国ABI公司)。
内参基因实时定量PCR体系组成如下：
(1)上游引物(位于ABL外显子2)：
5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’(序列表中序列10)，终浓度为0.3μM；
(2)下游引物(位于ABL外显子3)：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA 3’(序列表中序列11)，终浓度为0.3μM；
(3)TaqMan探针(位于ABL外显子3)：5’-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3’(序列表中序列8)，终浓度为0.2μM；
(4)荧光PCR的Master Mix(购自美国ABI公司)。
上述M-型BCR/ABL、m-型BCR/ABL、μ-型BCR/ABL及内参基因四种实时定量PCR体系中的TaqMan探针的3′端连接有荧光淬灭基团TAMRA，5′端连接有荧光报告基团FAM。
二、ABL质粒标准品的制备
ABL质粒标准品包括1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL和1×102拷贝/μL五个浓度的质粒标准品，其具体制备方法如下：
依据标准品序列覆盖并大于RQ-PCR扩增产物的原则设计PCR扩增ABL质粒标准品的引物，具体序列为：上游引物5’-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3’，下游引物5’-GGACACAGGCCCATGGTAC-3’。提取正常人离体外周血单个核细胞的总RNA，将其反转录成cDNA并以该cDNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、回收、纯化，将纯化后的产物连接到pGEM-T Easy载体上，并转染TOP10大肠杆菌感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆。提取阳性克隆进行质粒小提并测序，测序结果表明，连接到pGEM-T Easy载体上的ABL基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列13所示。其中，自5’末端第142位-第172位为上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系的上游引物，自5’末端第210位-第237位为上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系的TaqMan探针序列，自5’末端第245位-第265位为上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系的下游引物。
将上述测序结果正确的阳性克隆进行质粒中提，并测定质粒浓度、计算质粒拷贝数、进行10倍系列稀释，最后分装成1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×101拷贝/μL，置-80℃冻存备用。
三、阴性对照质粒-WT1及M-型、m-型和μ-型BCR/ABL阳性对照的制备
1、阴性对照质粒-WT1的制备
提取1例已经确诊为急性早幼粒细胞白血病患者骨髓单个核细胞的总RNA，将其反转录成cDNA，以该cDNA为模板，以5’-ccacagcacagggtacgaga-3’和5’-ctcagatgccgaccgtacaa-3’为引物PCR扩增WT1基因。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收、纯化后的产物连接到pGEM-T Easy载体上，并转染TOP10大肠杆菌感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆。提取阳性克隆进行质粒小提并测序，测序结果表明，连接到pGEM-T Easy载体上的WT1基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列14所示。得到的测序结果正确的质粒即为阴性对照质粒-WT1。
2、M-型、m-型和μ-型BCR/ABL阳性对照的制备
分离1例来自人民医院的初诊为M-型BCR/ABL的CML患者的离体骨髓单个核细胞，提取其总RNA，并将其反转录成cDNA，该cDNA即为M-型BCR/ABL阳性对照。
分离1例来自人民医院的初诊为m-型BCR/ABL的ALL患者的离体骨髓单个核细胞，提取其总RNA，并将其反转录成cDNA，该cDNA即为m-型BCR/ABL阳性对照。
分离1例来自人民医院的初诊为μ-型BCR/ABL的CML患者的离体骨髓单个核细胞，提取其总RNA，并将其反转录成cDNA，该cDNA即为μ-型BCR/ABL阳性对照。
四、使用方法
所有待测样品均需扩增内参基因ABL，计算ABL的拷贝数并确定待测样品的质量。待测样品合格(ABL拷贝数≥30000的标本认为合格，否则需重新抽取标本再检测)的CML患者，首先扩增M-型BCR/ABL融合基因，若待测样品为阴性，再扩增μ-型BCR/ABL融合基因及m-型BCR/ABL融合基因。对于待测样品合格(ABL拷贝数≥30000的标本认为合格，否则需重新抽取标本再检测)的ALL患者，同时扩增M-型BCR/ABL融合基因及m-型BCR/ABL融合基因。具体使用方法如下：
1、取离体的待检测病人骨髓或外周血单个核细胞，提取其总RNA，并将其反转录成cDNA。
2、在9μL上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系中加入1μL步骤1的待测样品的cDNA，进行实时定量PCR反应，然后计算ABL的拷贝数并确定待测样品的质量。
对于待测样品合格(ABL拷贝数≥30000的标本认为合格，否则需重新抽取标本再检测)的CML患者，在9μL上述步骤一的M-型BCR/ABL实时定量PCR体系中加入1μL步骤1的待测样品的cDNA，进行实时定量PCR反应；若待测样品为阴性，则在9μL上述步骤一的μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系和m-型BCR/ABL实时定量PCR体系中分别加入1μL步骤1的待测样品的cDNA，进行实时定量PCR反应。
