一种乳腺癌相关位点检测方法 【技术领域】
本发明涉及疾病相关位点检测技术领域，更具体地，涉及乳腺癌相关位点检测方法技术领域，特别是指一种乳腺癌相关位点检测方法。
背景技术
乳腺癌是发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，为妇女最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌，中国乳腺癌的发病率逐年上升，目前已达到万分之五。研究证明，乳腺癌是遗传倾向最显著的癌症之一，5％～10％的乳腺癌来自家族遗传。乳腺癌易感基因BRCA1、BRCA2突变与乳腺癌高度相关，并具有显性遗传特征，在家族性乳腺癌症候群中，一旦此基因产生突变，其家族子代中所有成员皆有50％的机会带有此突变基因。家族性乳腺癌患者罹患乳腺癌之平均年龄比一般妇女提早约十年，机率高达普通女性的九倍。以下是BRCA突变导致的随年龄增长的患乳腺癌累计风险：
年龄(岁) 30- 40- 50- 60- 70- BRCA1 3.2％ 19.1％ 50.8％ 54.2％ 85％ BRCA2 4.6％ 12％ 46％ 61％ 86％
研究表明，brca1/brca2基因突变是乳腺癌发病风险增高的最重要的遗传因素。一个含有Brca1遗传突变基因的人，一生中发生乳腺癌的机会大于80％，同时发病的年龄比较早，往往在50岁以前，并同时伴有40％～60％患卵巢癌的风险。Brca2基因突变者患乳腺癌的风险也高达45％，而brca1和brca2二者共同突变的携带者患乳腺癌的机率近乎100％。而且brca1基因突变的妇女有40％～60％的风险患卵巢癌，带有brca2基因突变的妇女则有10％～20％的机率患卵巢癌。
在中国乳腺癌死亡率逐年提高并趋于年轻化，主要原因是发现时已经是癌症中晚期，但是如果在癌症早期发现治疗后，治愈率可高达100％。然而，传统的乳腺癌检测方法主要包括：X线诊断、超声显像检查、细胞学及组织学诊断等，这些方法在乳腺癌的常规检测中起了重要作用，但普遍不适用于真正意义的乳腺癌准确的早期诊断，随着分子生物学、细胞生物学和免疫学研究的进展，乳腺癌的研究由细胞病理学进入分子病理学领域，生物诊断技术成为一种很有前途的治疗手段，特别是近年来人类基因组研究取得的丰硕成果进一步推动了生物诊断技术的发展，分子病理诊断已逐步成为乳腺癌诊断的一个重要内容。目前常用的基因检测方法有免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而现有方法均是基于对癌症发生导致的异常如癌基因的扩增或表达的肿瘤标志物进行检测，为了更早地预防乳腺癌的发生，需要在癌症发生前就提前通过基因检测准确筛查出高风险人群，并对这一人群进行有针对性的健康管理，才能做到真正的早预防，再结合核磁共振和超声波等影像学检测手段以及乳腺癌肿瘤标志物检测，真正实现乳腺癌的早发现、早治疗。
【发明内容】
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种乳腺癌相关位点检测方法，该检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
该乳腺癌相关位点检测方法，其特点是，包括步骤：
a.提取来自人的样本的基因组DNA；
b.根据Brca1和Brac2基因序列设计至少二对引物对，对所述基因组DNA进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；
c.对所述PCR扩增产物进行测序，并分析测序结果来判断Brca1和Brac2基因是否发生突变。
较佳的，所述引物对用于检测Brca1基因的第321位、第337位、第346位、第891位和第1458位密码子中的一个或几个位点，及Brca2基因的第814位、第936～937位、第949位、第1037位和第2156～2157位密码子中的一个或几个位点。
较佳的，所述引物对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
较佳的，所述引物对是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
较佳的，所述引物对是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
较佳的，所述引物对是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
较佳的，所述引物对是SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
较佳的，所述引物对是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
本发明的创新点在于几个突变位点的整合，通过选取多个乳腺癌的高发突变位点，根据Brca1基因和Brca2基因设计特异性引物对来自人地样本的基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，将基因体检的结果作为乳腺癌健康管理的主线，监控疾病的发生发展。如果是乳腺癌遗传风险度高的人群，建议减少一切乳腺癌的外在致病因素，并每半年进行一次乳房核磁共振(MRI)检查，做到早预防，早发现，早治疗，延缓甚至避免疾病的发生。
【具体实施方式】
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。
1.基因组DNA提取：
1.1试剂和仪器：
