地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接ALDOL反应催化剂的应用.pdf

本发明公开了地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接Aldol反应催化剂的应用，具有高效、高选择性、可重复利用、经济、环境友好等特点，应用前景好。

1.  地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接Aldol反应催化剂的应用。

2.  应用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法，其特征在于：在含水有机溶剂中加入地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶以及反应底物醛和酮，搅拌反应，即生成醛和酮的不对称直接Aldol反应产物。

3.  根据权利要求2所述的应用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法，其特征在于：所述醛为芳香醛或杂芳香醛。

4.  根据权利要求2所述的应用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法，其特征在于：所述酮为丙酮、环戊酮或环己酮。

5.  根据权利要求2所述的应用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法，其特征在于：所述有机溶剂为二甲亚砜。

6.  根据权利要求2所述的应用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法，其特征在于：所述水与有机溶剂的体积比为0.15。

7.  根据权利要求2所述的应用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法，其特征在于：所述反应温度为35℃。

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接Aldol反应催化剂的应用
技术领域
本发明涉及地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的新应用，特别涉及地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接Aldol反应催化剂的应用。
背景技术
C-C键的立体选择性形成是有机合成化学的重要方面。醇醛缩合反应(aldol反应)是最有效的C-C键形成反应之一。以前，大多数不对称aldol反应是采用经修饰的底物，即将底物酮衍生为烯醇的形式来进行，这样一方面可以活化底物酮，另一方面可以有效地抑制同种分子间发生反应。虽然在这方面许多手性催化剂均取得了很好的不对称催化效果，但从操作简捷性和原子经济性考虑，这类反应不如未修饰的酮与醛之间的直接aldol反应。因此，寻求能够高效、高选择性地催化不对称直接aldol反应的催化体系逐渐成为有机化学的一项新课题。
由于生物催化剂具有高效性和高选择性等优点，近年来在医药化学品、精细化学品和传统化学品等领域备受关注。它们易于催化得到相对较纯的产品，因此可减少废物排放，还可以完成传统化学催化所不能胜任的位点专一性、化学专一性和立体专一性催化。现阶段应用的生物催化剂主要有酶类和微生物。
由于生物体内广泛存在的醛缩酶可以催化不对称直接aldol反应，因而酶催化的不对称直接aldol反应引起了有机化学家们的兴趣。近年来已有文献报道，脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)、脱羧酶、突变的南极假丝酵母脂肪酶B(CAL-B)等均可以催化aldol反应。但地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(BLAP)催化的aldol反应，尤其是不对称直接aldol反应尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接Aldol反应催化剂的应用；目的之二在于提供应用所述地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
1、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接Aldol反应催化剂的应用。
2、应用所述地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的方法，是在含水有机溶剂中加入地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶以及反应底物醛和酮，搅拌反应，即生成醛和酮的不对称Aldol反应产物。
进一步，所述醛为芳香醛或杂芳香醛；
进一步，所述酮为丙酮、环戊酮或环己酮；
进一步，所述有机溶剂为二甲亚砜；
进一步，所述水与有机溶剂的体积比为0.15；
进一步，所述反应温度为35℃。
本发明的有益效果在于：本发明首次发现地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶为不对称直接Aldol反应的高效、高选择性催化剂。研究结果显示，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶在含水有机溶剂中可以催化芳香醛或杂芳香醛与丙酮或环酮之间的不对称直接aldol反应，生成具有手性的β-羟基醛酮化合物，达到较高的产率和对映体过量值；并且，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为催化剂在不对称直接aldol反应中可以重复利用四次；因此，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为不对称直接Aldol反应的催化剂具有高效、高选择性、可重复利用、经济、环境友好等特点，应用前景好。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1显示了有机溶剂含水量对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接aldol反应的影响；
图2显示了反应温度对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接aldol反应的影响。
具体实施方式
下面将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例中使用的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(EC 3.4.21.14)来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709，购自无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，酶活力为200U/mg。
1、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的条件优化
(1)有机溶剂的优化
本发明以丙酮和对氰基苯甲醛的反应作为模型反应，对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的有机溶剂进行了考察。
方法如下：在圆底烧瓶中加入地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(200mg)、有机溶剂(5ml)、对氰基苯甲醛(200mg，1.5mmol)和去离子水(0.75ml)，室温下搅拌均匀，再加入丙酮(1.0ml，17.0mmol)，35℃搅拌反应139小时，反应完毕后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并滤液和洗液，加水(20ml)稀释后，用二氯甲烷萃取3次(每次20ml)，合并二氯甲烷萃取液，用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏除去溶剂得产物粗品，将粗品用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液)，得纯化产物。
结果见表1，可见以二甲亚砜为反应溶剂时，产物收率最高(31％)，因此，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的有机溶剂优选二甲亚砜。
表1反应溶剂对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化的不对称直接aldol反应的影响