对于待测样品合格(ABL拷贝数≥30000的标本认为合格，否则需重新抽取标本再检测)的ALL患者，在9μL上述步骤一的M-型BCR/ABL实时定量PCR体系和m-型BCR/ABL实时定量PCR体系中分别加入1μL步骤1的待测样品的cDNA，进行实时定量PCR反应。
上述实时定量PCR反应的条件为：先50℃ 2min 1个循环；然后95℃ 10min 1个循环；再95℃ 15s，62℃ 1min，40个循环。
3、标准曲线的制作：在9μL上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系中分别加入1μL上述步骤二制备的拷贝数为1×106、1×105、1×104、1×103及1×102五个浓度的ABL质粒标准品，先50℃ 2min 1个循环；然后95℃ 10min 1个循环；再95℃ 15s，62℃ 1min，40个循环。制作标准曲线，其中1×102拷贝的ABL质粒标准品同时做两管平行管，其余各拷贝的ABL质粒标准品分别扩增一管。
利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系扩增1×106-1×102拷贝的ABL质粒标准品制备的标准曲线如图1所示。
4、每批RQ-PCR反应还需同时扩增阳性及阴性对照。在9μL上述步骤一的M-型、m-型和μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系中分别加入1μL上述步骤三制备的M-型、m-型及μ-型BCR/ABL阳性对照；在9μL上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系中加入1μL上述步骤三制备的阴性对照，进行实时定量PCR反应。
5、待测样品的BCR/ABL mRNA水平按照如下公式计算：
本发明的定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒的储存条件为：4℃避光储存至少2个月或-20℃避光储存1.5年。
五、本发明的定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒的敏感度、特异性和稳定性测定
1、敏感度：内参基因实时定量PCR体系、M-型、m-型和μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系的可重复敏感度均为5个拷贝
将按照上述步骤二的方法制备的5个拷贝的ABL质粒标准品各5份，分别利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系进行5次重复实验，结果每次实验中均有扩增曲线，因此本发明的内参基因实时定量PCR体系的可重复敏感度为5个拷贝。
将上述步骤三制备的M-型、m-型和μ-型BCR/ABL阳性对照分别进行系列稀释，以系列稀释后的cDNA为模板，分别利用上述步骤一的M-型、m-型和μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系进行5批次重复RQ-PCR反应，每次反应均同时扩增ABL质粒标准品，制作标准曲线，结果每次实验中相当于5个拷贝及大于5个拷贝的稀释后的M-型、m-型和μ-型BCR/ABL阳性对照均有扩增曲线，因此本发明的M-型、m-型和μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系的可重复敏感度均为5个拷贝。
2、特异性
我们利用上述步骤一的M-型、m-型及μ-型BCR/ABL实时定量PCR体系分别检测了阴性对照质粒-WT1，结果未出现扩增曲线，证实本发明的试剂盒具有特异性。
因为人类有核的造血细胞均含有ABL基因，利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系检测了不含ABL基因的WT1质粒，结果未出现扩增曲线，证实ABL检测具有特异性。
3、稳定性
以下稳定性实验中所用的标本均来自人民医院，为自愿供体的离体骨髓单个核细胞。
(1)日间差分析
①提取标本G717的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，共进行5批次实验，结果如下表所示，从表中数据可知，日间差变异系数(CV)为1.83％。
样本编号 CT值 检测时间 1 22.44 06-6-10AM 2 22.91 05-6-17PM 3 22.84 05-7-1PM 4 23.35 05-7-8AM 5 22.3 05-7-15AM
②提取标本H236的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的M-型BCR/ABL实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，共进行5批次实验，结果如下表所示，从表中数据可知，日间差变异系数(CV)为1.06％。
标本编号 CT值 检测时间 1 33.28 05-9-16PM 2 33.97 05-9-23AM 3 33.01 059-30AM 4 33.31 05-10-11PM 5 33.4 05-10-13AM
③提取标本H852的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的m-型BCR/ABL实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，共进行5批次实验，结果如下表所示，从表中数据可知，日间差变异系数(CV)为2.88％。
标本编号 CT值 检测时间 1 29.53 06-3-20PM 2 28.97 06-3-24AM 3 29.3 06-4-21AM 4 31.03 06-9-12PM1 5 30.47 06-9-15AM
(2)日内差分析
①提取标本H236的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，在同一批次进行了5个平行孔的RQ-PCR反应，结果如下表所示，从表中数据可知，日内差变异系数(CV)为1.35％。
