一种从鸡蛋中同时提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法.pdf

本发明涉及一种从鸡蛋中同时提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法。该方法具体是将鸡蛋制成匀浆后，加入30％-50％乙腈溶液中混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取，提取液再经饱和正己烷脱脂，最后用氮吹仪吹干。采用本发明方法能将鸡蛋中的甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取出来，简单、方便、快速，回收率高。

1.  一种同时从鸡蛋中提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，其特征在于，将鸡蛋制成匀浆后，加入30％-50％乙腈溶液中混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的用乙酸乙酯-乙腈-氨水提取是用乙酸乙酯-乙腈-氨水振荡萃取，离心，将上清液移出，重复萃取3-4次，合并上清液，即得提取液。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取液在氮吹仪上吹干，用乙腈溶解残渣，再用经纯乙腈饱和的正己烷重复去脂，然后氮吹仪上再次吹干，用30％-35％乙腈溶液溶解残渣，离心，过滤，得滤液，即浓缩液。

一种从鸡蛋中同时提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法
技术领域
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取、净化及浓缩的方法。
背景技术
在对食品残留物进行检测时，如果能同时对多种物质进行检测，那么将大大提高工作效率，但只有同时能将多种残留物同时从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。氟苯尼考微溶于水，溶于有机溶剂。代谢物氟苯尼考胺极性强，易溶于水，国内外关于甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的提取方法有许多报道。提取剂一般为乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。国内外对鸡蛋中该三种药物同时提取的方法未见报道。
发明内容
为了解决现有技术不能同时从鸡蛋中提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的问题，本发明提供了一种同时提取、净化及浓缩方法，该方法简单、方便、快速，回收率高。
本发明所采用的技术方案是：一种同时从鸡蛋中提取甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，是将鸡蛋制成匀浆后，加入30％-50％乙腈溶液中混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取。
所说的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取是用乙酸乙酯-乙腈-氨水振荡萃取，离心，将上清液移出，重复萃取3-4次，合并上清液，即得提取液。
上述所说的提取液在氮吹仪上吹干，用乙腈溶解残渣，用经纯乙腈饱和的正己烷重复脱脂两次，然后氮吹仪上再次吹干，用30％-35％乙腈溶液溶解残渣，离心，过滤，得滤液，即浓缩液。
采用本发明方法能将鸡蛋中的甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺同时提取出来，并经净化、浓缩步骤得到的浓缩液可以供HPLC检测用。
本发明比较了不同的提取剂对回收率的影响，结果表明乙腈、丙酮提取效率较差，回收率较低，均小于40％，乙酸乙酯提取效率虽高，但提取的组织内源性物质较多，同时又不能有效提取氟苯尼考代谢物氟苯尼考胺，因为氟苯尼考胺只有在碱性条件下才能溶于有机溶剂，所以本实验采用乙酸乙酯-乙腈-氨水(49∶49∶2)作为提取剂，三种药物的提取效率都很高，均达到86％以上，碱性的乙酸乙酯-乙腈可有效提取氟苯尼考胺，且不影响其他两种药物的提取；乙腈可有效去除部分蛋白质，减少内源性杂质，有利于样品净化。
筛选出鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺残留的最佳前处理方法。该方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在86％以上，日内和日间RSD均分别低于5.7％和9.8％，符合AOAC残留测定要求。
具体实施方式
本发明中所涉及的试剂的百分浓度，除特别说明外均指质量百分浓度。
1.实验鸡的饲养、给药和样品采集
1.1实验鸡选择及分组
选取28周龄京海黄鸡175只，体重1.75±0.20kg，随机分成7组，每组25只，单笼饲养。A、B、C组为甲砜霉素试验组，D、E、F组为氟苯尼考试验组，G组为空白对照组。给药前分别称重、编号。试验前预饲1周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。
1.2给药剂量、途径及样品采集
各试验组产蛋鸡投药剂量如表1所示。给药前先将甲砜霉素和氟苯尼考灌注于空心胶囊中，然后分别直接投入到鸡的嗉囊中。试验组每天给药一次，给药时间均在上午8:00-9:00，连续5d，自给药日起至停药后15d内收集每天的鸡蛋。
表1给药方案

