一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法.pdf

本发明公开了一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，是首先低温高速离心处理蛇毒原液，再使用3KDa超滤膜除去蛇毒中小分子物质和低分子多肽等，两步层析分别是CM-Sephrose?FF层析柱和Superdex?200凝胶层析柱，在一次生产中分别得到眼镜蛇神经毒素和眼镜蛇毒因子两种有效成分，本发明具有可以同时分离眼镜蛇毒因子和眼镜蛇神经毒素、有效提高了眼镜蛇毒的利用效率、产品纯度高、适合工业化生产的特点。

1.  一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，其特征在于该方法包含以下步骤：
1)、取蛇毒溶解于纯化水或pH5-8的Tris缓冲液中，10℃以下低温离心，取上清液，过微孔滤膜；
2)、将步骤1)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为3kDa-5kDa的超滤膜进行；
3)、将步骤2)所得到的蛇毒液先后进行离子交换层析和凝胶层析，取相应组分除盐、冷冻干燥，分别得到纯化的眼镜蛇毒神经毒素和眼镜蛇毒因子成分。

2.  根据权利要求1所述的一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，其特征在于所用蛇毒为眼镜蛇毒干粉或冻干粉。

3.  根据权利要求1所述的一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，其特征在于所述步骤1)中，采用0-10℃低温离心，上清液过0.22μm或0.44μm微孔滤膜。

4.  根据权利要求1所述的一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，其特征在于所述步骤2)中，交换的缓冲液为pH5-8之间的Tris-HCl缓冲液或醋酸盐缓冲液或PBS缓冲液中的一种，超滤采用截留分子量为3-5kDa之间的超滤膜系统。

5.  根据权利要求1所述的一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，其特征在于所述步骤3)中包括下述步骤：
a、将步骤2)最终得到的上清液进行截留分子量为3k-5k的超滤；
b、用pH值为5-8的缓冲液平衡阳离子交换柱，将步骤a得到的蛇毒液上样后，0-0.5M含缓冲液的钠盐阶段梯度或线性梯度洗脱；
c、收集步骤b中具有眼镜蛇神经毒素活性成分峰，按照步骤a方式进行除盐浓缩，真空冷冻干燥，得到眼镜蛇毒神经毒素；
d、收集步骤b中流穿峰组分，按照步骤a进行浓缩后上样到Superdex 200层析柱；
e、用10～100mM的氯化钠溶液平衡的凝胶层析柱，层析介质包括Superdex 200、Sephacryl 200或分离分子量在100kDa以上的凝胶层析填料，取步骤d的浓缩液上柱；
f、收集步骤e中的眼镜蛇毒因子成分，按照步骤a方式部分除盐后真空冷冻干燥或者不除盐直接真空冷冻干燥，得到眼镜蛇毒因子。

