采用间充质干细胞制备真皮乳头组织的方法 【技术领域】
本发明涉及一种用于制备具有毛囊诱导能力的真皮乳头组织的方法。
背景技术
除其他细胞之外，毛囊通过上皮和真皮之间的相互作用得以形成并维持，并且已经指出真皮乳头在毛囊的生长中起着关键作用(Cohen J.，J Embryol ExpMorphol.9：117-27，1961；Oliver RF，J Embryol Exp Morphol.15(3)：331-47，1966；以及Oliver RF.，J Embryol Exp Morphol.18(1)：43-51，1967)。在毛囊中，真皮乳头与外根鞘相互作用以诱导毛发形成和生长，并且保持由生长期、中间期以及终止期构成的毛发周期。在由遗传、雄性激素或压力引起的脱发的发展中，真皮乳头逐渐退化，导致毛囊变性。
有几种脱发形式，包括男性型或女性型脱发以及斑秃。在过去，脱发通常通过将人造毛发植入头皮的毛囊根球(root bulbs)来治疗，但是这样的人造毛发植入方法导致一些严重问题，并且现在这样的方法已经被禁用。当前，有两种治疗脱发的方法：药物或天然物质治疗，以及人发(human hair)移植。药物或天然物质治疗可以阻止脱发进展或防止将来的毛发丧失，但当长期使用之后停止给药时，可能加速毛发丧失。另一方面，人发移植涉及从枕部毛发生长区取数簇天然毛发，并将它们移植至光秃区。尽管移植的毛发作为完整的毛囊安置于移植区，且成为经历正常生长周期的永久性毛发，但是待移植的毛发数量非常有限，且在每次手术移植约2000根毛发丝的情况下，通常不可能实施超过三次这样的手术。因此，当前用于治疗脱发的方法具有许多局限性，为了克服这些问题，许多研究者已经尝试通过体外培养毛囊细胞并在治疗区移植它们来恢复毛囊。
当从毛囊分离的真皮乳头细胞被培养出时，它们显示了与皮肤的成纤维细胞相似的结构。这些培养的乳头细胞具有诱导毛囊形成的能力，这得到培养过程中所述细胞倾向于聚集这一事实的支持。换句话说，与皮肤的成纤维细胞不同，真皮乳头细胞在培养的起始阶段相互聚集。然而，所述能力并非被无限维持，且Reynolds等人已经报道，当在体外培养真皮乳头细胞时，在约3至4个传代数之后，真皮乳头细胞逐渐丧失其先天的毛囊诱导能力(Reynolds AJ等人，Development.122(10)：3085-94，1996)。另一方面，Jahoda和Reynolds等人已经报道，当将培养了等于或少于3个传代数的大鼠触须毛真皮乳头细胞植入大鼠的小耳皮肤伤口和背部时，从移植位点反常地出现了显示触须毛型特征的大毛纤维(Jahoda CA.，Development.115(4)：1103-9，1992；和Reynolds AJ.等人，Development.115(2)：587-93，1992)。上述报道表明，为了获得用于移植的大量细胞，真皮乳头细胞的初期培养阶段应该短暂且高效。
通常，原代培养的产率随着从中获得培养细胞的源组织或器官的年龄增长而减少。因此，为了用于毛发再生的细胞治疗，研究者已经将他们的注意力从分化细胞转移至胚胎干细胞或成人干细胞。例如，Kataoka等人已经报道，当移植从源于小鼠骨髓的间充质干细胞和胎儿的上皮/真皮细胞的混合物获得的漂浮细胞时，出现具有毛发生长的皮肤再生，并且在毛囊中发现所移植的间充质干细胞的特异性标志物。该观察结果表明，间充质干细胞也可以有效地用于毛发再生。另外，Richardson等人已经报道，毛囊真皮细胞可以分化成脂肪细胞和骨细胞，Martin等人已经报道，源于骨髓的间充质干细胞和毛囊真皮干细胞均分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及肌细胞。
本发明的发明人注意到了这样的事实，即，源自骨髓、脂肪或脐带的间充质干细胞具有与构成真皮乳头和真皮鞘的细胞相似的特征，因此，本发明的发明人已尝试开发一种用于体外重构真皮乳头组织的有效方法。
【发明内容】
因此，本发明的一个目的是提供一种用于体外制备具有毛囊诱导能力的真皮乳头组织的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备大量真皮乳头组织的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在第一培养基(first culture medium)中培养间充质干细胞，该第一培养基含有600至1900mg/l的氨基酸和12至36mg/l的维生素；
