一种3-去乙酰基-7-氨基头孢烯酸的制备方法 【技术领域】
本发明涉及酶工程及生物催化技术领域，具体涉及一种新型医药中间体3-去乙酰基-7-氨基头孢烯酸的制备方法。
背景技术
头孢菌素C(cephalosporin C，CPC)发酵过程中会产生多种组份：头孢菌素C(CPC)、3-去乙酰基-头孢菌素C(DCPC)、3-去乙酰氧基-头孢菌素C(DOCPC)，其中CPC和DCPC共占98％～99.8.％。生产过程中通常只提取CPC用于制备头孢类抗生素关键中间体7-氨基头孢烯酸(7-ACA)，而DCPC和DOCPC一般作为有害杂质被除去。
为了解决细菌耐药性问题，第三代、第四代及更新型的头孢类抗生素均需要在头孢环的第3位和第7位进行修饰。7-ACA的3位为乙酰化的酯键，由于改造成其它铡链相对较难，如合成头孢呋辛、头孢西丁等产品时，需先水解除去3位的乙酰基，即先转变为3-去乙酰基-7-ACA(D-7-ACA)再进行3位修饰。
本发明采用酶法制备了新型医药中间体D-7-ACA。D-7-ACA中间体可以合成绝大多数头孢类抗生素，取代7-ACA中间体是必然的，并且以头孢菌素C发酵液为起始物料，可利用的有效成份更多，生产D-7-ACA的摩尔数更多，等摩尔数的D-7-ACA比7-ACA成本更低，有利于整个产业链成本下降。整个过程均采用用酶法工艺也有利于环境保护事业，是一种可持续发展的工艺路线。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种新型医药中间体3-去乙酰基-7-氨基头孢烯酸的制备方法，以显著降低头孢类抗生素的合成成本。
本发明地目的是通过以下技术方案实现的：
由头孢菌素C(CPC)和3-去乙酰-头孢菌素C(DCPC)以任意比例构成的混合溶液作为底物溶液，采用D-氨基酸氧化酶、GL-7-ACA酰化酶和去乙酰基酯酶三种酶通过氧化、酰化、水解催化反应转化为D-7-ACA，经结晶、干燥获得目的产品。所述酶为固定化酶或液态酶。具体反应原理见附图1、附图2、附图3，目标产物D-7-ACA的结构式见附图4。
所述底物溶液为头孢菌素C发酵粗提液，也可以是头孢菌素发酵液经层析分离精制的由有效成份CPC和DCPC组成的混合溶液，其中CPC的重量浓度为0.5％～15％。
所述三种酶活性浓度为100～15000u/l，其使用方式有以下五种：
1)方法一：底物溶液先在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下进行氧化反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，温度为10～37℃，氧气流量为0.1～10vvm，压力保持0.1～3Mpa；反应完过滤后再在固定化GL-7-ACA酰化酶和去乙酰酯酶的混合酶催化作用下同时进行酰化和酯水解反应，混合酶催化反应条件为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃。
2)方法二：底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶和去乙酰酯酶的混合酶的催化作用下同时进行氧化反应和酯水解反应，混合酶的催化反应条件为：pH6.0～8.5，温度为10～37℃，氧气流量为0.1～10vvm，压力保持0.1～3Mpa；反应完过滤后，再在固定化GL-7-ACA酰化酶的催化作用下进行酰化反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃。
3)方法三：底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下进行氧化反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，温度为10～37℃，氧气流量为0.1～10vvm，压力保持0.1～3Mpa；反应完过滤后，在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下进行酰化反应，催化反应条件均为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃；反应完过滤后在固定化去乙酰基酯酶催化作用下进行酯水解反应，催化反应条件均为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃。
4)方法四：底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下进行氧化反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，温度为10～37℃，氧气流量为0.1～10vvm，压力保持0.1～3Mpa；反应完过滤后在固定化去乙酰基酯酶催化作用下进行酯水解反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃；反应完过滤后在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下进行酰化反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃。
5)方法五：底物溶液在固定化去乙酰基酯酶催化作用下，进行酯水解反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃；反应完过滤后在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下进行氧化反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，温度为10～37℃，氧气流量为0.1～10vvm，压力保持0.1～3Mpa；再在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下进行酰化反应，催化反应条件为：pH6.0～8.5，反应的温度为10～37℃。
