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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210234149.7 (22)申请日 2012.07.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103520787 A (43)申请公布日 2014.01.22 (73)专利权人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路457号 (72)发明人 马小军陈立张英于炜婷 李娜马颖李珅王雨 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (51)Int.Cl. A61M 1/16(2006.01) (56)。
2、对比文件 US 2012/0111795 A1,2012.05.10, CN 202078582 U,2011.12.21, CN 101569767 B,2011.06.22, CN 102091360 A,2011.06.15, JP 昭61-255665 A,1986.11.13, CN 201033178 Y,2008.03.12, 审查员 魏兰兰 (54)发明名称 一种基于载微胶囊往复式生物反应器的混 合型人工肝 (57)摘要 本发明公开了一种含有两个循环通路的混 合型人工肝支持系统， 包含装载有微囊化肝细胞 的往复式生物反应器， 血浆分离器， 储血池， 血液 透析器， 膜式氧合器。。
3、 血液先后经血浆分离器、 血 液透析器， 进入储血池， 经由蠕动泵， 进入生物反 应器， 有效地解决了人体对血液体外高流速循环 的不耐受性与生物人工肝血浆高通过率需求之 间的矛盾。 同时生物人工肝通路采用往复式流向 变动， 实现反冲及提高混合效果， 能有效减少微 胶囊在反应器一端筛网堆积造成的流动阻塞， 降 低反应器内压力以及减少持续施压造成的微胶 囊破损， 同时能在高流速及高肝细胞密度条件下 实现较好的物质混合， 肝衰竭血浆能与肝细胞充 分接触， 有效避免灌注死腔和无效灌注， 较少剪 切损伤， 能够最大限度地发挥人工肝的治疗作 用。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 1035207。
4、87 B 2016.09.14 CN 103520787 B 1.一种基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 包括装载有微囊化肝细胞的 生物反应器(8)， 血浆分离器(1)， 储血池(5)， 血液透析器(4)， 膜式氧合器(6)， 细胞滤膜 (10)， 除泡器(11)， 其中通过储血池构成两个相对独立的物理型和生物型人工肝通路， 生物 型人工肝通路流向往复式变化， 即生物型人工肝通路能通过蠕动泵配套相应的外控设备和 程序或者电磁阀实现自动往复式流向转换， 转换频率0.0002Hz0.02Hz； 其中所述的混合 型人工肝中物理型人工肝通路包括血浆分离器(1)， 血浆分离器(1)包括血液输入。
5、端、 血浆 输出端和血细胞输出端， 血浆分离器血浆输出端依次经蠕动泵(2)、 肝素泵(3)、 血液透析器 (4)， 接储血池(5)， 储血池另一端经除泡器(11)， 与血浆分离器的血细胞输出端汇合。 2.按照权利要求1所述基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 其特征在于： 所述的混合型人工肝中生物型人工肝通路一端与物理型人工肝通路的储血池(5)相连通， 依次经蠕动泵(7)、 载微胶囊生物反应器(8)、 细胞滤膜(10)， 另一端再接储血池， 与储血池 相连接的两接口都在血液液面下方。 3.按照权利要求1所述基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 其特征在于： 所述的混合型人工肝具。
6、有两个流速、 流向相对独立的物理型和生物型人工肝通路， 生物型 人工肝通路可自行调节流量在1001000ml/min。 4.按照权利要求1所述基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 其特征在于： 所述的物理型人工肝通路， 血液透析器位于储血池之前， 血浆经透析器处理后进入生物型 人工肝通路； 所述的物理型和生物型人工肝通过储血池连接， 储血池体积在50500ml， 其 内部耦合有膜式氧合器， 能够为微囊化细胞提供充足的氧。 5.按照权利要求1所述基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 其特征在于： 所述的生物反应器为上下等径柱体或者不等径锥形柱及其衍生形状， 径高比0.110， 体。