2)在含有2000至3000mg/l氨基酸和40至60mg/l维生素的第二培养基(second culture medium)中培养在步骤(1)中获得的细胞，其中，该第二培养基补充有生长因子且不含血清；
3)将胰蛋白酶或胶原蛋白酶添加至步骤(2)中获得地培养物，以使得细胞团块从培养皿分离，并经历自动聚集，以形成真皮乳头组织；以及
4)收获步骤(3)中获得的真皮乳头组织，并在第二培养基中培养该组织。
【附图说明】
结合附图，本发明的上述及其他目的和特征将会因本发明的以下描述而变得清楚，所述附图分别显示了：
图1A是显示间充质干细胞自脐带的脐带胶质(Wharton jelly)层流出和该细胞的结构的光学显微镜图；
图1B示出源自骨髓和脐带的间充质干细胞的流式细胞计量结果；
图1C是显示源自脐带的间充质干细胞的成骨和成脂分化的照片；
图2是显示源自骨髓、脂肪组织和脐带的间充质干细胞在体外形成真皮乳头组织的过程和真皮乳头组织的结构的照片；
图3是显示本发明的真皮乳头组织具有与完整毛囊的真皮乳头相似的组分并具有毛囊诱导能力的照片；
图4是观察真皮乳头组织和试验实施例2中缺乏真皮乳头的毛囊之间相互作用的实验的示图；
图5是显示当由本发明方法制备的真皮乳头组织与缺乏真皮乳头的毛囊共培养时在体外形成毛球(hair bulb)的照片；
图6是显示在将本发明制备的真皮乳头组织和外根鞘细胞注入裸鼠背部皮肤的内皮之后毛发生长的照片。
【具体实施方式】
本发明的制备方法的特征在于包括：在含有600至1900mg/l氨基酸和12至36mg/l维生素的传统培养基(原代培养基)中培养源自骨髓、脂肪组织或脐带的间充质干细胞(步骤1)，并且在添加有0.1至10000ng/ml生长因子的含有2000至3000mg/l氨基酸和40至60mg/l维生素的高浓度无血清培养基(继代培养基)中培养原代培养的细胞(步骤2)以制备真皮乳头组织。
在本发明方法的步骤(1)中，根据本领域的传统方法，使源自骨髓、脂肪组织或脐带的间充质干细胞在普通细胞培养基中经历原代培养。用于本发明原代培养的细胞培养基可选自、但不限于DMEM(Dulbecco’s Modified EagleMedium)、DMEM/F-12、F-12、McCoy’s 5A、RPMIl 640、Williams’medium E以及IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco′s Medium)。可通过达1至20传代数的一系列原代培养步骤增殖间充质干细胞。
在本发明方法的步骤(2)中，然后在继代培养基(其为高浓度培养基)中培养原代培养的细胞，该培养基含有为普通培养基2至5倍浓度的氨基酸和维生素，同时添加有生长因子，不使用任何基质或基材。可在本发明中使用的生长因子包括、但不限于HGF(肝细胞生长因子)、EGF(表皮生长因子)以及NGF(神经生长因子)，可以以范围为1至1000ng/ml的量添加至继代培养基中。
在本发明方法的步骤(3)中，使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理步骤(2)中获得的培养物，以使细胞从培养皿分离。酶处理赋予细胞流动性并诱导细胞自聚集，缩短聚集体(真皮乳头组织)形成的时间。当胰蛋白酶或胶原蛋白酶被添加至培养基时，其中约90％的细胞在72小时之内形成能够再现真皮形成细胞的特征的自聚集体。例如，在25cm2培养皿上以1×106个细胞接种的情况，形成成百上千个自聚集体。
在本发明方法的步骤(4)中，分离并保存前一步骤中形成的真皮乳头组织。例如，使在步骤(3)中获得的含有组织(自聚集体)的培养基经历离心，以收获自聚集的细胞，并在步骤(2)中使用的培养基中培养所获得的沉淀物。
由本发明方法制备的真皮乳头组织在被植入裸鼠真皮时能够通过与缺乏真皮乳头的毛囊之间的相互作用而诱导毛囊形成，并形成具有毛发周期特征的新毛囊或促进现有毛囊的毛发生长。