一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法。
背景技术
眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的一种天然毒蛋白，其化学成分非常复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性，其中主要的有神经毒素、细胞毒素、神经生长因子和眼镜蛇毒因子(CVF)等。随着现代生物技术的发展，眼镜蛇毒的许多组分已得到分离纯化和序列测定，各种成分广泛应用于生物化学、分子生物学、毒理学和药物学理论研究和临床应用。
自1933年Monaelesser和Taguet首次报道眼镜蛇毒对癌组织压迫神经引起疼痛的病例的显著疗效以来，眼镜蛇毒的镇痛作用得到了深入的研究，其中眼镜蛇毒神经毒素(neurotoxin，NTX)显示了独特的镇痛作用，NTX的镇痛机理与吗啡类似，镇痛效果大于吗啡，持续时间长，无麻醉作用，无成瘾性和耐药性，但起效较吗啡慢；同时NTX还能戒除吗啡毒瘾，所以在癌痛或戒毒等方面具有独特的治疗作用。
目前蛇毒神经毒素的提取方法主要是采用离子交换法结合凝胶层析法，现有技术的提取方法存在步骤多、分离周期长、提取成本高，蛇毒一次提取之后不能重复利用等问题。例如：李泛珠等所公开的《浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究》(中国药师，2004，7，9，659-661)中，采用三次柱层析，步骤多、耗时长、提取成本高，不易作为工业化大规模分离纯化工艺；龚潮梁等所公开的《一种分离提纯眼镜蛇神经毒素的简便方法》(1981，2，4，83～87)中，采用CM-纤维素柱吸附并线性洗脱，CM--纤维素树脂允许的线性流速很低，并且极易被压缩，造成工艺耗时长，产品质量不稳定，属于应淘汰的旧工艺。
眼镜蛇毒因子(Cobra venom factor，CVF)，又称为眼镜蛇抗补体蛋白(Cobraanticomplementary protein)，是来源于眼镜蛇科蛇毒的一种旁路补体激活物。由于CVF既能激活补体又能最终耗竭补体，且性质稳定，特异性高，因此被广泛应用于基础医学的研究.具有广阔的临床应用前景，可能用于以下几个方面：研究抗补体作用的工具药；用于抗炎症及抗自身免疫性疾病；抗移植排斥反应；抗肿瘤导向药物等。
由于CVF在眼镜蛇毒中含量甚般，提取较困难，所以很少有公开报道的CVF分离提纯方法，叶春玲等曾公开《一种从蛇毒中分离提纯抗补体因子的简便方法》(中国药理学通报，1997Feb；13(1)：85～87)，采用先凝胶层析再离子交换层析两步层析法分离，凝胶层析采用Bio-gel P200柱，离子交换层析采用DEAE cellulose DE 52柱，该方法可以少量制备样品，但以上两种填料刚性较差，层析柱易压缩，耗时长，不适合做规模化生产工艺，并且大部分蛇毒蛋白未能有效利用。
发明内容
本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种同时分离眼镜蛇毒神经毒素和眼镜蛇毒因子、分步得到重点产品、减少产品间的相互干扰、避免了脱盐引起CVF的溶解度降低而带来的溶液浑浊且容易蛋白变性的问题、综合利用率和提取效率高、产品纯度高、适合工业化生产的眼镜蛇毒因子和眼镜蛇神经毒素的组合分离纯化方法。
本发明的目的是这样实现的，一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，其特点在于该方法包含以下步骤：
1)、取蛇毒溶解于纯化水或pH5-8的Tris缓冲液中，10℃以下低温离心，取上清液，过微孔滤膜；
2)、将步骤1)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为3kDa-5kDa的超滤膜进行；
3)、将步骤2)所得到的蛇毒液分别进行离子交换层析和凝胶层析，取相应组分进行除盐浓缩、冷冻干燥，分别得到纯化的眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素成分。
为了进一步实现本发明的目的，可以是所用蛇毒为眼镜蛇毒干粉或冻干粉。
为了进一步实现本发明的目的，可以是所述步骤1)中，采用0-10℃低温离心，上清液过0.22μm或0.44μm微孔滤膜。
为了进一步实现本发明的目的，可以是所述步骤2)中，交换的缓冲液为pH5-8之间的Tris-HCl缓冲液或醋酸盐缓冲液或PBS缓冲液中的一种，超滤采用截留分子量为3-5kDa之间的超滤膜系统。
为了进一步实现本发明的目的，可以是所述步骤3)中包括下述步骤：
a、将步骤2)最终得到的上清液进行截留分子量为3～5kDa的超滤；
