白脊管藤壶与纹藤壶的鉴别方法与引物 【技术领域】
本发明涉及藤壶的鉴别，尤其是涉及一种白脊管藤壶与纹藤壶的鉴别方法与引物。
背景技术
藤壶隶属于节肢动物门(Arthropoda)，甲壳动物亚门(Crustacea)，颚足纲(Maxillopoda)，鞘甲亚纲(Thecostraca)，蔓足下纲(Cirripedia)，围胸总目(Thoracoca)，无柄目(Sessilia)，藤壶亚目(Balanomorpha)。迄今为止共记录8科约541种，其中我国约有110种。
藤壶是常见的污损生物，主要分布于潮间带至潮下带浅水区，若附着在舰船的底部，则会大大降低航速，全世界每年消除藤壶要花费上百亿美元；若藤壶附着在水下管道系统内，则容易造成堵塞，产生事故；此外，藤壶能破坏金属构筑物的油漆保护层，还与贻贝、牡蛎等养殖贝类争夺附着基质和饵料，对养殖业造成极大危害。因此，针对不同种类的藤壶有目标地进行防除是海洋污损生物防除的主要内容。目前，藤壶分类的主要方法是形态学分类法(刘瑞玉；任先秋.中国动物志：无脊椎动物第四十二卷[M].北京：科学出版社，2007)，但是同种藤壶在不同的生境中，其外形随环境而有所改变，并且藤壶的幼体与成体之间的形态差异较大，给藤壶样品的分类鉴定造成了很大的困难，降低了鉴定的准确度。若将分子标记技术应用于藤壶的鉴定可以提高样品鉴定的准确度和效率，可帮助研究者鉴定处于不同发育阶段的藤壶幼体及成体，从而有助于研究者针对不同的藤壶种类有目标的进行防除。中国专利200610135259.2公开一种不同种群大黄鱼的鉴别引物和鉴别方法，应用分子标记技术对不同种群大黄鱼进行了有效的鉴别。
藤壶同时还是研究海洋生物的浮游幼体集群与扩散情况的模式生物，对其准确鉴定还为物种定界、亲缘关系和遗传多样性等方面的科学研究提供保障。白脊管藤壶与纹藤壶是我国主要的固着藤壶。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种用于区别白脊管藤壶的混合引物。
本发明的另一目的在于提供白脊管藤壶与纹藤壶的鉴别方法。
本发明所述混合引物为引物18SCOM、引物18SB1及引物18SW1。
所述引物18SCOM为：5’-TTACCCACTCCCAGTTCAGG-3’；
所述引物18SB1为：5’-GAATATG TATACAGGCATTC-3’；
所述引物18SW1为：5’-CATCAGGCCCCTCCGAAGAA-3’。
本发明所述白脊管藤壶与纹藤壶的鉴别方法包括以下步骤：
1)提取白脊管藤壶与纹藤壶的DNA；
2)PCR扩增反应：PCR扩增反应体系的总体积为25μL，反应体系如下：
dd H2O 16.7μL
10×PCR缓冲液 2.5μL
dNTP(各2.5mmol/L) 2μL
引物18SCOM(10nmol/ml) 1μL
引物18SB1(10nmol/ml) 1μL
引物18SW1(10nmol/ml) 1μL
DNA模板 0.6μL
DNA聚合酶 0.2μL
PCR循环参数是：
94℃4min→(94℃1min→55℃1min→72℃1min)×34cycles→72℃10min；
3)电泳图谱：PCR扩增结束后，取产物5μL，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，并用凝胶成像系统观察并保存结果；
4)结果判断：若只有400bp左右或者有400bp和330bp左右的两条带扩出，则是白脊管藤壶；若只有330bp左右的条带扩出，则是纹藤壶。
在步骤1)中，所述提取白脊管藤壶与纹藤壶的DNA可采用酚氯仿抽提法，其具体步骤为：
(1)取用藤壶的闭壳肌，放入加有双蒸水的Eppendorf离心管中剪碎，静置；
(2)将剪碎，静置后的藤壶的闭壳肌离心，弃上清液；
(3)加入抽提缓冲液和SDS溶液至终浓度5mg/ml，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，混匀，水浴，至组织完全消化；
(4)将溶液冷却至室温，加入酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀，离心，将上清液移入另一个Eppendorf离心管中；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)改用氯仿，重复步骤(4)一次；
(7)加入乙酸钠溶液，混匀，加入预冷无水乙醇，混匀至水相和无机相间无分层，放入冰箱中，离心，弃上清液，保留沉淀；
(8)加入乙醇，上下颠倒至少1次，离心，弃上清；
(9)重复步骤(8)一次后干燥；
(10)加入TE，溶解DNA，冰箱保存。
在步骤(1)中，按质量/体积比，藤壶的闭壳肌∶双蒸水最好为10mg∶200μL，所述剪碎可采用剪刀剪碎。
在步骤(2)中，所述离心可采用10,000r/min离心1min。
