麻疯树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白及其编码基因 【技术领域】
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在麻疯树中表达的jc-Hmgrs蛋白(麻疯树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白，Jatrophacurcas 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，JCHMGRs)及其核酸序列。
背景技术
当前麻疯树种子油作为生物燃油的研究、开发和应用已成为生物能源研究的热点，并且随着麻疯树用作生物燃油研究的快速发展，对于最大限度地发挥其经济效益和取得良好的生态环境效益-其副产物的合理利用也已成为麻疯树研究的又一热点。
麻疯树毒素-佛波醇脂(12-脱氧-16-羟基佛波醇，12-deoxy-16-hydroxy-phorbol)是一种二萜类化合物，主要存在于麻疯树植物种子、树皮、叶、根和乳汁中。研究报道，麻疯树种子油中的佛波醇酯有较强的生物学活性，对癌细胞有促长作用，称为促癌剂，是剧毒植物毒素，可激发肿瘤和炎症。由于麻疯树种仁中含有以佛波醇酯为代表的毒素，一方面麻疯树种子油中会有佛波醇酯(脂溶性)的残留，另一方面麻疯树种仁榨油后的籽粕，只能将其用作肥料还田，使得该对家畜有潜在利用价值的植物性蛋白饲料被大量浪费。因此麻疯树种仁中麻疯树毒素的存在限制了麻疯树油的开发和麻疯树的综合利用。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术降低麻疯树毒素或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将佛波醇酯生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入麻疯树中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，以达到借助基因工程手段培育低毒的麻疯树优良品种的目的。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶在甲羟戊酸(MVA)途径中催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羧戊酸，由于该过程不可逆，故该酶被视作MVA途径中的第一个限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点。该酶催化形成的甲羟戊酸经焦磷酸化和脱羧作用形成异戊烯基焦磷酸(IPP)，从而为佛波醇酯的合成提供通用前体。
现有技术“Bioscience Biotechnology Biochemistry(生物科学、生物技术、生物化学)2008，72(8)：2049-2060”和“武汉植物学研究2007，25(2)：123-126”等先后报道从巴西橡胶树和大戟中克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，至今尚未发现有与本发明主题相同的文献报道。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种麻疯树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白(Jatropha curcas 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，JCHMGRs)及其核酸序列。
本发明的JcHMGRs蛋白编码序列包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有降低的佛波醇酯含量。
本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有麻疯树JcHMGRs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列杂交。
所述的基因编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列。
本发明分离出的麻疯树JcHMGRs蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的蛋白多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。该宿主细胞包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“麻疯树JcHMGRs蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有麻疯树JcHMGRs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第81-1832位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第81-1832位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸地简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第81-1832位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第81-1832位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的麻疯树JcHMGRs蛋白相同功能的蛋白的SEQ IDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个，通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个，通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内核苷酸。
在本发明中，术语“麻疯树JcHMGRs蛋白或多肽”指具有麻疯树JcHMGRs蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然麻疯树JcHMGRs蛋白相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括但并不限于：若干个，通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个，通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括麻疯树JcHMGRs蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的麻疯树JcHMGRs蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与麻疯树JcHMGRs蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用麻疯树JcHMGRs蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“麻疯树JcHMGRs蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu：Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg：Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr
最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还包括麻疯树JcHMGRs蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
所述的修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化的氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的麻疯树JcHMGRs蛋白多肽时，可以将麻疯树JcHMGRs蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成麻疯树JcHMGRs蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、麻疯树细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析麻疯树JcHMGRs蛋白基因产物的表达，即分析麻疯树jc-Hmgrs蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有麻疯树JcHMGRs蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码麻疯树JcHMGRs蛋白的核酸分子。
本发明涉及检测样品中是否存在麻疯树JcHMGRs蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于麻疯树JcHMGRs蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的麻疯树JcHMGRs蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选麻疯树JcHMGRs蛋白同源基因或同源蛋白。
为了得到与麻疯树JcHMGRs蛋白基因相关的麻疯树cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选麻疯树cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对麻疯树JcHMGRs蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自麻疯树的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto。这种筛选方法可以识别与麻疯树JcHMGRs蛋白的基因家族的核苷酸序列。