1.1.1试剂和耗材：基因组DNA抽提试剂盒(TIANamp BLOOD DNA kit，DP318-03；TIANamp Micro微量样品基因组DNA提取试剂盒，DP316；TIANamp口腔拭子基因组DNA提取试制盒，DP322-03)含：细胞裂解液CL；缓冲液GA；缓冲液GS；缓冲液GB；缓冲液GD；漂洗液PW；洗脱缓冲液TB；Carrier RNA；RNase-free ddH2O；蛋白酶K(20mg/ml)；吸附柱；收集管(2ML)；1.5ML无菌收集管。无水乙醇。
1.1.2仪器：DENVILLE260离心机；XW-80A旋涡混合器；H.H.S指针式电热恒温水浴锅。
1.2提取步骤
从全血中提取基因组DNA
1.2.1取200μl的抗凝全血至1.5ml的Eppendorf管中，如果样本的量少于200μl，则加入缓冲液GS补充至200μl。如果样本量多于200μl，需要用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm离心1分钟，吸取上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。
1.2.2加入20μl的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200μl的缓冲液GB，立刻充分颠倒混匀。56℃水浴样本10分钟，水浴过程中请每隔3分钟上下轻柔颠倒混匀样本，溶液应变清亮。(如溶液未彻底变清亮，可延长裂解时间至溶液变清亮为止)。
1.2.3加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，这时可能会出现絮状沉淀。
1.2.4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
1.2.5向吸附柱中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
1.2.6向吸附柱中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
1.2.7向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。
1.2.8将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
1.2.9将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。
若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
2.基因目的片段扩增：
进行6个PCR反应，详见下表：
PCR反应使用的引物序列如下表：
PCR反应体系如下：
PCR循环条件：
PCR扩增后产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增片段大小，确定是否为检测目的片段，如是将目的片段的胶块割下，进行胶回收纯化。
3.胶回收纯化
3.1PCR产物纯化试剂盒：北京博大泰克生物工程有限公司。
3.2Kit组成及保存(室温保存)：
50次(ml) 100次(ml) 胶DNA吸附柱 50个 100个 溶胶液 40 75 浓缩漂洗液 15 30 洗脱缓冲液 5 10 2.0ml eppendorf管 50个 100
3.3准备工作：浓缩缓冲液按1∶3的比例加入无水乙醇，混匀。盖紧瓶盖保存。
3.3步骤(离心使用国产TGL-16B离心机)
3.3.1制胶：用400ml TAE溶液溶解6g的Agarose，终浓度为1.5％(质量体积比，1.5gAgarose/100mlTAE)。用微波炉加热溶解Agarose(可加热两次，每次三分钟，防止爆沸)。室温冷却至60℃。加入18ul的浓度为10mg/ml的EB，混匀后，将胶倒入一茬好梳子的胶槽中。待胶彻底凝固，取出梳齿，切下取所需胶孔量用铲子将胶移至胶槽里后再放到电泳槽中，加入1×TAE。(备注：胶槽每次放到制胶平台时下面都要垫上一次性吸水纸，防止污染)
3.3.2上样：10uL样品+2uL溴酚蓝染料，混匀，上样。5ul DNA Marker DL2000(北京天为时代)。
3.3.3电泳：接通恒直流电源，150伏特电压电泳，根据片段大小，电泳15-25分钟。
3.3.4割胶：割下含DNA的Agarose胶块，使它尽可能小，尽可能薄的胶片，放入1.5ml离心管。尽量去掉不含DNA的琼脂糖，这样对提高质量、简化操作均有利。(备注：将胶槽从电泳槽里拿出，放在吸水纸上将缓冲液吸干，在紫外台上垫上保鲜膜，用镊子固定胶块进行割胶，割胶完成后，用镊子将割好的胶转移到离心管中，注意：每转移一个胶块，镊子都要放到酒精溶液中清洗，以防污染。)
3.3.5溶胶：加入500ul的溶胶液，55℃水浴10min，(计时器定时)使胶块完全熔化，每2min颠倒混匀一次。
3.3.6目的片段＜500bp时，加入100ul的异丙醇，混匀。55℃水浴1min，混匀。目的片段＞500bp时，可省略该步骤。
3.3.7转移：将溶化的Agarose液移入吸附柱，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
3.3.8在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。如果室温低于20℃，离心前先静置1min。
3.3.9在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
3.3.10在12000rpm离心2min，静置10min。
