假高粱及其近似种PCR鉴定方法及其试剂盒 【技术领域】
本发明涉及检疫性杂草假高粱及其近似种的种间鉴定技术领域，是一种用于快速鉴定假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的PCR方法及该方法所使用的试剂盒。
背景技术
假高粱是世界十大恶性杂草之一，我国已将其列入有害生物名单。假高粱的种子特征与拟高粱、苏丹草等Sorghum属其他种十分相似，加之口岸截获的假高粱种子由于小穗轴，颖壳等特征部位易被挤压而折断、破损，给以种子鉴定为主的口岸检疫工作带来更大困难，因此，检疫工作中急需一种可靠而快速的方法来解决这一难题。
目前针对假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草这五个物种的鉴定手段除了形态学之外，还有郭琼霞(2006)等尝试过rDNA ITS区的RFLP分析，可将假高粱与拟高粱区分开来(郭琼霞等，基于rDNA ITS分析的假高粱鉴定方法[J].福建农业学报2006，21(1)：32-34.)。此种鉴定方法的鉴定范围仅限于假高粱、拟高粱两个物种，比本发明的鉴定范围窄，且耗时长1倍左右。方雪恩等(2007)尝试用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)通过检测其醇溶蛋白以区分高粱、苏丹草、黑高粱、假高粱以及一种杂交苏丹草(方雪恩等，高粱属A-PAGE图谱的建立及在种子鉴定中的应用[J]，西北植物学报，2007，27(12)：2399-2403)，该鉴定方法以醇溶蛋白提取为基础，本发明以DNA提取为基础，供PCR所消耗的样品量远少于醇溶蛋白研究的所需样品量，即本发明的样品消耗量比前述方法少，且操作步骤更简单，耗时更短。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种准确快速鉴定假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草这五个物种的鉴定方法及该方法所使用的PCR分子鉴定试剂盒，鉴定的方法包括：1.鉴别PCR；2.电泳检测。试剂盒中包括3对PCR反应引物和标准图谱。
一种快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法，包括提取种子DNA，普通PCR鉴别，PCR循环，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别与标准图谱对比，其特征在于：所述的普通PCR鉴别步骤采用的引物为：
引物JH-1：5’-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3’
引物JH-2：5’-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3’
引物SK-1：5’-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3’
引物SK-2：5’-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3’
引物HS-1：5’-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3’
引物HS-2：5’-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3’。
前述方法中，所述的标准图谱比对包括如下步骤：
利用引物JH进行PCR反应，与JH标准图谱对比，若在250bp和280bp处产生条带，则受试样品为假高粱或黑高粱；
利用引物SK进行PCR反应，与SK标准图谱对比，若在110bp处产生条带，则受试样品为丝克高粱；
利用引物HS进行PCR反应，与HS标准图谱对比，若在250bp处有条带，则受试物种为黑高粱；若在110bp和130bp处均有条带，则受试物种为苏丹草；
利用引物JH进行PCR反应，与JH及HS标准图谱对比，若在250bp、280bp两处均有特异条带，而此样品利用HS引物进行PCR反应未在250bp处产生特异条带，则受试样品为假高粱；
利用引物SK、HS、JH分别进行PCR反应后，并与JH、SK及HS标准图谱对比，若都没有出现特异性的条带，则该受试物种为拟高粱。
一种前述的快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法所使用的PCR分子鉴定试剂盒，该试剂盒至少含有用于前述PCR反应的引物及标准图谱。
本发明的优点在于：可解决假高粱及其近似种鉴定的难题，能在8小时内完成假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草这五个物种的鉴定工作。
【附图说明】
图1是引物JH PCR电泳的标准图谱。图2是引物SK PCR电泳的标准图谱。图3是引物HS PCR电泳的标准图谱。图1至图3中：数字1到5分别表示假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草，ck为清水对照，M为100bp DNA Ladder。
【具体实施方式】
一种快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法，其特征是采用下列步骤对受试样品进行位点特异性PCR鉴别：
①种子DNA提取：按常规进行，用双蒸水将受试样品模板DNA浓度调节至50ng/ul。
②鉴别PCR：引物浓度用双蒸水溶解调节至10pmol/ul。以反应体积为20ul的剂量为参考点，各种物品的用量为：
10×TaqDNA聚合酶缓冲液(15mM MgCl2) 2ul dNTP 0.4ul 引物 各0.8ul TaqDNA聚合酶 0.24U DNA模板 0.8ul 双蒸水 加到20ul
混匀后，瞬时离心。
引物共三对：
引物JH-1：5’-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3’
引物JH-2：5’-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3’
引物SK-1：5’-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3’