2(1)本发明提取、净化与浓缩步骤：
①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；
②准确称取2.0-3.0g鸡蛋匀浆样品，放于30-50mL具塞离心管中；
③加入1-1.5mL 30％-50％乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；
④加入4-6mL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49∶49∶2，V/V)，旋涡振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min；
⑤6000-8000r/min离心10-15min，上清液转移至20-25mL玻璃管中；
⑥重复提取3-4次，合并上清液；
⑦在35-55℃水浴中，用氮气吹干；
⑧加入1.0mL-1.5mL乙腈溶解，涡旋振荡混匀1-2min；
⑨加3.0-5.0mL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；
⑩在35-55℃水浴中，用氮气吹干；冷冻保存；
上机前用1.0mL 30％-35％乙腈溶解，转移至1.5mL离心管中；
12000-13400r/min离心15分钟，上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定。
(2)乙腈提取、净化与浓缩步骤：
①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；
②准确称取2.0g鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中；
③加入1mL 35％乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；
④加入4mL乙腈，涡旋振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min；
⑤6000-8000r/min离心10-15min，上清液转移至25mL玻璃管中；
⑥重复提取3-4次，合并上清液；
⑦在35-55℃水浴中，用氮气吹干；
⑧加入1.0mL乙腈溶解，旋涡振荡混匀1-2min；
⑨加3.0mL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；
⑩在35-55℃水浴中，用氮气吹干；冷冻保存；
上机前用1.0mL 35％乙腈溶解，转移至1.5mL离心管中；
12000-13400r/min离心15分钟，上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定。
(3)丙酮提取、净化与浓缩步骤：
①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；
②用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；
③准确称取2.0g鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中；
④加入2mL pH7.0的磷酸盐缓冲液，旋涡振荡混匀1-2min；
⑤加入4mL丙酮旋涡振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min；
⑥6000-8000r/min离心5min；
⑦将溶液转移到另一支15mL离心管中；
⑧再向溶液中加入3mL二氯甲烷，旋涡振荡混匀1min，再用超声波振荡萃取15min；
⑨6000-8000r/min离心5min；
⑩弃去上层水相，置45℃氮吹仪上吹干；
(11)用1mL 35％乙腈溶解残渣，涡旋振荡混匀1min；
(12)加入3mL正己烷(用纯丙酮饱和)涡旋振荡混匀1min，脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；
(13)水相转移至1.5mL离心管，上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定。
3回收率的测定3.0g匀浆后的空白鸡蛋匀浆液，置50mL聚丙烯离心管中，添加不同浓度的标准工作液，使得空白空白蛋液中甲砜霉素添加量分别为0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg；氟苯尼考添加量分别为0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg；氟苯尼考胺添加量分别为0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg。每个添加量设6个平行，经上述样品的提取、净化和浓缩后，进样80μL作HPLC检测。HPLC检测条件：色谱柱为C18，5μm，250mm×4.6mm；流动相为乙腈∶NaH₂PO₄溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.10％三乙胺)＝30～35∶70～65(V/V)，用85％H₃PO₄调pH至4.5-4.8；荧光检测器，激发波长225nm，发射波长285nm；流速：1.0～1.2mL/min；柱温：25～30℃。根据峰面积计算添加回收率。本发明方法提取样品的结果见表2。乙腈、丙酮提取样品的结果见表3、表4。
表2鸡蛋中甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及变异系数(n＝6)

表3鸡蛋中甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及变异系数(n＝6)

表4鸡蛋中甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及变异系数(n＝6)

4精密度的测定  将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份，得到高、中、低三种药物浓度的样品，在同日内6次重复测定高、中、低三种药物浓度的样品，求得日内(批内)精密度。在一周内不同日6次重复测定高、中、低三种药物浓度的样品，求得日间(批间)精密度。其结果见表2。