猪流行性腹泻病毒的生产方法.pdf

本发明公开了一种应用生物反应器微载体培养VREO细胞生产猪流行性腹泻病毒的生产工艺，本发明包涵不同猪流行性腹泻病毒毒株的生产工艺。本发明包括如下技术步骤：(1)选择VERO细胞作为制苗用细胞系；(2)制苗用细胞的传代与培养；(3)猪流行性腹泻病毒细胞毒种的繁殖；(4)VERO细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养；(5)猪流行性腹泻病毒抗原的繁殖；(6)收获病毒抗原液的处理。本发明可以大量降低生产成本，投入产出比提高5-10倍。而且生产周期短，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。

1.  一种猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：
选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择VERO细胞作为制苗用细胞系；
并包括如下步骤：
(1)制苗用细胞的传代与培养：取VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为35-38℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；
(2)细胞毒种的繁殖：用病毒培养液将猪流行腹泻病毒种毒按0.5-5％比例接种到步骤(1)形成的良好细胞单层继续培养，至细胞50-100％以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID₅₀和无菌检测，传至病毒TCID₅₀稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，作为生产种子；
(3)VERO细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：生物反应器按总体积的30％-80％加入无菌细胞生长液，且每升无菌细胞生长液中按3-10g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，低转速搅拌30分钟后，取步骤(1)转瓶上生长良好的VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按1～3×10⁵个/mL的密度接种到反应器中，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养；
(4)制苗毒液的繁殖：待观察微载体上细胞长满80％-90％，空球率低于5％，，满球率大于80％，细胞状态良好，且细胞计数结果达到3～5×10⁶个/mL以上进行接毒操作，按0.5-5％比例介入步骤(2)制备好的猪流行性腹泻病毒种毒，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID₅₀；待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液和微载体；
(5)收获病毒液的处理：病毒液和微载体经2-3次冻融后，离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。

2.  根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：所述的生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。

3.  根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：1)用PBS浸泡微载体三小时以上；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。

4.  根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：所述的EDTA-胰酶细胞分散液配方为：质量体积分数分别是0.25％的规格为1∶250的胰酶、0.02％的EDTA的Hank′s液。
细胞生长液的配方为：质量分数分别是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH为6.8-7.6。

5.  根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：所述的种毒接种量为0.5-5％，病毒培养液配方为：含血清1-4％的DMEM液、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH调整为7.2-7.4。

6.  根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的生产方法，其特征在于：所述的生物反应器设定参数为：培养温度33-38℃、PH6.5-7.68、溶氧30％-70％、搅拌速度30-80rpm。

