人乳头瘤病毒基因芯片、制备方法、应用及检测用试剂盒与应用 【技术领域】
本发明涉及一种基因芯片及包含该基因芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种检测人乳头瘤病毒25种不同型别的基因芯片、制备方法、应用及检测用试剂盒与应用。
背景技术
乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是无包膜的小型双链环状DNA病毒，1949年Straus等首先在电镜下观察到病毒颗粒。HPV颗粒呈球形，二十面体对称，直径约45-55nm，基因组全长7.8-8kb。
HPV基因组有8个开放阅读框(ORF)和一个非翻译调控区，包含早期、晚期转录区和上游调控区(URR)3个功能区。早期转录区(E区)由4500bp组成，分别编码E1-E7等7个早期蛋白参与病毒的DNA复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能。晚期转录区(L区)分L1和L2区，其功能是编码病毒的衣壳蛋白。L1蛋白为病毒的主要衣壳蛋白，L2则为次要成分。HPV基因组DNA在宫颈癌细胞中大多以整合状态存在，E6和E7中大量表达，而E6和E7蛋白能抑制P53和视网膜母细胞瘤蛋白的功能，使宫颈细胞失去抑制癌变的功能，细胞分化失调，产生突变、发展为癌前病变，继而发生宫颈癌。大多数HPV感染者都可以自发清除其感染的HPV，而不会出现任何继发病症，只有持续性HPV感染才与宫颈病变密切相关。HPV的分型主要是依据L1基因的序列进行，如果其L1序列与以前发现的序列差异性大于10％则认为是一种新的型别，2-10％差异的认为是亚型，小于2％差异的可确认为变异株(Molijn A，Kleter B，Quint W，van Doorn LJ.Molecular diagnosisof human papillomavirus(HPV)infections.J Clin Virol.，2005，32 Suppl1：S43-51.)。基因组内重组事件很少发生。目前，已经确定的HPV型别大约有100余种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别可感染泌尿生殖道，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变，包括宫颈上皮内低度病变(CIN I)。高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。HHPV26、53和66型则为可疑组(N，Bosch FX，de SanjoséS，Herrero R，CastellsaguéX，Shah KV，Snijders PJ，Meijer CJ；Epidemiologic classificationof human papillomavirus types associated with cervical cancer.N Engl J Med.，2003，348(6)：518-27)。
越来越多的证据表明，人类乳头瘤病毒感染与人类多种肿瘤特别是宫颈癌的发生、发展密切有关，而宫颈癌为女性最常见的癌症之一，其发病率仅次于乳腺癌。HPV感染与宫颈癌的关系最初在19世纪70年代提出，此后许多流行病学和分子学研究均毫无疑问的证实了HPV与宫颈癌的病因学联系。Manos等(N，Bosch FX，de SanjoséS，et al：The causal linkbetween human papillomavirus and invasive cervical cancer：apopulation-based case-control study in Colombia and Spain.Int J Cancer.1992Nov 11；52(5)：743-9)通过收集来自22个国家的宫颈癌活检标本作PCR检测，发现99.7％的宫颈癌中都可以检测到HPV DNA，而且各国间无显著差异。这是迄今为止所报道人类肿瘤致病因素中的最高检出百分数，同时表明HPV感染与宫颈癌的相关具有普遍意义。此外，在细胞学和分子生物学方面也获得了人乳头状瘤病毒致癌的有力证据。1995年WHO和IARC已将HPV确定为是宫颈癌的病因。
世界卫生组织(WHO)指出全球每年有25万妇女因罹患宫颈癌死亡，目前全球共有4.4亿HPV感染者。美国疾病预防与控制中心2007年的统计数据显示，2000万15岁-49岁的美国人正遭受HPV的感染，约占美国总人口的15％。在我国，每年宫颈癌的新发病例数超过13万，死于宫颈癌的人数约有2万人。
对乳头瘤病毒感染的诊断应引起足够的重视。由于HPV不能在体外培养，加之血清学试验又不能区别近期和远期感染且受其准确性的限制，因此，HPV感染的诊断完全依赖于临床标本中HPV-DNA的检测。
1.免疫组织化学法
取少量病变组织制涂片，用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。该法特异性、灵敏性均较差，操作比较繁琐，仅能提供有限的病毒感染信息，所以开展的医院也较少。
2.原位杂交或Southern印迹杂交或斑点杂交法
宫颈刮片或活检标本的HPV可通过原位杂交来检测，该法或与其它标志物一起能对感染样品中的HPV进行单独或共同定位，但HPV分型鉴定仍需不同型特异性探针进行多次的原位杂交分析。另外一种方法就是把HPV-DNA从临床标本中直接分离出来，通过Southern印迹或斑点杂交进行检测。然而该法不能达到临床所需的灵敏度，且操作繁琐，费时耗力，不适合于大通量临床样品的筛查，目前较少使用。
3.HPV-DNA直接捕捉法
如Hybrid Capture Systems(HC，DigeneCorp.，USA)它是利用一种非同位素信号放大系统并基于HPV-DNA杂交到溶液中标记的RNA探针的方法。结合后的DNA-RNA杂交体被微孔板所捕获并被随后所加的特异性单克隆抗体和化学发光底物所检测。该法可对HPV-DNA进行定量分析。此系统应用两组不同的混合探针(即所谓的鸡尾酒探针)，一组含有HPV26、11、42、43和44型5种LR探针，而另一组则含有HPV16、18、31、33、35、39、45、55、56、58、59和68型13种HR探针。HC为目前唯一以商品形式提供的且有足够的科学证据支持其应用于临床的检测系统。但HC的检测下限约为5000个基因组HPV-DNA，且只能进行分组鉴定而不能进行个体基因分型，两组混合探针间存在的交叉反应也影响其检测的准确性。由于HPV感染的状态要求对特定基因型HPV进行鉴定，故该法不能用于诸如型特异性疫苗或型特异性药物的研究和疗效观察。
4.实时PCR(real-timePCR)