7、积 在2002000ml， 微胶囊装载体积在50100。 6.按照权利要求1所述基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 其特征在于： 所述的生物反应器上下两端具有10100 m的筛网。 7.按照权利要求1所述基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 其特征在于： 所述的细胞可以为有限消化或培养形成的细胞团， 包括同源、 异源原代肝细胞、 永生化细胞 株、 肝癌细胞株、 定向诱导分化的干细胞或前体细胞， 细胞密度为51065108细胞每毫 升微胶囊。 8.按照权利要求1或7所述基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝， 其特征在 于： 所述的微胶囊为静电络合、 共价交联形成的中空或含。
8、固相内核的生物微胶囊， 其材料为 天然或人工合成的具有良好生物相容性的高分子化合物， 其粒径在1001000 m。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103520787 B 2 一种基于载微胶囊往复式生物反应器的混合型人工肝 技术领域 0001 本发明涉及一种医疗设备， 特别是一种临床治疗急性肝衰竭的混合型人工肝支持 系统。 背景技术 0002 急性肝衰竭是常见的危重疾病， 死亡率高达65-95， 目前肝脏移植是治疗急性肝 衰竭唯一有效的方法， 但是肝源严重短缺， 大多数患者在等待肝源的过程中死亡， 因此有必 要发展体外人工肝支持系统， 暂时代偿肝脏功能， 帮助患者自身肝脏恢复再生， 或者帮患。
9、者 桥接过渡到肝脏移植期。 载有高活性肝细胞的生物型人工肝能有效的执行肝脏合成、 转化 等功能， 同时为了较少代谢物对肝细胞的损伤， 强化解毒功能， 联合物理型人工肝构成的混 合型人工肝， 能有效的发挥肝脏功能， 为肝衰竭病人提供支持。 0003 生物反应器是生物型人工肝的核心部件， 其基本要求： 1.高密度的细胞载量； 2.高 通量的物质交换； 3.一定免疫隔离作用。 目前应用最多的反应器是中空纤维生物反应器， 其 优点是比表面积大， 便于代谢物的转运， 且反应器死腔较小， 但由于肝细胞在反应器中分布 不均， 也易造成细胞活力的下降、 缺氧和交换效率低。 因而有学者尝试采用海藻酸钙凝胶珠 包。
10、埋技术实现肝细胞的高密度包埋， 装载到一定容积的反应器内， 与血浆进行物质交换， 这 种凝胶珠型生物反应器操作简便， 易放大， 同时肝细胞的三维生长可以重建细胞生长微环 境， 促进细胞-细胞相互作用， 有助细胞分化功能的表达。 但是凝胶珠强度有限， 容易出现细 胞泄露等问题， 因而在海藻酸钙胶珠表面交联阳离子聚合物， 形成强度较好的微胶囊， 有效 减少细胞泄露， 同时增加免疫隔离性。 早期的凝胶珠或微胶囊型反应器采用的是固定床直 接灌注， 固定床反容易形成堵塞和短路， 形成固有通道， 从而导致灌注死腔和无效灌注， 并 且高流速下， 高剪切力和持续的柱压力易造成胶珠或微囊破碎。 最近开发的凝胶珠。
11、型或微 胶囊型反应器大多数为流化床形式， 在稳定流化状态下， 凝胶珠或微胶囊在反应内自上而 下的往复运动， 从而实现充分的混合和均匀的传质。 但是流化床反应器反应器体积相对较 大， 胶囊的填充率较低， 需要较大空腔体积来实现流化； 另外由于微胶囊或凝胶珠本身物性 所限， 其流化速率较低， 流化床反应器的血浆通过率很低。 0004 肝细胞由于其旺盛的代谢作用， 对营养物质消耗需求也较大， 尤其是氧气， 据报道 肝细胞耗氧速率为0.59-0.70nmol/106cells/s， 按治疗所需最少细胞量109计， 则所需最小 的血浆流量应在160ml/min， 而人体肝脏血液流量约为1.5L/min，。
12、 可见生物型人工肝要达到 理想的效果， 则要求较高的血浆通过。 由于急性肝衰竭患者对血液体外循环总体积有一定 的耐受上限， 因而反应器体积不宜过大， 同时由于技术以及病人耐受问题， 血浆分离循环通 路流量通常在200ml/min以下。 因此需要开发新型反应器及人工肝系统， 能够实现细胞与血 浆 （血液） 良好的物质交换， 提供肝细胞充足的营养物质 （包含氧气） ， 肝细胞分泌的功能分 子能及时进入血浆 （血液） 发挥作用； 保持细胞生长代谢活性； 保护细胞免受剪切和免疫杀 伤等。 说明书 1/4 页 3 CN 103520787 B 3 发明内容 0005 因此， 本发明设计的一种基于载微胶囊。