猪流行性腹泻病毒的生产方法
技术领域
本发明涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养技术生产疫苗的方法，可用于工业化生产猪流行腹泻疫苗，替代传统的转瓶培养法生产工艺。
背景技术
目前，国内猪流行性腹泻疫苗生产唯一依靠细胞转瓶培养法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；不同生产批次间或同一生产批次不同瓶间的差异大；难以扩大生产；容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有细胞转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器微载体细胞培养高效生产猪流行性腹泻疫苗的方法。该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著提高猪流行性腹泻病毒的单位效价以及疫苗产量和质量。
为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒的生产方法，包括如下步骤：
(1)制苗用细胞的传代与培养：取VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以“细胞生长液”培养，培养温度为35-38℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；
(2)细胞毒种的繁殖：用“病毒培养液”将猪流行腹泻病毒种毒按0.5-5％比例接种到步骤(1)形成的良好细胞单层继续培养，至细胞50-100％以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID₅₀和无菌检测，传至病毒TCID₅₀稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，作为生产种子；
(3)VERO细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：生物反应器按总体积的30％-80％加入无菌“细胞生长液”，且每升无菌细胞生长液中按3-10g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，低转速搅拌30分钟后，取步骤(1)转瓶上生长良好的VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按按1～3×10⁵个/mL的密度接种到反应器中，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养。
(4)制苗毒液的繁殖：待观察微载体上细胞长满80％-90％，空球率低于5％，，满球率大于80％，细胞状态良好，且细胞计数结果达到3～5×10⁶个/mL以上进行接毒操作，按0.5-5％比例接入步骤(2)制备好的猪流行性腹泻病毒种毒，设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数，进行反应器自动控制培养；按0.1-5％的比例接入猪流行腹泻病毒种毒毒液，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID₅₀；待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液和微载体；
(5)收获病毒液的处理：病毒液和微载体经2-3次冻融后，离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。
上述技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。
上述技术方案中，微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：1)用PBS浸泡微载体三小时以上；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。
上述技术方案中，“EDTA-胰酶细胞分散液”配方为：质量分数分别是0.25％的胰酶(1∶250)、0.02％的EDTA的Hank′s液；
上述技术方案中，“细胞生长液”的配方为：质量分数分别是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH为6.8-7.6。
上述技术方案中，种毒接种量为0.5-5％，
上述技术方案中，“病毒培养液”配方为：含血清1-4％的DMEM液、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，PH调整为7.2-7.4。
上述技术方案中，生物反应器设定参数为：培养温度培养温度33-38℃、PH6.5-7.68、溶氧30％-70％、搅拌速度30-80rpm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)用生物反应器微载体细胞培养技术代替转瓶细胞培养技术制造猪流行性腹泻疫苗，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低的问题，通过生产技术和生产工艺的改变，提高病毒单位培养效价10-30倍，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安全性。
(2)本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，每个生产周期仅需5-6天，相比现有转瓶细胞培养法的6-7天以上明显缩短。
(3)应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定。易操作、产量大占用场地小，易于快速扩大生产规模。质量易于实现均衡稳定。
(4)应用本方法生产疫苗，产品病毒效价比传统转瓶细胞培养法提高10-30倍，成本降低3-4倍。产品质量均一，易于规模化生产，整个生产工艺过程不涉及传统生产方法所具有的其他生物安全和公共卫生问题。
附图说明
图1为本发明的制备流程图。
具体实施方式
以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。
(1)选择生物反应器作为培养的手段：75L生物反应器。
(2)选择微载体作为细胞贴附生长的载体：微载体Cytodex-2
(3)微载体的清洗、灭菌方法：1)称量Cytodex-2微载体10g/L、使用2L PBS液浸泡三小时。2)每次用2L PBS液清洗3遍。3)加入2L PBS液浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。
(4)选择VERO细胞作为制苗用细胞：
(5)制苗用细胞的传代与培养：上述细胞经EDTA-胰酶细胞分散液(含0.25％胰酶(规格为1∶250)、0.02％EDTA的Hank′s液)消化传代，以含92％DMEM液、8％小牛血清、200IU/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，PH调整为7.2的细胞生长液继续培养，培养温度为36℃。形成良好单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。
(6)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将来猪流行性腹泻病毒种毒按3％比例接种生长良好的上述细胞单层，继续培养，培养温度为35℃。至细胞80％以上病变时收获病毒液；测定病毒的TCID₅₀，待病毒效价稳定且达到10^7.0TCID₅₀/mL以上时停止复壮，将该病毒作为生产用种毒。
(7)VERO细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取转瓶上生长良好的VERO细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数密度按2×10⁵/ml接种反应器中。生物反应器设定如下参数温度37℃、PH7.2、搅拌速度60rpm、溶氧含量50％进行反应器自动控制培养。
(8)制苗毒液的繁殖：培养后第三日待观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达5×10⁶/ml以上后进行接毒操作。设定温度34℃、PH6.8、搅拌速度70rpm、溶氧含量30％等培养参数，进行反应器自动控制培养。接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID₅₀。待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，分别收获上清液和微载体。
收获病毒液的处理：经3次反复冻融后，过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。
半成品检验及疫苗制造、成品检验
1.收获病毒液毒价的测定：将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定毒价。病毒含量应≥10^7.0ELD₅₀/ml。
灭活：按总量的0.2％向病毒液中加入甲醛溶液，振摇2分钟，置37℃条件灭活24小时。期间定时搅拌混匀。
2.灭活后半成品检验
无菌检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。
灭活检验：灭活后，以无菌操作从病毒灭活液中取样，按1％比例接种健康VERO细胞单层，37℃培养3天，按此方法，连续传代3代，细胞不应出现病变为合格。
3.疫苗制造和成品检验按《猪流行性腹泻、传染性胃肠炎二联灭活疫苗制造和检验规程》要求进行。