实时PCR用于HPV-DNA的定量检测，即型特异PCR引物与型特异的荧光标记探针相结合用于实时监测。PCR产物可通过通用的荧光染料如SYBRGreen进行检测，但其特异性不高且易产生假阳性的结果。因为序列的异质性，单个荧光探针无法检出广谱PCR扩增产物中不同地HPV基因型而需要一组探针；加之这些探针各自都有不同的特性，故对它们不易进行标准化。基于同样的原因，通过实时PCR对HPV-DNA进行定量也只局限于个别HPV的检测。
5.共有或通用引物PCR
基于应用共有或通用的PCR引物来扩增广谱基因型HPV-DNA。PCR引物常设计在不同基因型HPV最保守的L1区，有的也设计在E1区，常用的通用引物有CPI/II、MY09/11、GP5+/GP6+、SPF10等(Hildesheim A，Schiffman MH，Gravitt PE，Glass AG，Greer CE，Zhang T，Scott DR，Rush BB，Lawler P，Sherman ME.Persistence of type-specific human papillomavirusinfection among cytologically normal women.J Infect Dis 1994；169：235-40；Jacobs MV，Snijders PJ，van den Brule AJ，Helmerhorst TJ，Meijer CJ，Walboomers JM.A general primer GP5+/GP6(+)-mediated PCRenzyme immunoassay method for rapid detection of 14 high-risk and 6low-risk human papillomavirus genotypes in cervical scrapings.J ClinMicrobiol 1997；35：791-5；Kleter B，van Doorn LJ，ter Schegget J，SchrauwenL，van Krimpen K，Burger M，ter Harmsel B，Quint W.Novel short-fragmentPCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital humanpapillomaviruses.Am J Pathol.1998 Dec；153(6)：1731-9)均设计在L1区，见图1(Molijn A，Kleter B，Quint W，van Doom LJ.Molecular diagnosis of humanpapillomavirus(HPV)infections.J Clin Virol.，2005，32 Suppl 1：S43-51)。通用引物检测可提供的信息较少，只能提供HPV存在的信息。其核酸序列测定后直接进行核酸序列分析是检测产物特异性的最可靠方法，这种方法在确定目前尚未知道的型别感染以及突变研究时尤其有用，但该技术不适用于混合感染的临床样品，作为体外诊断方法应用有限。
6.PCR-RFLP法
该方法用适当的限制性内切酶消化PCR产物，从而产生大小不同的DNA片段，再通过凝胶电泳分离这些片段，根据电泳的带型与标准株比较区别不同的HPV基因型。该法操作繁琐且需要适当的限制性内切酶，不适于对混合感染的临床标本分析，同时也不易检出含拷贝数少的某些基因型。
7.基因芯片及其相关方法
目前，用于检测HPV的诊断技术有的耗时长，有的费用高，不利于进行多种型别的同时检测，因此难以达到快速、准确、高通量的目的。目前发展起来的芯片技术可以弥补以上方法的不足。采用基因芯片法或与之相关的技术对乳头瘤病毒的检测也是芯片技术运用研究的热点。基因芯片又叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)，是在面积不大的基片表面上以点阵的方式有序排列一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子(DNA或RNA片段)，并以此作为探针，在一定条件下与样品中待测的靶基因片段进行结合或反应，反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄影技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读信息，最终实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测。检测芯片集集约化、微型化、自动化于一体，拥有简单、快速、准确、灵敏、高通量的特点。
在国外，Gravitt等(Gravitt PE，Peyton CL，Apple RJ，Wheeler CM.Genotyping of 27 human papillomavirus types by using L1 consensus PCRproducts by a single-hybridization，reverse line blot detection method.J ClinMicrobiol.1998 Oct；36(10)：3020-7)采用反向杂交技术结合改良的PGMYprimers通用引物检测27型HPV；Kim等(Kim KH，Yoon MS，Na YJ，etal：Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirusgenotyping DNA chip.Gynecol Oncol.2006 Jan；100(1)：38-43)研制L1和E6/E7扩增的芯片方法其检测型别可达42种；Jacobs等(Jacobs MV，SnijdersPJ，van den Brule AJ，Helmerhorst TJ，Meijer CJ，Walboomers JM.A generalprimer GP5+/GP6(+)-mediated PCR-enzyme immunoassay method for rapiddetection of 14 high-risk and 6 low-risk human papillomavirus genotypes incervical scrapings.J Clin Microbiol.1997 Mar；35(3)：791-5)运用GP5+/6+扩增产物进行检测的可区分20种常见的HPV；Han等(Han J，Swan DC，SmithSJ，Lum SH，Sefers SE，Unger ER，Tang YW.Simultaneous amplification andidentification of 25 human papillomavirus types with Templex technology.JClin Microbiol.2006 Nov；44(11)：4157-62)运用Templex Technology技术——一种新的液相芯片技术检测可检测25种HPV；Wallace等(Wallace J，Woda BA，Pihan G.Facile，comprehensive，high-throughput genotyping ofhuman genital papillomaviruses using spectrally addressable liquid beadmicroarrays.J Mol Diagn.2005 Feb；7(1)：72-80)将液相芯片与PGMY primers技术相结合，其检测的HPV可达45种。
