个体RHD基因合子型测定的PCR引物及试剂盒及测定方法 本申请是如下发明申请的分案申请：原申请的申请号为200410032010.X，申请日为2004年3月25日，发明名称为“个体RHD基因合子型测定的PCR引物及试剂盒及测定方法”
【技术领域】
本发明涉及用于个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的PCR引物，及用于个体RHD基因合子型测定或PHD基因数目测定的试剂盒、及个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的方法。
背景技术
2000年德国Wagner等发现在PHD基因两侧各有一段高度同源的序列，约9000bp，在RHD基因5’-端称为上游Rh盒子，3’-端称为下游Rh盒子。RHD阴性单倍体的RHD基因缺失即发生在上、下游盒子之间，并形成一个融合Rh盒子。根据这一原理，RHD(+)/RHD(+)和RHD(-)/PHD(-)纯合体分别拥有上、下游Rh盒子以及仅拥有融合Rh盒子，而PHD(+)/PHD(-)杂合体则同时拥有三种Rh盒子。
Rh血型D抗原(D抗原在红细胞膜表达与否定义为Rh阳性或Rh阴性)是引起严重新生儿溶血病的主要红细胞抗原，编码D抗原的基因为RHD基因，一般一名Rh阳性个体拥有一条RHD基因[RHD杂合子，RHD(+)/RHD(-)]或二条RHD基因[RHD纯合子，RHD(+)/RHD(+)]，Rh阴性个体则缺失RHD基因[RHD缺失纯合体，RHD(-)/RHD(-)]。以往RHD基因数目或RHD合子型测定主要是根据Rh小因子表型估计，或通过复杂的家系调查，或根据RhD抗原的量等间接方法鉴别，2000年国际上建立了第一个RHD基因合子型直接测定技术，为限制性片段长度多态性(RFLP)方法，该方法采用一对PCR引物同时扩增下游和融合Rh盒子，然后采用限制性内切酶作酶切，再电泳分析片段大小多态性，一次实验结果可以判断三种RHD合子型，但是该方法操作复杂、耗时较长。2001年和2002年，中国香港学者和奥地利学者分别独立报道了采用扩增突变阻滞检测系统和实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术检测已知Rh阳性表型个体的RHD基因数目，该技术同样较为复杂且要求特殊的仪器，而且不能区分RHD(+)/RHD(-)和RHD(-)/RHD(-)合子型。2003年本专利发明人之一邵超鹏等设计建立了简易的聚合酶链式反应(PCR)检测方法，一次可判断三种RHD合子型，但是在随后的应用中发现由于引物位置和反应区域等原因，造成存在一定比率的假阳性和假阴性现象。
【发明内容】
本发明的第一个目的是针目前国内外个体PHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的方法存在的上述各种问题，提供特异性的用于个体RHD基因合子型测定的PCR引物。
本发明的第二个目的是采用本发明的特异性PCR引物，提供一种能克服之前方法复杂或需特殊仪器设备等局限性，能降低之前方法存在的假阳性或假阴性率，能准确进行个体PHD基因合子型测定或PHD基因数目测定的试剂盒。
本发明的第三个目的是采用本发明的试剂盒，提供一种操作简便的个体RHD基因合子型测定方法。
本发明的目的是这样实现的：
本发明的个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定技术采用序列特异性引物-聚合酶链式反应技术，(sequence specificprimer-polymorase chain reaction，缩写PCR-S SP或S SP-PCR或PCR/SSP)，聚合酶链式反应又称体外扩增技术，序列特异性引物-聚合酶链式反应技术是其一种方式，也有称为等位基因特异性或核甘酸特异性的PCR技术。
我们根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的基因序列或核酸序列，确定了二对特异性寡核苷酸引物，用于个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定。
本发明的二对特异性寡核苷酸引物分别如下：
(1)上游引物Hy-s：其3’端位置是在Rh融合盒子(hybrid Rhesusbox，序列见NCBI GenBankAJ252313)第4988位碱基处；下游引物Hy-a：其3’端位置是在Rh融合盒子第7710位碱基处；
