军团菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 【技术领域】
本发明涉及生物检测试剂，特别的，本发明涉及一种检测军团菌的基因分子诊断试剂。
背景技术
军团菌为需氧革兰氏阴性杆菌，机会致病菌，是一种人类单核细胞和巨噬细胞的兼性细胞内寄生菌军团菌嗜热怕冷，在自然条件下可长期存活于水中，但人工培养极其困难，故有苛养菌之称。该菌具有内毒素(LPS)、外毒素及多种活性酶，使其具有较强的致病性。军团菌广泛存在于天然水源和人工水环境系统中。人感染军团菌最主要的方式是吸入军团菌污染的气溶胶，人吸入的感染剂量尚不十分清楚。气溶胶是军团菌传播、传染的重要载体。天然水源很少与人感染有关，而人工水环境如供水系统可通过水龙头、淋浴、涡流浴、人工喷泉等方式形成气溶胶造成军团菌的感染。水龙头和淋浴是院内军团菌感染的主要气溶胶形成动因。人工水环境系统如冷热水管道系统(浴室、淋浴、饮用喷泉)、空调冷却塔水、旋流池水等可以造成医院获得性感染、社区获得性感染、旅行获得性感染、办公室获得性感染，特别提出的是职业获得性感染。所以对人工环境中的军团菌的快速检测对人们的生活和健康显得非常必要。
目前对军团菌有多种检测方法，其中常用的有培养分离法、荧光抗体染色法、核酸探针法、PCR及其相关技术，其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。
PCR(聚合酶链式反应)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便高效的基因扩增技术在病原菌诊断过程中发挥着重大作用。PCR方法尽管操作起来比较简单易行，扩增产物在短时间内能够大量聚集，但是操作过程必须有高精密的温度循环装置，从而使得这种强有力的方法不能在实地广泛应用。除了PCR方法以外，还有其他核酸恒温扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)，自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1h小时左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，及时将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。
DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ofDNA，简称LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性。
该方法通常是按如下步骤进行：
步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；
步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；
步骤三、进行环介导恒温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；
步骤四、分析判断反应产物结果。
虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：
1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；
2.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。
为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。
【发明内容】
本发明致力于构建一种检测时间短、特异性强、灵敏度高、检准率高的环介导恒温扩增基因试剂盒及检测方法来检测军团菌，使其反应程序化，广泛应用于临床、食品、水产等领域的检测。
本发明提供如下的技术方案：
一种军团菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其包括：
引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：
外引物1：GCGATATCTGGTGGTCTGCA
外引物2：CCGTGGTTTCGAAAACAGCG
内引物1：AGACCACTCGTACCCGTCGCTTTTCGGTGGTTAACGCGCTATC
内引物2：ATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGTTTTACCGTTGACCCCGTCTTCT
Bst DNA聚合酶
反应液：10mM脱氧核苷三磷酸dNTP，10×ThermoPol Buffer反应缓冲液，150mM硫酸镁MgSO4；
样品预处理液：20mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM EDTA，1.2％Triton X-100；
荧光染料SYBR Green I；
阳性对照为军团菌基因组DNA。
另外，本发明的一种军团菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法，其包括：
步骤一：被检样品的预处理：提取军团菌基因组DNA，过程如下：
1、取50μl军团菌增菌液于管中，1000rpm离心2分钟，去上清；
2、加入80μl样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；
3、沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟；
4、10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA；
步骤二：特异性引物制备：
引物合成纯化-定量配制-浓度检测制备得到特异性引物；
步骤三：试剂盒成分组合，其中包括：
1.引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：