在国内，已有HPV分型芯片的相关专利的申请，如刘玉玲(公开号：CN1544654，公开日：2004.11.10)检测HPV6、11、16、31、33、35、45、39、51、52、56、58、32、34、13、40、41、42、44、53、54、55、74、66和69共25个型别，但高危型18.59.73.82未检测。亚能生物技术(深圳)有限公司的人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统(公开号：CN1690223，公开日：2005.11.02)共检测6、11、31、33、35、16、18、42、45、39、51、52、53、56、58、59、66和68共18个型别，凯普生物公司可检测21型HPV的试剂盒的试剂盒更是得到了SFDA的认证。所以，目前HPV的检测是芯片技术运用于临床的研究热点之一。
【发明内容】
本发明的一个目的是提供一种用于检测人乳头瘤病毒25种不同型别的新型基因芯片，以弥补传统HPV分型检测技术存在的费时、耗力、分型能力差的缺陷，扩展病原体检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。
本发明所述的人乳头瘤病毒基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：
1)从人乳头瘤病毒(HPV)的L1基因中所选取的DNA片段；
2)从人类(Homo sapiens)的β珠蛋白((beta globin protein)基因(简称BGP基因)中选取的DNA片段；
3)1)或2)中选取的DNA片段的互补DNA片段。
上述寡聚核苷酸探针优选为具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：37所示核苷酸序列，或SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：37的核苷酸序列的互补序列，具体的优选序列及功能如下所示：
SEQ ID探针编序列(5′-3′)
NO：1 NO：1 CTACAGACGTKCGATTTCCACTACCC 用于检测HPV-6型；
NO：2 NO：2 TTAACATATATACTACTCCCTACAG 用于检测HPV-6型；
NO：3 NO：3 TATTACCCCCTTTTACCAACAGGT 用于检测HPV-11型；
NO：4 NO：4 GTACATAAATACTACTAGCTACAGA 用于检测HPV-11型；
NO：5 NO：5 TGTATAAATCGTCTGGTACATTTTC 用于检测HPV-16型；
NO：6 NO：6 GGCTAAATTTGCAGTAGRCCCAGAG 用于检测HPV-16型；
NO：7 NO：7 ATAAGGATTGAGGCACAGTGTCACC 用于检测HPV-18型；
NO：8 NO：8 GCTGCCAGGTGAAGCACGCATACCT 用于检测HPV-18型；
NO：9 NO：9 CAGTAGGGACCGATTCACCAACCGT 用于检测HPV-31型；
NO：10 NO：10 AGTATGTACTGTTAGCTAAAGTAGC 用于检测HPV-31型；
NO：11 NO：11 ATCGGGAACAGCCTCTCCTAATGTA 用于检测HPV-33型；
NO：12 NO：12 TGAATAGAGGCAGTAGTTCCTGAAC 用于检测HPV-33型；
NO：13 NO：13 CGGAAGGCACAACGTCGCCAGTT 用于检测HPV-43型；
NO：14 NO：14 CAATTTTGGACCTGGTATTAGAGCC 用于检测HPV-43型；
NO：15 NO：15 AGTACTAGGCAATGTGCCAGTGGTA 用于检测HPV-35型；
NO：16 NO：16 ACAAAGTGGTGGGTATAGCATCCCC 用于检测HPV-26型；
NO：17 NO：17 GCATTATTAGCAGCCTTGGTATACA 用于检测HPV-42型；
NO：18 NO：18 ATAGGTCCGTAGGTACTGTGTCACC 用于检测HPV-45型；
NO：19 NO：19 CAGGGGTTTCACGCATATTAGCGCT 用于检测HPV-45型；
NO：20 NO：20 TATAATAATCGTTAGGAATGTCTTC 用于检测HPV-51型；
NO：21 NO：21 CTACTAGGAGTTTCACGAATGTCAG 用于检测HPV-68型；
NO：22 NO：22 ATACATGTCAGTGGGAATAGTGTCC 用于检测HPV-68型；
NO：23 NO：23 TAAGTCATTAGGTATTTCCTCACCA 用于检测HPV-53型；
NO：24 NO：24 ACTGTCARGGTTACCTGAGGATTTC 用于检测HPV-54型；
NO：25 NO：25 AACTGTACTTTTAGTAGCACCTTTA 用于检测HPV-55型；
NO：26 NO：26 AAATGCACTACTTTGGATAACTGCA 用于检测HPV-58型；
NO：27 NO：27 GATTCAGGAAGTTGATCACCCATAG 用于检测HPV-59型；
NO：28 NO：28 TGTAACTGCCCGGCATTTGTCTGTC 用于检测HPV-62型；
NO：29 NO：29 CAGAACTACCGGTGTTTGCACGT 用于检测HPV-39型；
NO：30 NO：30 TATACAATTGGGCAGGAATGGCGTC 用于检测HPV-39型；
NO：31 NO：31 TCCAATACAAATCTGTAGGAATGGC 用于检测HPV-66型；
NO：32 NO：32 GCATTGGCAAGTGTACCACGTGTAG 用于检测HPV-74型；
NO：33 NO：33 TGCCTGCAGCACCCTTCATATATA 用于检测HPV-81型；