13、往复式生物反应器的混合型人工肝， 具有 两个流向和流速相对独立通路， 从而能在人体耐受前提下， 实现高通过容量的血浆灌注； 同 时生物反应器两端往复式调节流向， 减少堵塞和无效灌注， 能在较小的反应器体积内实现 微胶囊、 血浆的充分混合， 增加传质效率。 0006 本发明采用的技术方案为： 0007 一种混合型人工肝支持系统， 包括包含装载有微囊化肝细胞的生物反应器， 血浆 分离器， 储血池， 血液透析器， 膜式氧合器， 细胞滤膜， 除泡器， 其中通过储血池构成两个相 对独立的物理型和生物型人工肝通路， 生物型人工肝通路流向往复式变化。 0008 所述的人工肝支持系统中物理型人工肝通路包括血浆。
14、分离器， 血浆分离器包括血 液输入端、 血浆输出端和血细胞输出端， 血浆分离器血浆输出端依次经蠕动泵、 肝素泵、 血 液透析器， 接储血池， 储血池另一端经除泡器， 与血浆分离器的血细胞输出端汇合。 0009 所述的人工肝支持系统中生物型人工肝通路， 包括一端与物理型人工肝通路相连 通的储血池， 依次经蠕动泵、 载微胶囊生物反应器、 细胞筛网， 接储血池， 与储血池相连接的 两接口都在血液液面下方。 0010 所述的人工肝支持系统具有两个流速、 流向相对独立的物理型和生物型人工肝通 路， 生物型人工肝通路可自行调节流量在100-1000ml/min。 0011 所述的物理型和生物型人工肝通过储。
15、血池连接， 储池体积在50-500ml， 其内部耦 合有膜式氧合器， 能够为微囊化细胞提供充足的氧。 0012 所述的物理型人工肝通路， 血液透析器位于储血池之前， 血浆经透析器处理后进 入生物型人工肝通路。 0013 所述的生物反应器为上下等径柱体或者不等径锥形柱及其衍生形状， 径高比0.1- 10， 体积在200-2000ml， 微胶囊装载体积在50-100。 0014 所述的生物反应器上下两端具有10-100 m的筛网。 0015 所述的生物型人工肝通路能通过蠕动泵配套相应的外控设备和程序或者电磁阀 实现自动往复式流向转换， 转换频率0.0002Hz-0.02Hz。 0016 所述的细胞。
16、可以为有限消化或培养形成的细胞团， 包括同源、 异源原代肝细胞、 永 生化细胞株、 肝癌细胞株、 定向诱导分化的干细胞或前体细胞， 细胞密度为5106-5108细 胞每毫升微胶囊。 0017 所述的微胶囊为静电络合、 共价交联形成的中空或含固相内核的生物微胶囊， 其 材料为天然或人工合成的具有良好生物相容性的高分子化合物， 其粒径在100-1000 m。 0018 本发明公开了一种含有两个循环通路的混合型人工肝支持系统， 包含装载有微囊 化肝细胞的往复式生物反应器， 血浆分离器， 储血池， 血液透析器， 膜式氧合器。 血液先后经 血浆分离器、 血液透析器， 进入储血池， 经由蠕动泵， 进入生物。
17、反应器， 有效地解决了人体对 血液体外高流速循环的不耐受性与生物人工肝血浆高通过率需求之间的矛盾。 同时生物人 工肝通路采用往复式流向变动， 实现反冲及提高混合效果， 能有效减少微胶囊在反应器一 端筛网堆积造成的流动阻塞， 降低反应器内压力以及减少持续施压造成的微胶囊破损， 同 时能在高流速及高肝细胞密度条件下实现较好的物质混合， 肝衰竭血浆能与肝细胞充分接 说明书 2/4 页 4 CN 103520787 B 4 触， 有效避免灌注死腔和无效灌注， 较少剪切损伤， 能够最大限度地发挥人工肝的治疗作 用。 附图说明 0019 图1为本发明的结构示意图， 其中： 1为血浆分离器； 2为蠕动泵； 。
18、3为肝素泵； 4为血 液透析器； 5为储血池； 6为膜式氧合器； 7为蠕动泵； 8为载微胶囊生物反应器； 9为包埋有肝 细胞的微胶囊； 10为细胞滤膜； 11为除泡器； a为血液； b为血浆； c为血细胞； d为氧气。 0020 图2为往复式生物反应器流量随时间变化的曲线， 实线为未采用往复式转换流向 时的流量变化， 虚线为采用往复式转换流向时流量变化。 0021 图3为往复式生物反应器连续灌注6小时后 （每十五分钟转换一次流向） 微胶囊的 形态。 具体实施方式 0022 如图1所示， 一种混合型人工肝支持系统， 包含装载有微囊化肝细胞的往复式生物 反应器， 血浆分离器， 血液透析器， 储血池。
19、， 氧合器。 0023 所述的人工肝支持系统中物理型人工肝通路包括血浆分离器， 血浆分离器包括血 液输入端、 血浆输出端和血细胞输出端， 其血液输入端与人体输血管的输出端连接， 血浆分 离器血浆输出端依次经蠕动泵、 肝素泵、 血液透析器， 接储血池， 储血池另一端经除泡器， 与 血浆分离器的血细胞输出端汇合， 经输血管输回人体。 0024 所述的人工肝支持系统中生物型人工肝通路， 包括管路， 管路一端与物理型人工 肝通路的储血池相连通， 管路依次经蠕动泵、 载微胶囊生物反应器、 细胞筛网， 接储血池， 与 储血池相连接的管路两接口都在血液液面下方。 0025 实施例1 0026 肝衰竭病人血液。