3.3.11将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中。在吸附膜中央加入12～25ul T1液(根据电泳条带亮度决定)，静置5min，12000rpm离心2min。将上述DNA溶液-20℃保存。如果室温低于20℃，室温静置时间延长至5min，或者50℃水浴静置2min，以确保DNA完全溶解并洗脱下来。
3.3.12对纯化后的PCR进行电泳鉴定，2uL样品+1ul溴酚蓝染料，混匀，上样。5ul DNAMarker DL2000(北京天为时代)。观察条带的亮度决定BDT反应模板用量。
4测序反应
4.1试剂
50％BigDye terminator 3.1(100μl BDT+100μl BDT Buffer)；双蒸水；醋酸钠/乙醇溶液(3N NaAC 2.5ml+EOH 37.5ml)；70％(-20℃冷冻)乙醇溶液。
4.2反应操作流程：
4.2.1将所有特异引物稀释到3.2pmol/μl(＝3.2μM)。
4.2.2开始加样。按先加水，再加引物，最后加模板的顺序按体积从大到小将所有样品加好(引物1μl，总体积4μl)。应分别将试剂加在反应管不同方向的管壁上(水加于下方，引物加在左边，模板加在上方)。注意要特别小心，严禁错加、漏加、多加任何其中的一项，每加完一个项，应目测检查有无加错。因所加样品及试剂均较少，防止时间太久，导致已加的试剂挥发，使整个反应体系失去平衡，操作时要快速准确。
4.2.3加完后，盖上封口膜，4℃离心，速度到4000rpm即可。将所有液体收集到管底。
4.2.4将96孔板的缺口置于左下角，加入1μl BDT，BDT要加在管壁的左边，加完并检查无遗漏后，盖上封口膜，离心(同3.5.1.7)，盖上盖子，振荡，再离心(同3.5.1.7)注意最后一步离心后不要将已收集到管底的液体再次振动。
4.2.5放入PCR仪中，进行扩增反应(96℃2min；96℃30s，50℃30s，60℃4min，25cycles；4℃∞)。此过程约需3小时。
4.2.6PCR反应结束后离心(速度达到4000rpm即可)，揭开盖子(注意勿将管底液体振起，同时按顺序将盖子排好)，加入20μl的乙醇和NaAc的混合溶液，盖上盖子，振荡后再低温(4℃)高速离心(4000rpm)30分钟。
4.2.7揭开盖子，盖上吸水纸，反向离心(小心速度决不能超过600rpm，严格控制离心时间，当速度达到600rpm即停止离心)。
4.2.8向上步得到沉淀中加入冷冻(-20℃)的70％乙醇100μl，盖上盖子，充分振荡后，离心(4000rpm)15分钟。
4.2.9倒去上清液，盖上吸水纸，反向离心(同4.2.7)。
4.2.10将洗涤好的沉淀在室温下放置10分钟左右，让残留乙醇全部挥发。
4.2.11加入20ul ddH2O，将反应管移至3700上样底座，离心(速度达到4000rpm即停止)抽检反应管，看是否样品溶液已经离心至管底。最后将上样底座小心放入3700仪器的上样平台上，开动仪器电泳(3700电泳前先重启一次)。
4.2.12观察仪器运行正常后，清理好实验台，检查门窗是否关好，未使用电器的插线板应关掉电源，确保实验室在无人时的安全。
5.结果分析：
将测序导出的ab1格式的测序文件导出后，使用Chromas软件进行分析，结果如下：
5.1检测Brca1基因中的位点：
反应1：用于检测Codon321TGG＞delT，测序结果表明Codon321位点无缺失；
用于检测Condon337GAA＞delA，测序结果表明Condon337位点无缺失；
用于检测Condon346CCC＞TCC，测序结果表明Condon346位点为野生型；
反应2：用于检测Codon891TCC＞delT，测序结果表明Codon891位点无缺失；
反应3：用于检测Codon1458CAG＞TAG，测序结果表明Codon1458为野生型。
5.2检测Brca2基因中的位点：
反应4：用于检测Codon 814CCC＞delC，测序结果表明Codon 814无缺失；
反应5：用于检测Codon936-937delAAAC，测序结果表明Codon936-937无缺失；
用于检测Codon 949TAT＞delT，测序结果表明Codon 949无缺失；
用于检测Codon1037CAA＞TAA，测序结果表明Codon1037为野生型；
反应6：用于检测Codon2156-2157TCTCAA＞del TC，测序结果表明Codon2156-2157无缺失。
根据上述检测结果，可以判断上述受检的Brca1基因和Brca2基因均正常，没有发生变异，受检者患乳腺癌的几率很小，无需进行专门的针对性的健康管理。但是如果其中一个或两个基因突变，那么需要进行进一步的乳腺癌检查以确定是否已经患有乳腺癌，并进行专门的针对性的健康管理。
综上所述，本发明的乳腺癌相关位点检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。
需要说明的是，在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。
【序列表】
<110>上海基康生物技术有限公司
<120>一种乳腺癌相关位点检测方法
<160>12
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)...(22)
<223>根据人Brca1基因序列设计的上游引物
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aacaccactg agaagcgtgc ag 22
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<212>DNA
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