NO：34 NO：34 ATAAGCCTTGTCTGGAATGGCATCA 用于检测HPV-82型；
NO：35 NO：35 GCAGGTATTGTTTCCCCAACTTTAC 用于检测HPV-56型；
NO：36 NO：36 ATATAACTCTGCAGGTATTGTTTC 用于检测HPV-56型；
NO：37 NO：37 CTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGA 用于检测BGP基因，为阳性对照；
NO：38 NO：38 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT用于检测芯片杂交特异性，负对照探针；
NO：39 NO：39
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy-3荧光探针，用于探针点的定位。
其中的M表示A或C；R表示A或G；W表示A或T。50％DMSO为空白阵。
本发明所述的人乳头瘤病毒基因芯片，还包括阳性对照探针、阴性对照探针、荧光探针中的至少一种。其中上述的阳性对照探针优选具有SEQID NO：37所示的核苷酸序列，当检测样品时，结果阳性说明检测体系工作正常，结果阴性则可能为检测体系中有PCR抑制物或临床样品取样量较少；阴性对照探针优选具有SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列；荧光探针优选具有SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供上述的人乳头瘤病毒基因芯片的制备方法，其主要包括以下步骤：
1)获取人乳头瘤病毒的L1基因或人类的β珠蛋白基因的序列；
2)根据步骤1)获得的人乳头瘤病毒的L1基因或人类的β珠蛋白基因的序列设计寡聚核苷酸探针；
3)合成步骤2)中设计的寡聚核苷酸探针；
4)筛选步骤3)中合成的寡聚核苷酸探针；
5)制备阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针；
6)将步骤4)中筛选的寡聚核苷酸探针和步骤5)中制备的阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针固定到固相载体上，制得人乳头瘤病毒基因芯片。
其中，步骤2)中包括将步骤1)获取的L1基因序列导入Glustal X软件中，选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，以确定特异靶点的位置，其中使用Glustal X软件时参数设定如下：-n 20；-l 30；-L40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGGCCCCC TTTTT AAAAA；-g 15；
步骤3)中合成步骤2)中设计的寡聚核苷酸探针所应用的引物包括用于扩增人乳头瘤病毒基因的SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：41所示核苷酸序列的表示引物和/或用于扩增β珠蛋白基因的SEQ ID NO：42-SEQ IDNO：43所示核苷酸序列表示的引物的至少一种。各条引物探针的寡核苷酸序列由5’端至3’端组成，其对应扩增作用是：
P1 AYHTGYAAATATCCWGAYTA用于扩增HPV L1基因的上游引物(SEQ ID NO：40)；
P2 TGYARCCAATADGGYTTRTT用于扩增HPV L1基因的下游引物(SEQ ID NO：41)；
P3 ACACAACTGTGTTCACTAGC用于扩增BGP的上游引物(SEQID NO：42)；
P4 CATCAGGAGTGGACAGATCC用于扩增BGP的下游引物(SEQID NO：43)：
其中的B表示C或G或T；R表示A或G；S表示C或G；W表示A或T；Y表示C或T。
步骤6)中制得的基因芯片包括点样区和标签区域，其中点样区内规则分布有点阵区。
本发明的另一目的是提供上述的上述的人乳头瘤病毒基因芯片的应用，其可用于检测人乳头瘤病毒，所述的人乳头瘤病毒包括6、11、42、43、54、81、16、18、31、33、35、39、45、51、56、58、59、68、82、26、53、62、66、74型中的至少一种。
上述的人乳头瘤病毒基因芯片还可以用于制备检测用试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种检测用试剂盒，其包括上述的人乳头瘤病毒基因芯片。
本发明提供的检测用试剂盒，还包括从待测样品中用于扩增人乳头瘤病毒基因的SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：41所示核苷酸序列表示的PCR引物，或用于扩增β珠蛋白基因的SEQ ID NO：42-SEQ ID NO：43所示核苷酸序列表示的引物。本发明提供的检测用试剂盒，还可以包括下列试剂中的至少一种：
从待检样品中提取DNA的样品处理试剂；
PCR扩增试剂；
杂交试剂；
显色试剂。
本发明的另一目的是提供上述的检测用试剂盒的应用，其可用于检测人乳头瘤病毒。所述的人乳头瘤病毒包括6、11、42、43、54、81、16、18、31、33、35、39、45、51、56、58、59、68、82、26、53、62、66、74型中的至少一种。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案的有益效果在于：
现有芯片技术研究所设计的引物和探针基本都位于L1基因末端(Molijn A，Kleter B，Quint W，van Doorn LJ.Molecular diagnosis of humanpapillomavirus(HPV)infections.J Clin Virol.，2005，32 Suppl 1：S43-51)，本发明将在L1基因新位置(837-1096bp之间)设计特异探针和引物。引物的扩增产物长度为260bp，远小于目前常用芯片检测引物MY09/11的扩增产物(450bp)，保证了扩增的敏感性，尤其适用于经液体石蜡或福尔马林浸泡病理样品，此类样品中HPV DNA序列易遭破坏，从而大大提高了样品制备的效率。同时较小的扩增产物在芯片杂交过程中由于空间位阻较小，杂交效率更高。经序列分析该简并引物可以扩增目前已知的绝大多数生殖道易感HPV。在相对较为保守的两引物间为一长度约150bp的高变区，比较适合设计特异性探针。随着克隆HPV型别的增加和增加相应特异探针的设计，其检测范围还可以进一步扩大。