外引物1：GCGATCTAGCCATGTGCA
外引物2：CCTAGCCGAAACAGTGCTC
内引物1：TCCTAGCCACACGTCATCCGATTTTTAGGTTGGGTAACACCAACTG
内引物2：TCAAGCCCGGAGATAGCTGGTTTTTAGTAATCATTCACGAGGCGC
2.DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)
3.反应液(含80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol Buffer，20μl 150mMMgSO4)
4.样品预处理液(含20mM Tris-HCl[pH 8.0]，2mM EDTA，1.2％TritonX-100)
5.荧光染料(SYBR Green I)
6.阳性对照(军团菌基因组DNA)
步骤三：环介导恒温扩增(LAMP)反应：
在200ulPCR管配制反应体系：引物混合物4μl，反应液22μl，Bst DNA聚合酶1μl(8U)，模板DNA 2μl，加水至25μl。
将配制好的PCR管于65℃反应1小时。
步骤四：分析判断反应产物结果
在反应产物中加入2.0μl荧光染料(SYBR Green I)，混匀，静置5min。若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
由于原有LAMP的引物设计上条件非常苛刻，本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善。根据军团菌核糖体23S亚基基因序列所设计的六条引物是扩增进行的关键。本发明应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99.9％假阳性率小于0.1％。并且本发明根据检测试剂盒的需要进行的简易DNA提取方法缩短了检测时间，扩增在不到1小时即可完成，且产率高；用于病原微生物的检测和传染病的诊断中，对军团菌的最低检测极限达到10个细胞以内，标本的检出率达到97％，提高了检测灵敏度，使得试剂盒的实际应用价值大大提高。另外，本发明在反应后加入染料，可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，结果鉴定更为直观清晰，避免了光线引起的误差。可广泛用于空气、水人工环境及临床的安全快速检测。
【具体实施方式】
下面将结合实施例详细介绍本发明的试剂盒及检测方法。
实施例：
军团菌等温基因扩增快速检测方法
步骤一：被检样品的预处理：
按常规法，军团菌基因组DNA简易提取过程：
1、取50μl军团菌增菌液于管中，1000rpm离心2分钟，去上清；
2、加入80μl样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；
3、沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟；
4、10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA；
步骤二：特异性引物制备：
引物合成纯化-定量配制-浓度检测可制备得到特异性引物；
步骤三：试剂盒成分组合，其中具体包括：
1.引物
外引物1：GCGATCTAGCCATGTGCA
外引物2：CCTAGCCGAAACAGTGCTC
内引物1：TCCTAGCCACACGTCATCCGATTTTTAGGTTGGGTAACACCAACTG
内引物2：TCAAGCCCGGAGATAGCTGGTTTTTAGTAATCATTCACGAGGCGC
2.DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)
3.反应液(含80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol Buffer，20μl 150mMMgSO4)
4.样品预处理液(含20mM Tris-HCl[pH 8.0]，2mM EDTA，1.2％TritonX-100)
5.荧光染料(SYBR Green I)
6.阳性对照(军团菌基因组DNA)
步骤三：环介导恒温扩增(LAMP)反应：
在200ulPCR管配制反应体系：引物混合物4μl，反应液22μl，Bst DNA聚合酶1μl(8U)，模板DNA 2μl，加水至25μl。
将配制好的PCR管于65℃反应1小时。
步骤四：分析判断反应产物结果
在反应产物中加入2.0μl荧光染料(SYBR Green I)，混匀，静置5min。若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
综上，本发明选择的特异性基因23SrRNA是军团菌菌群中所特有的(见文献Elizabeth J.Nazarian，Dianna J.Bopp，Amy Saylors，Ronald J.Limberger，Kimberlee A.Musser.Design and implementation of aprotocol for the detection ofLegionella in clinical and environmentalsamples.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 62(2008)125-132)。根据目的基因23SrRNA利用专门的引物设计软件设计了四条扩增目的基因片段地引物，传统的PCR方法只使用两条引物，相比较之下，本发明同时使用四条引物从而提高了检测的特异性。
其次，本发明中采用简易的快速提取DNA的方法，大大缩短了检测时间。
另外，本发明在反应结束后，加入后加入染料，结果鉴定更为直观清晰，避免了仅通过观察乳白色沉淀过程中因光线而引起的误差。
以上所揭露的仅为本发明的优选实施例而已，当然不能以此来限定发明的权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。