b、用pH值为5-8的缓冲液平衡阳离子交换柱，将步骤a得到的蛇毒液上样后，0-0.5M含缓冲液的钠盐阶段梯度或线性梯度洗脱；
c、收集步骤b中具有眼镜蛇神经毒素活性成分峰，按照步骤a方式进行除盐浓缩，真空冷冻干燥，得到眼镜蛇毒神经毒素；
d、收集步骤b中流穿峰组分，按照步骤a浓缩；
e、用10-100mM的氯化钠溶液平衡的凝胶层析柱，层析介质包括Superdex 200、Sephacryl 200或分离分子量在100kDa以上的凝胶层析介质，取步骤d的浓缩液上柱；
f、收集步骤e中的眼镜蛇毒因子成分，按照步骤a方式部分除盐后真空冷冻干燥或者不除盐直接真空冷冻干燥，得到眼镜蛇毒因子。
本发明方法具有以下优点：
1.本发明可以同时分离眼镜蛇毒神经毒素和眼镜蛇毒因子，提高了眼镜蛇毒这一珍稀资源的利用效率；
2.本发明取阳离子交换柱法分离眼镜蛇毒神经毒素的流穿峰中分离眼镜蛇毒因子成分，两步法中每步骤中得到重点产品，减少产品间的相互干扰；
3.采用直接带盐冻干CVF，避免了脱盐引起CVF的溶解度降低而带来的溶液浑浊且容易蛋白变性的问题；
本发明同时提取眼镜蛇神经毒素和眼镜蛇毒因子，综合利用率和提取效率高，产品纯度高，得到的眼镜蛇神经毒素纯度95％以上，眼镜蛇毒因子纯度90％以上。采用本发明方法得到的眼镜蛇毒因子成分，经SDS-PAGE电泳检验，非还原法为一条带，还原法为三条带。适合工业化生产，并且该两种产品的应用前景广泛。
本发明方法得到的眼镜蛇神经毒素，是由68个氨基酸残基组成的碱基多肽，分子量7000Da左右。由于其碱基多肽的特殊结构所致，经SDS-PAGE电泳检测的表观分子量约12kDa，与科博肽国家标准品一致。
本发明方法得到的眼镜蛇毒因子(CVF)，分子量为130-230kDa，等电点4.4-6.0，三条肽链组成通过二硫键和非共价键链接，经加入DDT(二硫苏糖醇)还原后SDS-PAGE检验为三条带，分子量依次为30kDa、50kDa、66kDa左右。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明方法的到的眼镜蛇神经毒素与购自中检所的科博肽标准品眼镜蛇神经毒素的SDS-PAGE电泳检验对照图。
图2为本发明方法的到的眼镜蛇毒因子加入二硫苏糖醇还原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验图。
具体实施方式
实施例，一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法，是采用以下步骤：
1.样品粗毒的处理
称取蛇毒20g溶解于200ml纯化水或pH5-8的Tris缓冲液中，10℃以下10000rpm低温离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，过膜后溶液用截留分子量为3kDa-5kDa的超滤膜交换为分离缓冲液；
2.CM-Sepharose FF层析
将交换缓冲液后的蛇毒溶液用蠕动泵以10ml/min的流速上样到pH 7.5，20mmol/L的Tris缓冲液平衡的CM Sepharose FF层析柱(5.0×30cm)，并用平衡缓冲液洗脱完流穿峰并收集之，之后的洗脱缓冲液中加入NaCL分别洗脱，加入的NaCL浓度为0.1M，0.2M，0.4M，所有步骤流速均为10ml/min，收集眼镜蛇神经毒素；
3.眼镜蛇神经毒素超滤除盐，冻干
用3Ka分子量的超滤膜膜包将眼镜蛇神经毒素溶液脱除缓冲盐，成为无盐蛋白溶液，将除盐后的蛋白溶液过0.22μm滤膜，无菌分装，冷冻干燥后既得眼镜蛇神经毒素原料药1206mg；
4.眼镜蛇毒因子浓缩
将步骤2收集的流穿峰用10KDa分子量的膜包超滤浓缩至60ml；
5.Superdex 200层析
将60ml眼镜蛇毒因子浓缩液上样到50mM NaCl平衡的Superdex200层析柱5.0×80cm，10ml/min上样，洗脱，收集眼镜蛇毒因子产品峰；
6.除盐、冷冻真空干燥
将步骤5得到的眼镜蛇毒因子产品峰用10KDa分子量超滤膜超滤到5mM NaCl，过0.22μm滤膜，无菌分装，冷冻干燥后既得眼镜蛇毒因子原料药162mg。取本实施例得到的眼镜蛇神经毒素与购自中检所的科博肽标准品(眼镜蛇神经毒素)进行实验对照，SDS-PAGE电泳检验图见图1，图中左侧为本发明产品，右侧为中检所的科博肽标准品。
取本实施例得到的眼镜蛇毒因子，加入二硫苏糖醇还原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验，见图2，由图中可以看出，CVF由分子量为32000Da、49000Da、66000Da的三个亚基组成，符合CVF的特征要求。