样本编号 CT值 检测时间 1 22.02 05-9-30AM 2 22.2 05-9-30AM 3 22.21 05-9-30AM 4 21.83 05-9-30AM 5 22.64 05-9-30AM
②提取标本H314的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的M-型BCR/ABL实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，在同一批次进行了5个平行孔的RQ-PCR反应，结果如下表所示，从表中数据可知，日内差变异系数(CV)为1.64％。
标本编号 CT值 检测时间 1 34.94 05-9-30AM 2 34.12 05-9-30AM 3 33.78 05-9-30AM 4 34.83 05-9-30AM 5 34.3 05-9-30AM
③提取标本J320的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的m-型BCR/ABL实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，在同一批次进行了5个平行孔的RQ-PCR反应，结果如下表所示，从表中数据可知，日内差变异系数(CV)为2.94％。
标本编号 CT值 检测时间 1 31.32 06-9-13AM 2 31.47 06-9-13AM 3 32.75 06-9-13AM 4 30.64 06-9-13AM 5 30.39 06-9-13AM
4、以不同拷贝数的ABL质粒标准品为例检测试剂盒的储存温度和储存时间对实验结果的影响
利用本发明试剂盒检测1×103及1×107拷贝的ABL质粒标准品室温避光储存1周、4℃避光储存3周、6周、9周及12周、-20℃避光储存18个月时的检测结果，检测结果用CT值表示，具体结果如下面两表所示，从表中数据可以看出，随着储存温度和储存时间的变化，CT值无明显变化，表明试剂盒仍很稳定。
103拷贝的ABL质粒标准品不同储存温度及时间下的CT值变化
编号 储存温度(℃) CT值 储存时间 1 室温 31.39 1周 2 4 31.3 3周 3 4 30.92 6周 4 4 31.18 9周 5 4 30.34 12周 6 -20 31.89 18月
107拷贝的ABL质粒标准品不同储存温度及时间下的CT值变化
编号 储存温度(℃) CT值 储存时间 1 室温 17.41 1周 2 4 17.66 3周 3 4 16.87 6周 4 4 16.65 9周 5 4 16.24 12周 6 -20 17.82 18月
【序列表】
<160>14
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ccgctgacca tcaataagga a 21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ctcagaccct gaggctcaaa gt 22
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
agcccttcag cggccagtag catct 25
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ctggcccaac gatggcga 18
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cactcagacc ctgaggctca a 21
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
agcccttcag cggccagtag catct 25
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cggacatcca ggcactgaa 19
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ctcagaccct gaggctcaaa gt 22
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
agcccttcag cggccagtag catct 25
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210>13
<211>316
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ccttcagcgg ccagtagcat ctgactttga gcctcagggt ctgagtgaag ccgctcgttg 60
gaactccaag gaaaaccttc tcgctggacc cagtgaaaat gaccccaacc ttttcgttgc 120
actgtatgat tttgtggcca gtggagataa cactctaagc ataactaaag gtgaaaagct 180
ccgggtctta ggctataatc acaatgggga atggtgtgaa gcccaaacca aaaatggcca 240
aggctgggtc ccaagcaact acatcacgcc agtcaacagt ctggagaaac actcctggta 300
ccatgggcct gtgtcc 316
<210>14
<211>151
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ccacagcaca gggtacgaga gcgataacca cacaacgccc atcctctgcg gagcccaata 60
cagaatacac acgcacggtg tcttcagagg cattcaggat gtgcgacgtg tgcctggagt 120
agccccgact cttgtacggt cggcatctga g 151