(2)上游引物D1-s：其3’端位置是在相对RHD基因编码区第一个碱基位置的-554位碱基处(序列见NCBI GenBank AJ252314)；下游引物D1-a：其3’端位置是在RHD基因第一内含子的第18位碱基处。
上述每段特异性寡核苷酸引物的长度为21-28个核苷酸。引物序列以靠近3’端的4-5个碱基决定其反应特异性，靠近5’端的碱基可根据情况增加或较少。
上述二对特异性寡核苷酸引物使用如下序列较佳：
(1)上游引物Hy-s：5’-TGAGCCTATAAAATCCAAAGCAAGTTAG-3’，下游引物Hy-a：5’-CCTTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGC-3’，
(2)上游引物D1-s：5’-TCAACTGTGTAACTATGAGGAGTCAG-3’，下游引物D1-a：5’-GCTATTTGCCTGTGACCACTT-3’。
上述较佳引物的核苷酸序列及所处的位置请见如下表1：
反应管 引物名称 特异性 基因序列 引物序列(5’-3’) 3’-碱基位置 bpH Hy-s RHD(-) AJ252313 5’-TGAGCCTATAAAATCCAAAGCAAGTTAG-3’ 4988 2778 Hy-a AJ252313 5’-CCTTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGC-3’ 7710，D D1-s RHD(+) AJ252314 5’-TCAACTGTGTAACTATGAGGAGTCAG-3’ exon1，-554 767 D1-a AJ252314 5’-GCTATTTGCCTGTGACCACTT-3’ intron1，+18I CHPA-1-U HPA M32672 5’-GCCATAGTTCTGATTGCTG-3’ 1459 367 HPA-1-L4 M32672 5’-CTTGTCTTCCCACCCCATTT-3’ 1787
表1
表1中“IC”为一对内对照引物，检测人类血小板抗原，“基因序列”为在美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank进行登记的基因序列编号，“bp”表示扩增产物的碱基长度。
采用本发明的上述特异性寡核苷酸引物，制备成本发明的用于个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的试剂盒。
本发明的用于个体RHD基因合子型测定或PHD基因数目测定的试剂盒，包含本发明的上述一对或二对特异性寡核苷酸引物。当试剂盒包含本发明的第一对特异性寡核苷酸引物时，可用来鉴别RHD(+)/RHD(+)与RHD(+)/RHD(-)，或鉴别RHD(+)/RHD(+)与RHD(-)/RHD(-)合子型；当试剂盒包含本发明的第二对特异性寡核苷酸引物时，鉴别RHD(-)/RHD(-)与RHD(+)/RHD(+)，或鉴别RHD(-)/RHD(-)与RHD(+)/RHD(-)合子型。当试剂盒包含本发明的两对特异性寡核苷酸引物时，可一次判断三种RHD基因合子型，即一次测定个体是三种中的哪一种RHD基因合子型。
本发明的试剂盒可以是仅包含一对或二对特异性寡核苷酸引物，还可以包含有PCR扩增反应液。二对引物可装于同一容器内，也可分别装于二个容器内，分别装于二个容器内较佳。当二对特异性寡核苷酸引物分别装于二个容器时，每个容器内的PCR扩增反应液包含：PCRBuffer、MgCl22.5mM、dNTPs200μM、甘油5％(v/v)、甲酚红0.005％(w/v)，其余为纯水，特异性寡核苷酸引物地浓度为0.6pmol/μL，。
本发明的试剂盒还可包含有内对照引物，例如表1中所示的内对照引物IC。
本发明的试剂盒还可包含有DNA聚合酶。
上述的PCR扩增反应液、内对照引物可装在或不装在包含有本发明的特异性寡核苷酸引物的每个容器内。
采用本发明的试剂盒对个体PHD基因合子型或RHD基因数目进行测定，该方法包括如下顺序的步骤：
(1)试剂盒的准备：试剂盒包含两种RHD基因检测用PCR测定混合液，分装于2个容器内，每种测定混合液包含有PCR Buffer、MgCl22.5mM、dNTPs200μM、甘油5％(v/v)、甲酚红0.005％(w/v)、权利要求1中所述的二对中的一对特异性寡核苷酸引物0.06pmol/μL、内对照引物0.25pmol/μL，其余为纯水；
(2)在各反应容器内分别加入两种中的一种测定混合液8ul；
(3)每个反应容器加入1ul DNA样品，含DNA0.05-0.1微克；