引物SK-2：5’-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3’
引物HS-1：5’-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3’
引物HS-2：5’-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3’
③PCR循环：于PCR仪上，94℃3min，(94℃46s，52℃1min，72min)40个循环，72℃60min，4℃结束。
④非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：
A.凝胶的灌制
(1)玻璃板的清洗：用洗洁精把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥备用。彻底干燥后，再进行玻璃板组装、灌胶。
(2)玻璃板的组装：将玻璃板组装好，有缝隙的一边用2.0％的琼脂糖(2g琼脂糖+98ml水)封住，将封好的玻璃板组装在电泳槽上待用。
(3)6％非变性电泳凝胶的配置
组分 用量 30％丙烯酰胺 6ml 1×TBE 24ml 10％过硫酸铵 200ul TEMED 18ul 终体积 30ml
按照上述顺序加入各组分(TEMED一定要最后加入)，充分摇匀后将配好的胶轻轻灌入两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并防止梳子底部产生气泡。(要根据胶框选取合适的梳子，以防产生胶膜，影响点样)，若有漏出应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置于气温让其聚合30min以上。
B.扩增产物的电泳
(1)电泳缓冲液：待凝胶聚合后，在电泳槽中加入1×TBE的电泳缓冲液。
(2)预电泳：将梳子轻轻拔出，200V预电泳10-30min。
(3)上样：预电泳后，将PCR产物4ul和DNA loading buffer混合，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔，尽量缩短加样时间。
(4)电泳条件：接上电源，电泳。参数为恒压200V，电泳1.5h，视DNA分子量大小及带型差异的可辨程度，调整电泳时间)。电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉琼脂糖封胶，准备染色。
C.扩增产物的快速银染法
(1)固定：在容器中混合10％乙醇100ml和500ul冰乙酸，摇匀后加入凝胶，摇3-5min。
(2)染色：1ml 20％AgNO3后平行摇5-8min。
(3)漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2-3次，洗净后倒掉蒸馏水。
(4)显色：混合100ml 3％NaOH和500ul甲醛，迅速震荡，使显影液均匀作用，平行摇动，直至显影。
(5)洗涤：显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水洗凝胶1-2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。
(6)用蒸馏水冲洗干净，吸干水，上面盖上保鲜膜，照相或扫描。
⑤电泳图谱对比
与JH标准图谱对比，使用引物JH，假高粱和黑高粱在250bp、280bp两处均有特异条带，丝克高粱、拟高粱、苏丹草均没有这两条条带。因此，利用引物JH进行PCR反应，若在250bp和280bp处产生条带，则受试样品为假高粱或黑高粱。
与SK标准图谱对比，使用引物SK，丝克高粱在110bp处有特异条带，假高粱、黑高粱、拟高粱、苏丹草均无此带。因此，利用引物SK进行PCR反应，若在110bp处产生条带，则受试样品为丝克高粱。
与HS标准图谱对比，使用引物HS，黑高粱在250bp处有特异条带，假高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草均无此带；苏丹草在110bp和130bp处均有特异条带，假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱均无。因此，利用引物HS进行PCR反应，若在250bp处有条带，则受试物种为黑高粱；若在110bp和130bp处均有条带，则受试物种为苏丹草。
与JH及HS标准图谱对比，若利用引物JH进行PCR反应，在250bp、280bp两处均有特异条带，而此样品利用HS引物进行PCR反应未在250bp处产生特异条带，则受试样品为假高粱。
与JH、SK及HS标准图谱对比，若都没有出现特异性的条带，则该受试物种为拟高粱。
实施上述各步骤所使用的PCR分子鉴定试剂盒中包括有：用于PCR反应的引物以及标准图谱。其中用于PCR反应的3对引物的DNA序列为：
JH-1：5’-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3’
JH-2：5’-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3’
SK-1：5’-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3’
SK-2：5’-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3’
HS-1：5’-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3’
HS-2：5’-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3’。
实施例1
1材料和方法
1.1实验材料
假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草种子，由福建出入境检验检疫局提供。
1.2DNA提取