在步骤(3)中，所述抽提缓冲液与SDS溶液的体积比最好为564∶30，所述SDS溶液的浓度(重量体积比)最好为10％，蛋白酶K的浓度最好为10mg/ml，水浴的温度最好为55℃，水浴的时间最好为2～3h，在水浴期间最好每隔10min翻转一次。
在步骤(4)中，所述酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，按体积比最好为酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，所述离心最好在4℃下，10000r/min离心10min，所述将上清液移入另一个Eppendorf离心管中可采用用剪掉尖部2～3mm的枪头将上清液小心移入另一个Eppendorf离心管中。
在步骤(7)中，所述乙酸钠溶液的摩尔比浓度最好为3mol/L，加入乙酸钠溶液的量最好按体积比为步骤(6)的终产物的10％，所述预冷的温度最好为-20℃，所述放入冰箱中的时间最好为2h，所述离心最好是12000r/min离心10min。
在步骤(8)中，按体积百分比，乙醇的浓度最好为70％，所述离心最好是10000r/min离心10min。
在步骤(10)中，所述加入TE，溶解DNA最好是加入100ul TE，45℃，15min溶解DNA。
由于本发明利用混合引物18SCOM、18SB1及18SW1对白脊管藤壶与纹藤壶的DNA进行PCR扩增，并通过扩增图谱对两物种进行有效辨别，根据电泳结果目的片段的长度和数量可以有效区别两种藤壶，因此提高了鉴定的准确度和效率。
【附图说明】
图1为引物18SCOM，18SB1与18SW1的温度梯度PCR扩增。在图1中，1～6为白脊管藤壶；7～12为纹藤壶；13为阴性对照M为DL2000。
【具体实施方式】
1)常规方法提取白脊管藤壶与纹藤壶的DNA
采用酚氯仿抽提法，提取白脊管藤壶与纹藤壶的DNA，其具体步骤如下：
(1)取用藤壶的闭壳肌10mg左右，放入加有200μL双蒸水的1.5mL Eppendorf离心管中，用剪刀将其剪碎，静置0.5h。
(2)10,000r/min离心1min，弃上清液。
(3)加入564μL抽提缓冲液，30μL的10％SDS(重量体积比)溶液至终浓度5mg/ml，加入6μL蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为100μg/ml，混匀。55℃水浴2～3h，期间每隔10min翻转一次，至组织完全消化。
(4)将溶液冷却至室温，加入600μL地酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液，充分轻柔地混匀3～5min。在台式高速离心机上4℃，10000r/min离心10min，用剪掉尖部2～3mm的枪头将上清液小心移入另一个1.5ml Eppendorf离心管中。
(5)重复步骤4一次。
(6)改用氯仿，重复步骤4一次。
(7)加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，轻柔混匀，加入两倍体积的预冷(-20℃)无水乙醇，轻柔混匀至水相和无机相间无分层。放在-20℃冰箱中2h。4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，保留沉淀。
(8)加入1ml 70％乙醇，上下颠倒数次，4℃，10000r/min离心10min，弃上清。
(9)重复步骤8一次，室温下干燥。
(10)加入100ul TE，45℃，15min溶解DNA，4℃冰箱保存。
2)PCR扩增反应：PCR扩增反应体系的总体积为25uL，反应体系如下：
dd H2O为16.7μL，10×PCR缓冲液为2.5μL，dNTP(各2.5mmol/L)为2μL；
引物18SCOM(10nmol/ml) 1μL；
引物18SB1(10nmol/ml) 1μL；
引物18SW1(10nmol/ml) 1μL；
DNA模板为0.6μL，DNA聚合酶为0.2μL。
PCR循环参数是：
94℃4min→(94℃1min→55℃1min→72℃1min)×34cycles→72℃10min；
所述引物18SCOM为：5’-TTACCCACTCCCAGTTCAGG-3’。
所述引物18SB1为：5’-GAATATGTATACAGGCATTC-3’。
所述引物18SW1为：5’-CATCAGGCCCCTCCGAAGAA-3’。
3)电泳图谱：PCR扩增结束后，取产物5uL，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，并用凝胶成像系统观察并保存结果。
4)结果判断：如果只有400bp左右或者有400bp和330bp左右的两条带扩出，则是白脊管藤壶；如果只有330bp左右的条带扩出，则是纹藤壶，参见图1。