该芯片可特异地检测25型HPV，包括低危型：6、11、42、43、54和81共6型；高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、56、58、59、68和82共13型；其他26、53、62、66和74共6型。该检测方法大约需8小时。在一张片基上可同时检测6个样品，减少了成本，实现高通量，同时检测多个样品的目的，特别适合于检测那些多重感染的样品。
由上述的技术方案可见，本发明将芯片技术引入到HPV的分型检测中，建立了一种快速、灵敏、高通量、准确性高、重复性强的全新的HPV分型检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到对25种不同的HPV型别进行检测的目的，且操作简便，准确性高，能一次完成多种型别的检测，重复性强。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
【附图说明】
图1HPV的基因组结构及通用引物的设计(N，Bosch FX，deSanjoséS，et al：The causal link between human papillomavirus and invasivecervical cancer：a population-based case-control study in Colombia and Spain.Int J Cancer.1992 Nov 11；52(5)：743-9)；
图2为本发明的基因芯片结构外形示意图；
图3为本发明芯片的单一点阵结构示意图；
图4为二重PCR对临床样品的扩增。各个泳道分别为1，F160(阳性)；2，F159(阴性)；3，F158(阴性)；4，F157(阳性)；5，F156(阳性)；6，F155(阴性)；7，F154(阴性)；8，F153(阴性)；M，DL2000；
图5为利用本发明的基因芯片检测HPV-6型的一个实施例的杂交结果示意图；
图6为利用本发明的基因芯片检测HPV-11型的一个实施例的杂交结果示意图；
图7为利用本发明的基因芯片检测HPV-16型的杂交结果示意图；
图8为利用本发明的基因芯片检测HPV-18型的杂交结果示意图；
图9为利用本发明的基因芯片检测HPV-26型的杂交结果示意图；
图10为利用本发明的基因芯片检测HPV-31型的杂交结果示意图；
图11为利用本发明的基因芯片检测HPV-33型的杂交结果示意图；
图12为利用本发明的基因芯片检测HPV-35型的杂交结果示意图；
图13为利用本发明的基因芯片检测HPV-42型的杂交结果示意图；
图14为利用本发明的基因芯片检测HPV-43型的杂交结果示意图；
图15为利用本发明的基因芯片检测HPV-45型的杂交结果示意图；
图16为利用本发明的基因芯片检测HPV-53型的杂交结果示意图；
图17为利用本发明的基因芯片检测HPV-54型的杂交结果示意图；
图18为利用本发明的基因芯片检测HPV-55型的杂交结果示意图；
图19为利用本发明的基因芯片检测HPV-56型的杂交结果示意图；
图20为利用本发明的基因芯片检测HPV-58型的杂交结果示意图；
图21为利用本发明的基因芯片检测HPV-59型的杂交结果示意图；
图22为利用本发明的基因芯片检测HPV-62型的杂交结果示意图；
图23为利用本发明的基因芯片检测HPV-66型的杂交结果示意图；
图24为利用本发明的基因芯片检测HPV-68型的杂交结果示意图；
图25为利用本发明的基因芯片检测HPV-39型的杂交结果示意图；
图26为利用本发明的基因芯片检测HPV-56型的杂交结果示意图；
图27为利用本发明的基因芯片检测HPV-74型的杂交结果示意图；
图28为利用本发明的基因芯片检测HPV-81型的杂交结果示意图；
图29为利用本发明的基因芯片检测HPV-82型的杂交结果示意图；
图30A-图30D为临床样品F44和临床样品C27的HPV测序和芯片检测结果，图30A，F44测序结果；图30B，F44芯片检测结果；图30C，C27测序结果；图30D，C27芯片检测结果。
【具体实施方式】
实施例一 探针的设计和制备
1.序列获得：
(1)HPV：从GenBank公共数据库下载得到HPV全部L1基因序列及其近缘菌的全部L1基因序列。
(2)人BGP基因中序列的获得方法与(1)相同。
2.探针设计举例：
(1)HPV探针：将HPV各型别的L1基因序列导入Glustal X软件中，选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。将序列导入OligoArray2.0软件中。参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。
3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长16T并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。
4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过HPV-6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、42、43、45、51、53、54、55、56、58、59、61、62、66、67、68、74、81、82、87和91共30型HPV，多次杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异的探针，得到的优选的探针如表1所示：
表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的病原体
SEQ ID 探针 编号 序列(5′-3′) NO：1 NO：1 CTACAGACGTKCGATTTCCACTACCC 用于检测 HPV-6型； NO：2 NO：2 TTAACATATATACTACTCCCTACAG 用于检测 HPV-6型； NO：3 NO：3 TATTACCCCCTTTTACCAACAGGTC 用于检测 HPV-11型； NO：4 NO：4 GTACATAAATACTACTAGCTACAGA 用于检测