(2)反应含水量的优化
本发明以丙酮和对氰基苯甲醛的反应作为模型反应，对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的含水量(V_水/V_有机溶剂)进行了考察。
方法如下：在圆底烧瓶中加入地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(200mg)、有机溶剂(5ml)、对氰基苯甲醛(200mg，1.5mmol)和去离子水(0～2.25ml，V_水/V_有机溶剂＝0～0.45)，室温下搅拌均匀，再加入丙酮(1.0ml，17.0mmol)，35℃搅拌反应143小时，反应完毕后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并滤液和洗液，加水(20ml)稀释后，用二氯甲烷萃取3次(每次20ml)，合并二氯甲烷萃取液，用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏除去溶剂得产物粗品，将粗品用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液)，得纯化产物。
结果见图1，可见当含水量(V_水/V_有机溶剂)为0.15时，产物收率最高(约85％)，因此，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的含水量(V_水/V_有机溶剂)优选0.15。
(3)反应温度的优化
本发明以丙酮和对氰基苯甲醛的反应作为模型反应，对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的温度进行了考察。
方法如下：在圆底烧瓶中加入地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(200mg)、二甲亚砜(5ml)、对氰基苯甲醛(200mg，1.5mmol)和去离子水(0.75ml)，室温下搅拌均匀，再加入丙酮(1.0ml，17.0mmol)，不同温度下搅拌反应165小时，反应完毕后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并滤液和洗液，加水(20ml)稀释后，用二氯甲烷萃取3次(每次20ml)，合并二氯甲烷萃取液，用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏除去溶剂得产物粗品，将粗品用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液)，得纯化产物。
结果见图2，可见产物收率随着反应温度的升高先增加后降低，当反应温度为35℃时，产物收率最高(约80％)，因此，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的温度优选35℃。
2、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应
为了考察地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化不对称直接Aldol反应的底物普遍性，本发明分别研究了地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化的芳香醛或杂芳香醛或脂肪醛和丙酮之间的不对称直接Aldol反应，以及取代苯甲醛和环酮之间的不对称直接Aldol反应。
方法如下：在圆底烧瓶中加入地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(200mg)、二甲亚砜(5ml)、醛(1.5mmol)和去离子水(0.75ml)，室温下搅拌均匀，再加入酮(1.0ml)，35℃搅拌反应，反应完毕后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并滤液和洗液，加水(20ml)稀释后，用二氯甲烷萃取3次(每次20ml)，合并二氯甲烷萃取液，用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏除去溶剂得产物粗品，将粗品用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液)，得纯化产物。
实验原料和结果见表2和表3。
表2地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化芳香醛或杂芳香醛或脂肪醛和丙酮之间的不对称直接Aldol反应