本发明的优势在于：
1、本发明以头孢菌素C发酵液为起始物料，可利用的有效成份更多，生产D-7-ACA的摩尔数更多，等摩尔数的D-7-ACA比7-ACA成本更低，有利于整个产业链成本下降。
2、本发明提供了一种新型医药中间体D-7-ACA，与7-ACA相比，有利于在3位进行修饰，可合成大多数新型头孢类抗生素。
3、整个工艺流程均采用酶法工艺，是一种全酶法的生产过程，低能耗且有利于环境保护事业，是一种可持续发展的工艺路线。
【附图说明】
附图1：氧化反应
附图2：酰化反应
附图3：水解反应
附图4：目标产物D-7-ACA的结构式
【具体实施方式】
实施例1：由CPC发酵液制备D-7-ACA
取2.5L头孢菌素C发酵液(31000u/ml)，滤除菌体，调节PH至3.0，树脂脱色后，采用LX-81树脂层析分离，醋酸钠缓冲液脱，收集第一组份DCPC和第三组份CPC，钠滤浓缩获得CPC和DCPC混合溶液1000ml，用氨水调节PH至7.5备用；
在反应器1中加入固定化D-氨基酸氧化酶72g，用去离子水洗净，加入上述反应液，通入氧气2vvm，压力2Mpa，用酸或碱维持PH7.5，保持温度25℃，反应60min，HPLC分析CPC和DCPC面积百分比0.5％，结束反应，过滤得氧化液。
在反应器2中加入固定化GL-7-ACA酰化酶71g和去乙酰酯酶57g，用去离子水洗净，加入氧化液，用酸或碱维持PH8.5，保持温度25℃，反应65min，至PH不再变化结束反应，HPLC分析D-7-ACA占94％，过滤得到D-7-ACA溶液。
将反应液冰浴降温，用酸调PH至3.5下，同时温度降至5℃，低速搅拌2小时，过滤收集晶体，用5℃丙酮洗涤3遍，40℃下真空干燥3小时，获得16.4g D-7-ACA结晶粉。
实施例2：由CPC结晶粉两步酶法制备D-7-ACA
称取40g CPC结晶粉，加入1000ml水，并滴加氨水溶解，调节PH至7.5，配成4％浓度的底物溶液备用。
在反应器1中加入固定化D-氨基酸氧化酶70g，用去离子水洗净，加入上述反应液，通入氧气4vvm，压力0.5Mpa，用酸或碱维持PH7.0，保持温度23℃，反应49min，HPLC分析CPC和DCPC面积百分比0.5％，结束反应，过滤得氧化液。
在反应器2中加入固定化GL-7-ACA酰化酶71和去乙酰酯酶51g，用去离子水洗净，加入氧化液，用酸或碱维持PH6.5，保持温度28℃，反应57min，至PH不再变化结束反应，HPLC分析D-7-ACA占96％，过滤得到D-7-ACA溶液。
将反应液冰浴降温，用酸调PH至3.5下，同时温度降至5℃，低速搅拌2小时，过滤收集晶体，用5℃丙酮洗涤3遍，40℃下真空干燥3小时，获得14.9g D-7-ACA结晶粉。
实施例3：由CPC结晶粉两步酶法制备D-7-ACA
加固定化D-氨基酸氧化酶与去乙酰酯酶混合催化，进行氧化和水解反应，反应完成后加GL-7-ACA酰化酶进行酰化反应，其它条件与上述实施例2一致，获得14.6g D-7-ACA结晶粉。
实施例4：由CPC结晶粉三步酶法制备D-7-ACA
称取50g CPC结晶粉，加入1000ml水，并滴加氨水溶解，调节PH至6.5，配成5％浓度的底物溶液备用。
在反应器1中加入固定化D-氨基酸氧化酶70g，用去离子水洗净，加入上述反应液，通入氧气1vvm，压力0.1Mpa，用酸或碱维持7.2，保持温度20℃，反应59min，HPLC分析CPC和DCPC面积百分比0.5％，结束反应，过滤得氧化液。
在反应器2中加入固定化GL-7-ACA酰化酶72g，用去离子水洗净，加入氧化液，用酸或碱维持PH8.0，保持温度25℃，反应66min，至PH不再变化结束反应，HPLC分析GL-7-ACA占2.6％，过滤得到酰化液。
在反应器3中加入固定化去乙酰酯酶45g，用去离子水洗净，加入酰化液，用酸或碱维持PH7.5，保持温度31℃，反应61min，至PH不再变化结束反应，HPLC分析D-7-ACA占94.2％，过滤得到D-7-ACA溶液。
将反应液冰浴降温，用酸调PH至3.5下，同时温度降至5℃，低速搅拌4小时，过滤收集晶体，用4℃丙酮洗涤3遍，40℃下真空干燥3小时，获得18.8g D-7-ACA结晶粉。
实施例5：由CPC结晶粉三步酶法制备D-7-ACA
将固定化去乙酰酯酯催化反应步骤放在酰化反应前进行，其它条件与实施例4一致，获得19.0g D-7-ACA结晶粉。
实施例6：由CPC结晶粉三步酶法制备D-7-ACA
将固定化去乙酰酯酯催化反应步骤放在氧化反应前进行，其它条件与实施例4一致，获得19.2g D-7-ACA结晶粉。
实施例7：采用液态酶制备D-7-ACA
称取20g CPC结晶粉，加入1000ml水，并滴加氨水溶解，调节PH至7.0，配成2％浓度的底物溶液备用。
在反应器中加入D-氨基酸氧化酶40ml，加入上述底物溶液，通入氧气2vvm，压力0.2Mpa，用酸或碱维持PH7.0，保持温度18℃，反应53min，HPLC分析CPC和DCPC面积百分比0.5％，结束反应。
再向反应器中加入GL-7-ACA酰化酶35ml和去乙酰酯酶31ml，用酸或碱维持PH7.8，保持温度25℃，反应55min，至PH不再变化结束反应，HPLC分析D-7-ACA占96％，得到D-7-ACA溶液，将反应液降温至10℃，经过超滤膜用去离子水洗出反应产物，再用钠滤膜浓缩至500ml。
将上述浓缩液冰浴降温，用酸调PH至3.8下，同时温度降至2℃，低速搅拌3小时，过滤收集晶体，用5℃丙酮洗涤3遍，35℃下真空干燥6小时，获得7.1g D-7-ACA结晶粉。