由于本发明中使用的继代培养基含有上文提到的为普通培养基2至5倍的氨基酸和维生素，所以可以克服间充质干细胞培养过程中营养素和氧气耗竭的问题，改进细胞的分化特征，导致有助于真皮乳头组织形成。
优选地，根据本发明的继代培养基含有如下高浓度的氨基酸：各30至200mg/l的L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-胱氨酸·2HCl、L-异亮氨酸、L-亮氨酸以及L-赖氨酸·HCl；各30至210mg/l的L-苯丙氨酸、L-色氨酸以及L-酪氨酸；以及各50至600mg/l的其余必需氨基酸。
另外，优选的是，本发明的继代培养基含有如下高浓度的维生素：各0.02至1mg/l的生物素、D-Ca泛酸盐以及核黄素作为可溶性维生素B；各3至16mg/l的氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、吡哆醇·HCl以及硫胺素·HCl；10至15mg/l的无旋光肌醇；以及0.02至0.03mg/l的维生素B12。更优选地，本发明的培养基还包含0.03至0.07mg/l的谷胱甘肽，400至600mg/l的谷氨酰胺，以及1500至3000mg/l的D-葡萄糖。
另外，更优选地，本发明的继代培养基包含3000至3500mg/l的碳酸氢钠(NaHCO3)以及2000至2500mg/l具有pH缓冲效应的HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])；1.0至2.0mM的Ca和0.5至1.0mM的Mg，它们是细胞-细胞黏着必需的微量元素；各0.25至0.7nM的Cu、Fe、Mn以及Zn，它们是细胞代谢所必需的微量元素；以及4000至5000mg/l的氯化钠，用于调整渗透压为280至310mOsm/kg。
另外，为了延长毛囊的培养期，本发明的继代培养基还包含皮质甾醇(HC)、胰岛素(I)、转铁蛋白(T)以及亚硒酸钠(S)。例如，优选的是，继代培养基含有10至100μg/l的皮质甾醇、5至20mg/l的胰岛素、5至20mg/l的转铁蛋白，以及0.005至0.02mg/l的亚硒酸钠。
还更优选的是，使用包含如下组分的继代培养基：165mg/l的CaCl2，0.0001mg/l的CuSO4-5H2O、0.0001mg/l的Fe(NO3)-9H2O、330mg/l的KCl、0.076mg/l的KNO3、98mg/l的MgSO4、0.0001mg/l的MnCl2-4H2O、4,800mg/l的NaCl、3360mg/l的NaHCO3、111mg/l的Na2HPO4、0.0002mg/l的ZnSO4-7H2O、2000mg/l的D-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸钠、2383mg/l的HEPES、15mg/l的苯酚磺酞、50mg/l的L-丙氨酸、100mg/l的L-精氨酸、50mg/l的L-天门冬酰胺、60mg/l的L-天门冬氨酸、182.4mg/l的L-胱氨酸·2HCl、150mg/l的L-谷氨酸、584mg/l的L-谷氨酰胺、60mg/l的L-甘氨酸、62.1mg/l的L-组氨酸、210mg/l的L-异亮氨酸、210mg/l的L-亮氨酸、292mg/l的L-赖氨酸·HCl、60mg/l的L-甲硫氨酸、132mg/l的L-苯丙氨酸、80mg/l的L-脯氨酸、84mg/l的L-丝氨酸、190mg/l的L-苏氨酸、32mg/l的L-色氨酸、208mg/l的L-酪氨酸、188mg/l的L-缬氨酸、0.026mg/l的生物素、0.026mg/l的D-Ca泛酸盐、8mg/l的氯化胆碱、16mg/l的叶酸、14.40mg/l的无旋光肌醇、8mg/l的烟酰胺、8mg/l的吡哆醇·HCl、0.8mg/l的核黄素、3mgl/l的硫胺素·HCl，以及0.026mg/l的维生素B12。
优选用于本发明的继代培养基包含为本领域所使用的普通培养基2倍浓度的氨基酸和维生素，以提供细胞代谢的能量并维持细胞活力。其中D-葡萄糖的水平较低，D-葡萄糖被代谢成乳酸并作为能量来源起着较不重要的作用。继代培养基中影响ATP合成量的L-谷氨酰胺的浓度固定在4mM。另外，继代培养基包含0.7nM的锌、0.25nM的铁、0.4nM的铜以及0.5nM的镁作为微量元素，并含有浓度分别40mM和10mM的碳酸氢钠和具有pH缓冲能力的HEPES。本发明的继代培养基包含终浓度分别1.5mM和0.8mM的钙和镁作为必需矿物，用于细胞间粘附，并还含有4500mg/l的氯化钠，用来调整渗透压至280至310mOsm/kg的范围。