注：^a硅胶柱色谱纯化后的产物收率；^b采用手性高效液相色谱法测定，产物的绝对构型通过与已知的手性高效液相色谱数据进行比较确定。
由表2可知，在地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化下，芳香醛或杂芳香醛和丙酮可以发生不对称直接aldol反应(序号1～13)：①具有吸电子取代基的芳香醛和丙酮的反应得到中等至较高产率的aldol产物2。例如，硝基或氰基取代的苯甲醛和丙酮的反应得到较高产率(74～87％)的aldol产物2(序号1～4)；除了对氟苯甲醛和丙酮的反应得到较低产率(22％)的aldol产物2(序号8)之外，其它卤代苯甲醛和丙酮的反应均得到中等产率(40～44％)的aldol产物2(序号5～7)。但上述芳香醛和丙酮的aldol产物2只有较低的对映体过量值(6～16％)。相反，具有给电子取代基的芳香醛和丙酮的反应得到较低产率的aldol产物2。例如，对甲氧基苯甲醛或对甲基苯甲醛和丙酮之间的反应分别得到产率为10％和12％的aldol产物2(序号10和11)。究其原因在于，吸电子基增强了芳香醛中羰基碳原子的亲电性，从而有利于aldol反应的发生。②杂芳香醛如2-呋喃醛或2-噻吩醛和丙酮的反应都只得到较低产率(分别为24％和9％)的aldol产物2(序号12和13)。③芳香醛或杂芳香醛和丙酮的反应还生成消去副产物3，它是由aldol产物2消去1分子水而得到。其中，杂芳香醛如2-呋喃醛或2-噻吩醛与丙酮的反应生成较高产率(分别为56％和60％)的消去副产物3(序号12和13)，这可能是由于富电子的含硫或氧原子的杂芳香醛有利于aldol产物2消去1分子水。相反，硝基或氰基取代的苯甲醛与丙酮的反应生成较低产率(11～22％)的消去副产物3(序号1～4)，这可能是由于缺电子的芳香环有利于aldol产物2的稳定。卤代苯甲醛、对甲氧基苯甲醛或对甲基苯甲醛和丙酮的反应生成中等产率(25～38％)的消去副产物3(序号5～8和10～11)。此外，从表1还可以看出，脂肪醛如乙醛、丙醛或正丁醛和丙酮反应120小时后没有产物生成(序号14～16)，这可能是由于脂肪醛不能和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的活性位点有效结合，从而难以被该酶所催化。
表3地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化取代芳香醛和环酮之间的不对称直接Aldol反应


注：^a硅胶柱色谱纯化后的产物收率；^b顺式加成产物和反式加成产物的摩尔比，其中，序号2和4是硅胶柱色谱纯化后的产物比例；序号1和3是由非对映异构体经¹H NMR分析确定；^c采用手性高效液相色谱法测定，产物的绝对构型通过与已知的手性高效液相色谱数据进行比较确定。
由表3可知，在地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的催化下，对硝基苯甲醛或对氰基苯甲醛与环戊酮或环己酮的不对称直接aldol反应30小时即可完成，转化率为87～98％，反应速度明显比相应芳香醛和丙酮之间的不对称直接aldol反应快；产率为53～65％，其中顺式加成产物和反式加成产物的摩尔比为1∶1.1～1∶3.5，反式加成产物为主产物，对映体过量值为31～57％(序号1～4)，说明地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶对aldol反应有较好的对映选择性。此外，从表2还可以看出，与环戊酮相比，环己酮的aldol产物具有更好的顺/反比和对映体过量值。
3、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为催化剂的可重复利用性
为了考察非固定化的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为催化剂的可重复利用性，本发明进行了如下酶回收实验：在圆底烧瓶中加入地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(1.0g)、二甲亚砜(25ml)、对氰基苯甲醛(1.0g)和去离子水(3.75ml)，室温下搅拌均匀，再加入环己酮(5.0ml)，35℃搅拌反应48小时，反应完毕后，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，合并滤液和洗液，加水稀释后，用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，用无水硫酸钠干燥，再减压蒸馏除去溶剂得产物粗品，将粗品用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液)，得纯化产物；滤饼再用乙醇洗涤2次，丙酮洗涤3次，室温下晾干，即回收得到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(回收率＞70％)。回收的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶直接用于下一次不对称直接aldol反应，根据回收的酶量确定反应底物的用量。实验结果见表4。
表4地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的回收和重复利用


注：^a硅胶柱色谱纯化后的产物收率；^b硅胶柱色谱纯化后的顺式加成产物和反式加成产物的摩尔比；^c采用手性高效液相色谱法测定，产物的绝对构型通过与已知的手性高效液相色谱数据进行比较确定。
由表4可知，非固定化的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶作为催化剂，在不对称直接aldol反应中可以重复利用四次。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。