20、经血浆分离器1， 由蠕动泵2泵入物理型人工肝回路， 经血液透析 器4， 去除部分毒素后进入储血池5， 过程中肝素泵3持续注射肝素； 储血池5体积50-500ml， 上端通过空气滤膜连通大气， 含有膜式氧合器6， 血浆适当补充氧气后进入生物型人工肝通 路， 由于物理型人工肝通路和生物型人工肝通路通过储血池连接， 因而两循环通路相对独 立， 流量、 流向互不干扰。 血浆由蠕动泵7泵入生物反应器8 （体积200-1000ml） ， 与微囊化肝 细胞 （粒径100-1000 m； 装载体积占反应器体积50-100） 进行物质交换， 反应器8上下端 口有50-100 m的软质筛网， 能防止微胶囊随血浆带。
21、出反应器， 蠕动泵7连接配套的外控设备 或电磁阀， 通过相应的程序控制， 实现流向往复式转变， 达到反冲与混合效果， 回路中配备 1-5 m细胞滤膜， 防止可能的泄漏细胞进入血液通路。 0027 实施例2 0028 肝细胞聚集体制备： 灌注法或机械法得到的肝细胞， 通过有限消化， 形成细胞团， 或消化后的单细胞经旋转培养形成100-300 m的细胞团。 0029 微囊化肝细胞制备： 细胞团和海藻酸钠混悬， 细胞密度1107-1108cells/ml， 经 高压静电制备仪滴入钙液中， 形成的海藻酸钙胶珠和聚赖氨酸或壳聚糖溶液反应成膜。 实 验室自制多通道制备仪， 能在10min制备100ml的微。
22、囊化肝细胞， 减少了制备过程对细胞活 性的损伤。 说明书 3/4 页 5 CN 103520787 B 5 0030 生物反应器： 反应器设计体积200-2000ml， 径高比小于0.1-10， 上下两端口有50- 100 m的软质筛网， 微囊化细胞从上端装载， 装载体积在50-100， 带密封圈的法兰封闭 反应器。 0031 往复式流向转换设备： 带外部控制-输入的蠕动泵， 蠕动泵配件外控模块 （通讯控 制方式RS485） ， 计算机 （上位机） ， 通讯转换模块 （上位机通讯控制方式RS232转为RS485） ， 计 算机调试软件 （由蠕动泵厂家编译， 可自动控制流向， 流速， 泵启动等）。
23、 。 计算机调试软件提 供数字控制信号， 经通讯转换模块和泵外控模块转换成蠕动泵可接收的电平信号， 从而控 制蠕动泵自动完成往复式的流向转换。 0032 血浆灌注： 肝衰竭病人血液经股动脉导出， 经血浆分离系统， 分离的血浆由蠕动泵 驱动进入物理型人工肝回路， 经血液透析器去除部分毒素后， 从上端口进入储血池 （50- 200ml） ， 储罐上部预留1/5空体积， 去除可能产生的气泡， 膜式氧合器管补充氧气为生物反 应器中细胞代谢提供足够氧气， 血浆经蠕动泵驱动进入生物型人工肝回路， 从上端口 （下端 口） 进入生物反应器， 由下端口 （上端口） 返回储血池， 电脑软件驱动蠕动泵外控设备， 产。
24、生 往复电平， 使蠕动泵往复式地改变流向 （往复时间30s-3000s） ， 经处理的血浆经细胞筛网去 除可能泄漏的细胞， 血浆与分离的血细胞重新混合后输回病人体内， 为了防止储血池中可 能出现的 “短路” 现象， 储罐连接物理型人工肝回路的进出口为上下两端， 连接生物型人工 肝回路的进出口为储罐左右两壁中下部， 呈对称式分布。 0033 载微胶囊往复式生物反应器灌注实施例： 采用微胶囊为高压静电法制备的海藻酸 钠-聚赖氨酸固化核心微胶囊， 膜厚15-20 m， 粒径400-500 m。 采用的反应器为中压层析柱 10mm80mm， 微胶囊填充量高度为50mm， 灌注液为0.9NaCl溶液。 。
25、泵速恒定40rpm， 未填 充微胶囊时对应流量为16ml/min， 起始灌注方向为自上而下， 通过外控设备控制蠕动泵每 20分钟变换流向。 从附图2可以看出， 填充床单一流向灌注， 随着灌注时间增长， 流量逐渐减 少如图2实线部分， 表明在持续的柱压下， 微胶囊填充床层出现堵塞， 而通过每15分钟往复 式变流向， 可以使流量稳定在起始灌注流量16ml/min， 如图2虚线部分。 另外， 反应器内连续 灌注6小时后， 反应器内的微胶囊形态完整， 破碎率小于1如图3， 表明往复式生物反应器 能够有效减少填充床灌注堵塞现象， 同时避免了在单向灌注持续柱压造成的微胶囊破碎现 象。 说明书 4/4 页 6 CN 103520787 B 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 103520787 B 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 103520787 B 8 。