HPV-11型； NO：5 NO：5 TGTATAAATCGTCTGGTACATTTTC 用于检测 HPV-16型； NO：6 NO：6 GGCTAAATTTGCAGTAGRCCCAGAG 用于检测 HPV-16型； NO：7 NO：7 ATAAGGATTGAGGCACAGTGTCACC 用于检测 HPV-18型； NO：8 NO：8 GCTGCCAGGTGAAGCACGCATACCT 用于检测 HPV-18型； NO：9 NO：9 CAGTAGGGACCGATTCACCAACCGT 用于检测 HPV-31型； NO：10 NO：10 AGTATGTACTGTTAGCTAAAGTAGC 用于检测 HPV-31型； NO：11 NO：11 ATCGGGAACAGCCTCTCCTAATGTA 用于检测 HPV-33型； NO：12 NO：12 TGAATAGAGGCAGTAGTTCCTGAAC 用于检测 HPV-33型； NO：13 NO：13 CGGAAGGCACAACGTCGCCAGTT 用于检测 HPV-43型； NO：14 NO：14 CAATTTTGGACCTGGTATTAGAGCC 用于检测 HPV-43型； NO：15 NO：15 AGTACTAGGCAATGTGCCAGTGGTA 用于检测
HPV-35型； NO：16 NO：16 ACAAAGTGGTGGGTATAGCATCCCC 用于检测 HPV-26型； NO：17 NO：17 GCATTATTAGCAGCCTTGGTATACA 用于检测 HPV-42型； NO：18 NO：18 ATAGGTCCGTAGGTACTGTGTCACC 用于检测 HPV-45型； NO：19 NO：19 CAGGGGTTTCACGCATATTAGCGCT 用于检测 HPV-45型； NO：20 NO：20 TATAATAATCGTTAGGAATGTCTTC 用于检测 HPV-51型； NO：21 NO：21 CTACTAGGAGTTTCACGAATGTCAG 用于检测 HPV-68型； NO：22 NO：22 ATACATGTCAGTGGGAATAGTGTCC 用于检测 HPV-68型； NO：23 NO：23 TAAGTCATTAGGTATTTCCTCACCA 用于检测 HPV-53型； NO：24 NO：24 ACTGTCARGGTTACCTGAGGATTTC 用于检测 HPV-54型； NO：25 NO：25 AACTGTACTTTTAGTAGCACCTTTA 用于检测 HPV-55型； NO：26 NO：26 AAATGCACTACTTTGGATAACTGCA 用于检测
HPV-58型； NO：27 NO：27 GATTCAGGAAGTTGATCACCCATAG 用于检测 HPV-59型； NO：28 NO：28 TGTAACTGCCCGGCATTTGTCTGTC 用于检测 HPV-62型； NO：29 NO：29 CAGAACTACCGGGGTTTGCACGTAT 用于检测 HPV-39型； NO：30 NO：30 TATACAATTGGGCAGGAATGGCGTC 用于检测 HPV-39型； NO：31 NO：31 TCCAATACAAATCTGTAGGAATGGC 用于检测 HPV-66型； NO：32 NO：32 GCATTGGCAAGTGTACCACGTGTAG 用于检测 HPV-74型； NO：33 NO：33 TGCCTGCAGCACCCTTCATATATA 用于检测 HPV-81型； NO：34 NO：34 ATAAGCCTTGTCTGGAATGGCATCA 用于检测 HPV-82型； NO：35 NO：35 GCAGGTATTGTTTCCCCAACTTTAC 用于检测 HPV-56型； NO：36 NO：36 ATATAACTCTGCAGGTATTGTTTC 用于检测 HPV-56型；
NO：37 NO：37 CTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGA 用于检测 BGP基因， 为阳性对 照； NO：38 NO：38 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT 用于检测芯 片杂交特异 性，负对照 探针； NO：39 NO：39 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT-Cy-3 荧光探针， 用于探针点 的定位。
参照图2，是本发明芯片的单一点阵列结构示意图，其中的Cy3表示荧光探针，其中的NO对应的数字表示的核苷酸序列与本发明中所述的SEQ ID NO后对应的数字表示的核苷酸序列一致。
参照图3，是本发明的基因芯片结构外形示意图，该基因芯片的上部是点样区，下部是标签区域，其中点样区内规则分布有点阵区。探针在玻璃片基上的点阵位置为：第一横排点阵区的上端距离玻璃片基的上方为9.25mm，左侧点阵区距离玻璃片基的左侧、右侧点阵区距离玻璃片基的右侧均为4.5mm，两个点阵区间的距离为13.5mm(均从左侧点阵区和右侧点阵区的最左端起算)，第一横点阵区的最上端和第二横点阵区的最上端的距离是13.5mm，第二横排点阵区的最上端和第三横排点阵区的最上端的距离是19.5mm。
实施例二 引物的设计和制备
1.引物设计举例：
(1)HPV L1基因通用扩增引物：将HPV全部的L1基因序列导入Glustal X软件中，从中选取一条有代表性的序列导入Primer Primier 5.0软件中，设定长度70bp～10bp，G+C％值40％～60％，Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE。并寻找出适合通用引物设计的核苷酸序列区，其特点基本满足一下条件：1，该恒定区应包括大多数的生殖疾病相关的HPV；2，该区域应包含有易于特异性探针设计的可变区，保证探针间核苷酸的差异大于4个以上；3，该区域两侧为恒定区能满足引物的设计；4，所设计的引物扩增产物不宜过大，否则影响PCR的灵敏性。设计的HPV引物扩增产物大小为260bp。
(2)人BGP基因中的引物设计方法与(1)相同。
2.引物合成：将表2中的引物序列委托探针合成公司(英俊生物技术公司)合成(PAGE纯化)，备用。其中用于扩增HPV的通用引物为简并引物，Y代表G/C，W代表A/T。
表2用于STD常见病原体检测的PCR扩增引物序列
编 号 SEQ ID 序列(5’-3’) 引物作用 P1 NO：40 AYHTGYAAATATCCWGATT A 用于扩增HPV的通用上游 引物 P2 NO：41 TGYARCCAATAWGGYTTAT T 用于扩增HPV的通用下游 引物 P3 NO：42 ACACAACTGTGTTCACTAGC 用于扩增BGP的上游引物 P4 NO：43 CATCAGGAGTGGACAGATCC 用于扩增BGP的下游引物
实施例三 利用基因芯片快速检测HPV 25种不同型别及试剂盒的制备
1.样品处理：
(1)将收集得到的临床样品15000g离心10分钟；
(2)弃上清，加入100μl裂解液，混匀，100℃水浴10分钟；
(3)上一步得到的裂解产物15000g离心5分钟；
(4)收集上清，上清中即含有基因组DNA，即可用于检测或-20℃保存。
附：裂解液配方：
50m molL-1NaOH
10m molL-1Tris-HCl(pH8.0)
0.5％Tween-20
