一种从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法.pdf

本发明涉及一种从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其步骤是：(1)将鱼胶原蛋白溶于水，制成胶原蛋白溶液，溶液pH值为6.0-9.0；(2)将胶原蛋白溶液上亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和；(3)使用淋洗剂将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出；(4)使用洗脱剂将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，洗脱过程的温度控制在15－37℃；(5)利用凝胶过滤层析法或膜超滤法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；(6)将浓缩液冷冻干燥，所得白色粉末即鱼胶原蛋白中的功能多肽。本发明中利用纤维连接蛋白作为配基，采用亲和层析的方法分离鱼胶原蛋白中的部分多肽，步骤合理、方法简单，具有分辨率高和特征性强等优点。

1.  一种从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其特征是其步骤为：
（1）将鱼胶原蛋白溶于水，制成胶原蛋白溶液，并将该溶液的pH值调至6.0-9.0；
（2）将胶原蛋白溶液上亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和；
（3）使用淋洗剂将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出；
（4）使用洗脱剂将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，洗脱过程的温度可控制在15－37℃；
（5）利用凝胶过滤层析法或膜超滤的方法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；
（6）将浓缩液冷冻干燥，所得白色粉末即鱼胶原蛋白中的功能多肽。

2.  根据权利要求1所述的从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其特征是：所说的鱼胶原蛋白是鱼鳞胶原蛋白或鱼皮胶原蛋白。

3.  根据权利要求1所述的从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其特征是：所说的亲和层析柱中层析介质的配基是纤维连接蛋白。

4.  根据权利要求1所述的从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其特征是：所说的洗脱剂是含2－8mol/L脲、pH值为3.0－8.0的缓冲液或含5－50％乙醇的水溶液或5－50％乙腈的水溶液。

一种从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种以鱼胶原蛋白为原料分离功能多肽的方法。
背景技术
我们知道，鱼胶原蛋白是指以鱼鳞或鱼皮为原料采用热处理、酸/碱处理、酶法降解或结合多种方式降解获得的混合物，其主要成份是鱼鳞或鱼皮中胶原降解后形成的分子量不均一的多肽类物质。鱼胶原蛋白可作为功能食品或保健品，具有提高人体免疫力、促进钙的吸收、改善血液微循环以及补充氨基酸营养成份等功能，从鱼胶原蛋白中有效识别与分离不同功能的多肽组份是近年来鱼胶原蛋白产品开发中的盲点。
传统的鱼胶原蛋白产品开发的重点主要集中于鱼胶原蛋白制备工艺及其对产品分子量范围及性能的影响。韩国Hee-GukByun利用离子交换色谱和凝胶过滤色谱的方法从胶原蛋白中分离出具有抑制血管紧张素转化酶活性的多肽（ProcessBiochemistry，2001，36：1155-1162）；日本MaruyamaS从胶原蛋白中分离出可抑制血小板活性的多肽（Biochimi.Biophysi.Acta；1993, 1164,215-223）；韩国KimSK采用凝胶过滤色谱结合离子交换和反相色谱的方法从鱼皮明胶中分离出具有抗氧化功能的组份（JAgricFoodChem，2001，49(4):1984-9）。传统的鱼胶原蛋白中不同多肽的分离方法主要基于分子量范围、带电荷状态等性质进行分离，存在分辨率低和特征性不强等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种步骤合理、具有分辨率高和特征性强的基于亲和层析的从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其步骤是：
（1）将鱼胶原蛋白溶于水，制成胶原蛋白溶液，并将该溶液的pH值调至6.0-9.0；
（2）将胶原蛋白溶液上亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和；
（3）使用淋洗剂将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出；
（4）使用洗脱剂将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，洗脱过程的温度可控制在15－37℃；
（5）利用凝胶过滤层析法或膜超滤的方法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；
（6）将浓缩液冷冻干燥，所得白色粉末即鱼胶原蛋白中的功能多肽。
本发明基于亲和层析的从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法中，如果待分离的胶原蛋白原料是水溶液，则省去（1）所述的胶原蛋白溶解过程，直接将胶原蛋白溶液的pH值调制6.0-9.0。
本发明所述的鱼胶原蛋白可以是鱼鳞胶原蛋白或鱼皮胶原蛋白。
本发明所述的亲和层析柱中层析介质的配基可以是纤维连接蛋白。
本发明所述的洗脱剂可以是含2－8mol/L脲、pH值为3.0－8.0的缓冲液，也可以是含5－50％乙醇的水溶液或5－50％乙腈的水溶液。如果采用5－50％乙醇的水溶液或5－50％乙腈的水溶液作为洗脱剂，则省去（5）所述的利用凝胶过滤层析法或膜超滤的方法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩过程，洗脱液直接进行冷冻干燥。
本发明中纤维连接蛋白可与胶原蛋白降解物中的许多多肽特异性结合，利用纤维连接蛋白等作为配基，采用亲和层析的方法分离鱼胶原蛋白中的部分多肽，对照现有技术，本发明步骤合理、方法简单，具有分辨率高和特征性强等优点。
具体实施方式
 下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1：
一种从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其以2mg/ml的鱼鳞胶原蛋白水溶液为原料，从该鱼鳞胶原蛋白中分离功能多肽的方法步骤是：
（1）将原料鱼鳞胶原蛋白水溶液的pH调至7.0；
（2）将鱼鳞胶原蛋白水溶液上样至亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和，也就是说直至透过液中检测出胶原蛋白。亲和层析柱配基：人血浆纤维连接蛋白，柱填料体积40ml，填料粒径：60－120微米；
（3）使用20ml0.2mol/L碳酸氢铵作为淋洗剂淋洗层析柱，流速1ml/min，将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出；
（4）使用20％乙醇溶液在30℃下洗涤层析柱,将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，流速1ml/min，收集前30min组份；
（5）将收集到的组份直接冷冻干燥，获得的白色粉末即为鱼鳞胶原蛋白中的功能多肽。
本发明中利用纤维连接蛋白等作为配基，采用亲和层析的方法分离鱼胶原蛋白中的部分多肽，步骤合理、方法简单，具有分辨率高和特征性强等优点。
实施例2：
一种从鱼胶原蛋白中分离功能多肽的方法，其步骤是：
（1）其以鱼皮胶原蛋白水溶液为原料，将原料鱼皮胶原蛋白水溶液的pH调制为7.0，浓度控制在3-10mg/mL；
（2）将鱼鳞胶原蛋白水溶液上样至亲和层析柱，至透过液中检测出胶原蛋白。亲和层析柱配基为人血浆纤维连接蛋白，柱填料体积40ml，填料粒径：60－120微米；
（3）使用20ml0.2mol/L碳酸氢铵作为淋洗剂淋洗层析柱，流速1ml/min，将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出；
（4）使用8M脲素溶液（含0.1NH₄HCO₃）在20℃下洗涤层析柱,将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，流速1ml/min，收集前35min组份；
（5）将收集到的洗脱液使用凝胶过滤层析柱（SephadexG10）除去溶液中的脲素，得到洗脱液浓缩；
（6）脱盐后的多肽直接冷冻干燥，获得的白色粉末即为鱼鳞胶原蛋白中的功能多肽。
本发明中利用纤维连接蛋白等作为配基，采用亲和层析的方法分离鱼胶原蛋白中的部分多肽，步骤合理、方法简单，具有分辨率高和特征性强等优点。