取样品0.05g，经液氮速冻后研磨至粉末，加入500μlTES*，加50-100μg蛋白酶K，55-60℃温育0.5-1h，期间轻轻摇动混匀；调节NaCl浓度至1.4mol/L，加1/10体积10％CTAB，65℃10min；加入1体积氯仿：异戊醇(24∶1)，轻摇混匀，于0℃30min，之后4℃12000rpm离心10min；取上清，加入225μl 5molNH4AC，混匀，放在冰上30min以上，4℃12000rpm离心10min；取上清，加3μlRnase，于37℃15min，4℃12000离心10min；取上清，加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即12000rpm离心5min，若无DNA团出现，立即置样品于冰上15-30min；弃上清，70％乙醇洗沉淀2次，干燥后溶解于50μlTE中。
(*注3：TES：100mmol/L pH为8.0的Tris，10mmol/L pH为8.0的EDTA以及2％SDS。)
1.3PCR扩增
引物名称 正向引物 反向引物 退火温度 SK 5’-AAAAGCAAGCAAC GGGAAC-3’ 5’-TTTTGGCCTTCCT CTTGGTA-3’ 52℃ HS 5’-GCAGCTCAGGGAC AAATAC-3’ 5’-CTGCTTCAGGTAA GGATCG-3’ 55℃ JK 5’-GGAAGGTCACAAC CTGCATC-3’ 5’-CCATCTGTTCCTT CCCATCT-3’ 58℃
1.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：
1.4.1凝胶的灌制
(1)玻璃板的清洗：用洗洁精把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥备用。彻底干燥后，再进行玻璃板组装、灌胶。
(2)玻璃板的组装：将玻璃板组装好，有缝隙的一边用2.0％的琼脂糖(2g琼
脂糖+98ml水)封住，将封好地玻璃板组装在电泳槽上待用。
(3)6％非变性电泳凝胶的配置
组分 用量 30％丙烯酰胺 6ml 1×TBE 24ml 10％过硫酸铵 200ul TEMED 18ul 终体积 30ml
按照上述顺序加入各组分(TEMED一定要最后加入)，充分摇匀后将配好的胶轻轻灌入两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并防止梳子底部产生气泡。(要根据胶框选取合适的梳子，以防产生胶膜，影响点样)，若有漏出应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置于气温让其聚合30min以上。
1.4.2扩增产物的电泳
(1)电泳缓冲液：待凝胶聚合后，在电泳槽中加入1×TBE的电泳缓冲液。
(2)预电泳：将梳子轻轻拔出，200V预电泳10-30min。
(3)上样：预电泳后，将PCR产物4ul和DNA loading buffer混合，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔，尽量缩短加样时间。
(4)电泳条件：接上电源，电泳。参数为恒压200V，电泳1.5h，视DNA分子量大小及带型差异的可辨程度，调整电泳时间)。电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉琼脂糖封胶，准备染色。
1.4.3扩增产物的快速银染
(1)固定：在容器中混合10％乙醇100ml和500ul冰乙酸，摇匀后加入凝胶，摇3-5min。
(2)染色：1ml 20％AgNO3后平行摇5-8min。
(3)漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2-3次，洗净后倒掉蒸馏水。
(4)显色：混合100ml 3％NaOH和500ul甲醛，迅速震荡，使显影液均匀作用，平行摇动，直至显影。
(5)洗涤：显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水洗凝胶1-2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。
(6)用蒸馏水冲洗干净，吸干水，上面盖上保鲜膜，照相或扫描。
1.5电泳结果比对
与JH标准图谱对比，使用引物JH，若在250bp和280bp处产生条带，则受试样品为假高粱或黑高粱。
与SK标准图谱对比，使用引物SK，若在110bp处产生条带，则受试样品为丝克高粱。
与HS标准图谱对比，使用引物HS进行PCR反应，若在250bp处有条带，则受试物种为黑高粱；若在110bp和130bp处均有条带，则受试物种为苏丹草。
与JH及HS标准图谱对比，若利用引物JH进行PCR反应，在250bp、280bp两处均有特异条带，而此样品利用HS引物进行PCR反应未在250bp处产生特异条带，则受试样品为假高粱。
与JH、SK及HS标准图谱对比，若都没有出现特异性的条带，则该受试物种为拟高粱。
【序列表】
<110>福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>假高粱及其近似种PCR鉴定方法及其试剂盒
<140>200810072360.7
<141>2008-12-12
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的DNA
<400>JH-1
ggaaggtcac aacctgcatc
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的DNA
<400>JH-2
ccatctgttc cttcccatct
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的DNA
<400>SK-1
aaaagcaagc aacgggaac
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的DNA
<400>SK-2
ttttggcctt cctcttggta
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的DNA
<400>HS-1
gcagctcagg gacaaatac
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的DNA
<400>HS-2
ctgcttcagg taaggatcg