0.5％NP-40
0.5m molL-1EDTA(pH8.0)
5％chelex-100
2.扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的3ul上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3所示。(注：以下表3-表4中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)
表3PCR反应混合液配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P1，P2为1.2μmolL-1；P3，P4为0.16μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
80℃10分钟
95℃5分钟
94℃1分钟
45℃2分钟
68℃1分钟回到第三步，共35个循环
72℃10分钟
BGP扩增大小为336bp，HPV扩增大小为260bp。如图4所示，二重PCR对临床样品F153、154、155、156、157、158、159、160的扩增结果，其中F156、157和160样品HPV阳性。
3.荧光标记靶序列：取3μl扩增产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。
表4标记反应混合液配方
注：①引物混合物II中所含各引物浓度为：P1为0.9μmolL-1；P4为0.3μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
80℃10分钟
95℃5分钟
94℃30秒
45℃2分钟
68℃1分钟回到第三步，共35个循环
72℃10分钟
4.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH2O以保持湿度。取10μl 2×杂交液与10μl标记产物混合均匀，并加在实施例一中制备的STD常见病原体检测基因芯片的探针阵列区域，盖上盖片(博奥公司产品，产品号430042)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，42℃水浴锅中杂交1.5小时。
杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS；6×SSPE。
5.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name：575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测本发明所涉及HPV型别时的杂交扫描结果分别如图5-29所示。
7.杂交结果的分析判读：本芯片为低密度芯片，探针数量较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以荧光探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出病原体。其中BGP探针(NO.37)为阳性对照探针，有两方面作用：1显示PCR反应体系是否正常，有无抑制物存在；2临床样品取样量是否足够及样品处理是否正确。当检测样品时，结果阳性说明检测体系工作正常，结果阴性则可能为检测体系中有PCR抑制物或临床样品取样量较少。
图30A-图30D为临床样品F44和临床样品C27的HPV测序和芯片检测结果，图30A，F44测序结果；图30B，F44芯片检测结果；图30C，C27测序结果；图30D，C27芯片检测结果，F44为单重感染HPV11，C27为多重感染HPV11、53和58。
利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测的病原体至少包括HPV中的6型、11型、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、42型、43型、45型、51型、53型、54型、55型、56型、58型、59型、62型、66型、68型、74型、81型、82型的至少一种的检测，其中该试剂盒还带有使用此试剂盒的说明书等。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【序列表】
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>人乳头瘤病毒基因芯片、制备方法、应用及检测用试剂盒与应用
<130>8P13001-CN
<160>43
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>1
ctacagacgt kcgatttcca ctaccc 26
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>2
ttaacatata tactactccc tacag 25
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>3
tattaccccc ttttaccaac aggtc 25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>4
gtacataaat actactagct acaga 25
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>5
tgtataaatc gtctggtaca ttttc 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>6
ggctaaattt gcagtagrcc cagag 25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>7
ataaggattg aggcacagtg tcacc 25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>8
gctgccaggt gaagcacgca tacct 25
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>9
cagtagggac cgattcacca accgt 25
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>10
agtatgtact gttagctaaa gtagc 25
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>11