另外，本发明的继代培养基还可包含10mg/l的转铁蛋白作为铁源，0.01mg/l的亚硒酸钠作为无机盐；10μg/l的皮质甾醇、10mg/l的胰岛素以及0.2重量％的白蛋白作为激素；以及20ng/ml的生长因子。
另外，本发明的继代培养基优选通过重碳酸盐和代谢物之间的缓冲相互作用维持在恒定的pH，这对于细胞培养是重要因素。即，由于本发明的继代培养基具有与普通培养基相比更高浓度的氨基酸，诸如Williams′medium E，由于铵(氨基酸的最终代谢物)浓度增加，pH可能增加。但是，所添加的作为缓冲剂的重碳酸盐将培养基的pH维持在7.2至7.5。
本发明的继代培养基中的硫酸铜通过超氧化物歧化酶(SOD，存在于毛囊中的铜依赖性酶和抗氧化剂)的作用抑制由离子键引起的细胞凋亡，并且通过其他铜依赖性酶的作用通过抑制5α-还原酶-1和5α-还原酶-2刺激天然生长因子和细胞外基质的合成。另外，锌是用于锌指转录因子的激活的必需矿物组分。
根据本发明制备的真皮乳头组织是由间充质干细胞分化而来的真皮乳头细胞构成的聚集体，具有与完整真皮乳头相似的约100-200μm的大小，并且，因为它是通过天然细胞接触制备的，因而显示了强力的直接的细胞间相互作用。使用苏木素/伊红的聚集体切片组织学观察结果显示出细胞紧密聚集。另外，根据本发明制备的真皮乳头组织表现出表达4型胶原和层粘连蛋白(完整真皮乳头的基底膜组分)，并且还表达多功能蛋白聚糖(用于鉴定毛囊诱导潜能的标志物)。由于聚集体不需要任何外部刺激或用于细胞黏着和增殖的基质，所以可以大量生产。这样的聚集体显示高毛囊诱导能力，这可通过细胞移植有效地用于治疗脱发，并用于体外研究毛囊特征。
下述实施例意在不限制本发明范围的情况下进一步说明本发明。
制备实施例1：继代培养基的制备
根据表1a至表1d所述的组合物制备出1升含有比传统培养基更高浓度氨基酸和维生素的培养基，并将10mg/l胰岛素、10mg/l转铁蛋白、0.01mg/l亚硒酸钠、10μg/l皮质甾醇以及0.2重量％白蛋白(2g/l)添加至其中，以制备继代培养基。
表1a
表1b
表1c
表1d
实施例1：间充质干细胞的获得
使用磷酸盐缓冲液洗涤分娩过程中获得的脐带3次，并从中去除血管周围的平滑肌和上皮层。将剩下的脐带胶质层切成约3mm×3mm大小，并将碎片置于培养皿上，在培养箱中维持在37℃约4小时，直至碎片附着于培养皿底部。然后将补充有10％FBS的DMEM(Dulbecco′s Modification of Eagle′s Medium)添加至该培养基中。1周之后，细胞开始从脐带的脐带胶质流出，当细胞占据培养皿底部约80％时，将培养基换成新培养基，在其中对细胞进行继代培养。当细胞生长至占据培养皿的约70％时，使用0.05％胰蛋白酶/0.02 EDTA处理培养基以使细胞从培养皿分离，并调整浓度至5×105个细胞/ml。然后，使得细胞与干细胞的标志物CD73、CD90以及CD105的抗体反应20分钟。使用2倍体积的PBS洗涤细胞溶液，并使用流式缓冲液(于PBS中的1％低聚甲醛、0.1％叠氮化纳以及0.5％BSA)。然后，使用FACScan(BD science)对细胞溶液进行流式细胞计量，并使用CELLQUEST软件(BD science)分析。结果显示细胞含有CD73、CD90以及CD 105(图1B)。
另外，为了检查细胞的分化能力，将它们接种至6孔培养板中，并将含有低浓度葡萄糖和补充有10％血清的DMEM添加至其中。培养细胞，直至它们占据约70％的培养皿。然后，使用用于成骨分化或成脂分化的新培养基更换培养基。用于成骨分化的培养基是添加有100nM地塞米松、0.05mM抗坏血酸2-磷酸盐、10mM的β-甘油磷酸酯、10-8M维生素D3以及10％ FBS的DMEM，并且按约3天间隔使用新鲜培养基更换该培养基。3周之后，通过Von Cossa染色方法鉴定细胞为干细胞(图1C)。另外，应用添加有1μM地塞米松、0.05mM甲基-异丁基黄嘌呤(IBMX)、10μg/ml胰岛素、100mM吲哚美辛(idomethacin)以及10％ FBS的DMEM作为成脂分化的培养基。在该培养基中培养细胞3天后，使用添加有10μg/ml胰岛素和10％ FBS的DMEM更换该培养基。按约3天间隔更换该培养基使用新鲜培养基更换该培养基。3周之后，通过油红O染色鉴定细胞为干细胞(图1C)。