(4)每个反应容器内加入1ul稀释好的DNA聚合酶，含DNA聚合酶0.2活力单位；
(5)根据PCR扩增仪类型，加或不加1滴石蜡油覆盖反应液；
(6)离心数秒后放入PCR扩增仪中进行扩增，在95℃下预变性5-10分钟，接着进入循环，在92℃下变性20秒钟，在64℃下退火30秒钟，在68℃下延伸5分钟，共40个循环，在40循环后，继续在72℃下延伸5分钟；
(7)上步所得PCR产物直接点样，于2％琼脂糖凝胶电泳15-20分钟，在紫外光下拍照记录。
本发明的用于个体RHD基因合子型测定的试剂盒及测定方法具有如下优点：
1.先进性、特异性和高准确率。本发明的第二对引物设计，避开检测目前观察到的存在基因变异的下游Rh盒子(downstreamRhesus box)，而根据中国人的Rh分子背景----尚未发现个体RHD基因第一外显子缺失的现象，定为检测RHD基因的第一外显子；本发明的第一对引物检测融合Rh盒子，亦避开与下游Rh盒子序列相对应的区域(二同源大于96％)，因此扩增产物片段较大(为2778bp)。二对引物经对511例样本检测，未发现假阳性或假阴性现象，显示较好的稳定性和可靠性。
2.本发明的试剂盒及测定方法易于操作和简便。本发明的试剂盒及测定方法采用序列特异性引物-PCR技术，对PCR扩增仪的型号无严格要求，9700型、9600型、2400型及梯度变温型扩增仪等均可；PCR产物电泳无需上样缓冲液，可直接电泳；DNA聚合酶可用热启动酶(金牌酶)，也可用普通Taq酶。因此本发明的试剂盒及测定方法应用弹性比较大，实验人员不需要特殊培训，根据说明书即可操作。
【附图说明】
图1是实施例一的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
实施例一：
一、个体RHD基因合子型测定或PHD基因数目测定试剂盒组成：
包括二种PHD基因合子型检测用PCR测定混合液及DNA聚合酶稀释液，二种测定混合液分装于2个试管内，分别标记为H和D。每种测定混合液总体积为25ul，含：10×PCR Buffer2.5ul、25mMMgCl22.5ul、10mM dNTPs0.5ul、50％(v/v)甘油2.5ul、0.05％(w/v)甲酚红2.5ul、前述本发明较佳的二对特异性寡核苷酸引物(表1中的D1-s和D1-a及Hy-s和Hy-a)中的一对特异性寡核苷酸引物2.5ul(浓度为0.6pmol/ul)、以及浓度为2.5pmol/ul的内对照引物IC(参见表1)2.5ul，其余为纯水。试剂盒直接放于-20℃以下冻存。
二、个体PHD基因合子型或PHD基因数目测定：
3个待检DNA样品：A、B、C。
一块96孔的微孔板，每个样品2个反应孔。孔A1-A2为样品A，孔A3-A4为样品B，孔A5-A6为样品C。
测定步骤如下：
1.每个样品的两个反应孔中分别加入二种不同的测定混合液8ul；
2.每个反应孔加入1ul DNA样品，含DNA0.05-0.1微克；
3.每个反应孔加入1ul金牌DNA聚合酶稀释液，约含0.2活力单位；
4.采用9600型PCR扩增仪，加1滴石蜡油覆盖反应液；
5.离心数秒后放入PCR扩增仪中进行扩增，在95℃下预变性5-10分钟，接着进入循环，在92℃下变性20秒钟，在64℃下退火30秒钟，在68℃下延伸5分钟，共40个循环，在40循环后，继续在72℃下延伸5分钟；
6.把上步所得PCR产物直接点样，于2％琼脂糖凝胶电泳20分钟，紫外光下拍照记录。
三、结果电泳图：
请见图1，图1中：M为DNA分子量标准，内对照产物为367bp。RHD(-)/RHD(-)个体和RHD(+)/RHD(+)个体分别为仅融合Rh盒子(图中Hyb，2778bp)或RHD基因(图中Exon，767bp)扩增为阳性，而RHD(+)/RHD(-)杂合型个体则同时出现2778bp条带和767bp条带。
由此，可得出各个样品的RHD基因型如下：
A为RHD基因缺失纯合体，可记录为RHD(-)/RHD(-)个体，其RHD基因数目为零；
B为RHD基因杂合体，可记录为RHD(-)/RHD(+)个体，其PHD基因数目为1；
C为RHD基因纯合体，可记录为RHD(+)/RHD(+)个体，其RHD基因数目为2。
核苷酸序列表
<110>深圳市血液中心
<120>个体RHD基因合子型测定的PCR引物及试剂盒及测定方法
<160>4
<170>Patent-in Version3.1
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>4