atcgggaaca gcctctccta atgta 25
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>12
tgaatagagg cagtagttcc tgaac 25
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>13
cggaaggcac aacgtcgcca gtt 23
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>14
caattttgga cctggtatta gagcc 25
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>15
agtactaggc aatgtgccag tggta 25
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>16
acaaagtggt gggtatagca tcccc 25
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>17
gcattattag cagccttggt ataca 25
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>18
ataggtccgt aggtactgtg tcacc 25
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>19
caggggtttc acgcatatta gcgct 25
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>20
tataataatc gttaggaatg tcttc 25
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>21
ctactaggag tttcacgaat gtcag 25
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>22
atacatgtca gtgggaatag tgtcc 25
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>23
taagtcatta ggtatttcct cacca 25
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>24
actgtcargg ttacctgagg atttc 25
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>25
aactgtactt ttagtagcac cttta 25
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>26
aaatgcacta ctttggataa ctgca 25
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>27
gattcaggaa gttgatcacc catag 25
<210>28
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>28
tgtaactgcc cggcatttgt ctgtc 25
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>29
cagaactacc ggtgtttgca cgt 23
<210>30
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>30
tatacaattg ggcaggaatg gcgtc 25
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>31
tccaatacaa atctgtagga atggc 25
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>32
gcattggcaa gtgtaccacg tgtag 25
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>33
tgcctgcagc acccttcata tata 24
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>34
ataagccttg tctggaatgg catca 25
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>35
gcaggtattg tttccccaac tttac 25
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>寡核苷酸探针序列
<400>36
atataactct gcaggtattg tttc 24
<210>37
<211>25
<212>DNA
<213>阳性对照探针序列
<400>37
ctcttgggtt tctgataggc actga 25
<210>38
<211>40
<212>DNA
<213>阴性对照探针
<400>38
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40
<210>39
<211>40
<212>DNA
<213>荧光探针序列
<400>39
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>用于扩增人乳头瘤病毒基因的引物序列
<400>40
ayhtgyaaat atccwgayta 20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>用于扩增人乳头瘤病毒基因的引物序列
<400>41
tgyarccaat adggyttrtt 20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>用于扩增β珠蛋白基因的引物序列
<400>42
acacaactgt gttcactagc 20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>用于扩增β珠蛋白基因的引物序列
<400>43
catcaggagt ggacagatcc 20