源自骨髓和脂肪的间充质干细胞购自Cell Applications Inc.(USA)，通过文献(Schilling等人，Mol and Cell Endocrinol.，271(1-2)，1-17，2007；Kern等人，StemCells，24(5)，1294-1301，2006)中公开的方法鉴定为干细胞。
实施例2：真皮乳头组织的制备
将源自实施例1中获得的骨髓、脂肪组织和脐带分别进行在添加有10％ FBS的DMEM中的单层培养，直至细胞占据培养皿的约80％。然后，使用继代培养基(制备实施例1中制备的无血清高浓度培养基)更换培养基，并向其中添加20ng/ml的HGF(rhHGF，R&D system)。按约3天间隔使用新鲜培养基更换培养基，3周之后，使用范围为20至40μl/cm2量的胰蛋白酶处理培养物，以使细胞从培养皿分离。在使用胰蛋白酶处理之后约24小时，开始发生细胞聚集，并且完全聚集的细胞块开始悬浮于培养基中。在500rpm下使用离心3分钟从培养物分离悬浮的细胞聚集体。将细胞聚集体重悬浮于新鲜培养基中，并保持在培养容器中以保存其培养状态，直至用于下述实验。
图2描述了从源自骨髓、脂肪组织和脐带的真皮乳头组织在体外形成的过程，和间充质干细胞的结构。
试验实施例1：真皮乳头组织的鉴定
使用苏木素/伊红组织学染色方法观察根据实施例2中所述方法制备的真皮乳头组织的大小和接触切片。图3中显示的结果揭示细胞紧密聚集，并对外部刺激引起的崩解具有抵抗力。另外，聚集体的大小为约100-200μm，与天然真皮乳头组织相似。
另外，为了证实4型胶原和层粘连蛋白(天然真皮乳头的基底膜的组分)和多功能蛋白聚糖(用于验证毛囊诱导潜能的标志物)是否在实施例2中制备的真皮乳头组织中得到表达，采用文献(Katsuoka等人，Arch Dermtol Res，280(3)，140-144.1988；Bratka-Robia等人，Vet Dermatol，12(1)，1-6，2002；Soma等人，J Dermatol Sci.，39(3)，147-154，2005)中公开的方法。结果显示它们均在本发明的真皮乳头组织中表达(图3)。
试验实施例2：通过使用人工真皮乳头组织形成毛囊
为了检验实施例2中制备的真皮乳头组织是否可诱导毛囊形成，如下进行实验。
将24孔培养板的各孔充满约700μl胶原溶液，并保持在37℃培养箱中1小时，以诱导胶凝。将实施例2中制备的真皮乳头组织和缺乏真皮乳头的毛囊置于胶原凝胶上，使得它们之间形成300μm的间隙，之后培养5至10分钟，使得它们与凝胶表面接触。在将700μl胶原溶液倒到它上面并使其经历胶凝之后，将K-SFM培养基(Gibco BRL，N.Y.，U.S.A.)添加其中。该实验的简图示于图4。
约1周之后，外根鞘细胞被诱导包围真皮乳头。在约15天之后，观察到外根鞘细胞的数量高至足够形成毛球结构，在约21天之后形成新的毛球(图5)。
这些表现与一篇文献(Arase等人，Skin Pharmacol，7(1-2)，12-15，1994)中先前报道的基本一致，该文献公开了通过共培养人毛囊的真皮乳头和缺乏毛囊的真皮乳头而形成新毛球样结构。因此，已经证实，根据本发明制备的真皮乳头组织具有与天然真皮乳头组织相同的毛囊诱导能力。
试验实施例3：通过使用人工真皮乳头组织体内诱导毛囊形成
将约100至150片实施例2中制备的真皮乳头组织和外根鞘细胞(3×106个细胞)一起分散于100μl生理盐水中，并使用1ml注射器将50μl的所得到的混合物注入裸鼠的背部皮肤的内皮，然后在注射点上放置一标记。
结果，在注射后45天于标记区观察到毛发生长，意味着根据本发明制备的真皮乳头组织具有体内毛囊诱导能力(图6)。
尽管就上述具体实施方案描述了本发明，但是应当知道，本领域技术人员可以对本发明进行不同的修改和改变，这些修改和改变也落在所附权利要求所限定的本发明的范围之内。