本发明的麻疯树JcHMGRs蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，1969 Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.1963 J.Am Chem.Soc 85；2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的麻疯树JcHMGRs蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与麻疯树JcHMGRs蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明的麻疯树JcHMGRs蛋白基因可通过基因工程技术用来降低麻疯树中佛波醇酯或其前体的含量，而佛波醇酯为一种植物毒素。因而本发明具有很大的应用前景。
【具体实施方式】
下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
麻疯树JcHMGRs蛋白基因的克隆
1.组织分离(isolation)
麻疯树种子来源于四川省攀枝花地区，麻疯树种子采集后，放在实验室保存。
2.RNA的分离(RNA isolation)
将麻疯树种子的种皮剥掉，取出种仁，用研钵研碎，加入液氮后，研磨成粉后，取100mg移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(两步裂解法)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根据一些植物HMGRs的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用SMARTTM RACE cDNA扩增方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行：
(1)核心序列的克隆
PCR(FHMGR+RHMGR)得到JcHMGR-1(452bp)，回收，连接到pMD-18T载体上，用M13F或M13R作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，知其核苷酸序列及编码蛋白与已知的木本植物如巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)等的HMGRs基因的同源性很高，故初步认为它是一个HMGRs基因。
(2)3’-RACE
根据核心序列的扩增的结果，设计两个正向特异引物(JcHMGRF1和JcHMGRF2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcHMGRF1+AP)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcHMGRF2+AP)，得到JcHMGR-3(695bp)，回收，连接，测序过程同(1))。
(3)5’-RACE
根据核心序列的扩增的结果，设计两个反向特异引物(JcHMGRR1和JcHMGRR2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcHMGRR1+UPM)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcHMGRR2+NUP)，得到JcHMGR-3(991bp)，回收，连接，测序(过程同(1))。
(4)编码序列的克隆
将核心序列、5’RACE与3’RACE测序结果序列比对并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行JcHMGRs编码区(JcHMGRfull-F+JcHMGRfull-R)PCR扩增，得到JcHMGRs编码区(1752bp)(过程同(1))。
BLAST的结果证明从麻疯树中新得到的基因确为一个植物HMGRs基因。由于已知的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶具有乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的功能(Montamat，et al.，1995)，故推测此新克隆的基因具有相同的功能。
通过组合使用上述4种方法，获得了候选的麻疯树JcHMGRs的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计寡核苷酸序列JcHMGSF1：5’-ACGCGGGCCAACTACTACTGTACGCCCTG-3’(SEQ ID N0.3)为正向引物，寡核苷酸序列JcHMGSR1：5’-TTATGATGCAACTCTCGATACATCTTTGC-3’(SEQ ID NO.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，JcHMGSF1/JcHMGSR2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1950bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。
实施例2
麻疯树JcHMGRs蛋白基因的序列信息与同源性分析
本发明新的麻疯树JcHMGRs蛋白全长cDNA的长度为1950bp，详细序列见SEQ IDNO.1，其中开放读框位于81-1832位核苷酸。根据全长cDNA推导出麻疯树JcHMGRs蛋白的氨基酸序列，共584个氨基酸残基，分子量62410.72，pI为7.63。详细序列见SEQ ID NO.2。
将麻疯树JcHMGRs蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果显示它与巴西橡胶树HbHMGRs基因(AF429388)在核苷酸水平上具有86％的同源性(表2)；在氨基酸水平上，它与巴西橡胶树HbHMGRs(GenBank Accession No.P29057)有87％的相同性和93％的相似性(表3)。由此可见，麻疯树JcHMGRs蛋白与巴西橡胶树HbHMGRs无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为麻疯树JcHMGRs蛋白在功能上也相似。
表2为本发明的麻疯树JcHMGRs与巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbHMGRs的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表3为本发明的麻疯树JcHMGRs蛋白的氨基酸序列与巴西橡胶树HbHMGRs的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
表2
86％identity in 1744 nt overlap
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Sbjct 1645 AGTTTTGGCTGGTGAGCTCTC-CTTGATGTCTGCCATTGCAGCTGGGCAGCTTGTCAAGA 1703
Query 1783 GCCACATGAAATACAATAGATCCAGCAAAGATGTATCGAGAGTTGCATCATAAGTGGAAA 1842
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Sbjct 1704 GTCACATGAAGTACAACAGATCCAGCAAAAGATATGTCTAAAGCTGCATCTTA-GTGG--- 1759
Query 1843 GAAAGTGGTCCCAGCAATG-AAAAGGGTTTAGAAATAAGAA-GTGGAGGAGACTGGTTGT 1900
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Sbjct 1760 GAATCTGGTCCCAGCAATGTAAAATGATCTA-AAATAA-AATGTGGCGGAGATTG-TT-T 1815
Query 1901 GGGA 1904
||||
Sbjct 1816 GGGA 1819
Query：麻疯树JcHMGRs的核酸序列
Sbjct：巴西橡胶树HbHMGRs的核酸序列(AF429388)
表3
87％ identity in 572 aa overlap，93％ similarity in 572aa overlap
Query 18 GGLHQRQAVA--DDRSPSPTPKASDALPLPLYLTNAIFFTLFFSVAYYLLHRWRDKIRNS 75
G LH R+ +DRSP+ TPKASDALPLPLYLTNA+FFTLFFSVAYYLLHRWRDKIRNS
Sbjct 5 GRLHHRKHATPVEDRSPT-TPKASDALPLPLYLTNAVFFTLFFSVAYYLLHRWRDKIRNS 63
Query 76 TPLHIVTLSEIAAIVSLIASFIYLLGFFGIDFVQSFIARASHDAWDLDDTDPAYLINEDH 135
TPLHIVTLSEI AIVSLIASFIYLLGFFGIDFVQSFIARASHD WDL+DTDP YLI+EDH
Sbjct 64 TPLHIVTLSEIVAIVSLIASFIYLLGFFGIDFVQSFIARASHDVWDLEDTDPNYLIDEDH 123
Query 136 RLVTCPPATIATITT---GPPKLPPPDLIVAPLASEDDENIVKSVVNGTIPSYSLESKLG 192
RLVTCPPA I+T TT P KLP + ++APL SE+DE IV SVV+G IPSYSLESKLG
Sbjct 124 RLVTCPPANISTKTTIIAAPTKLPTSEPLIAPLVSEEDEMIVNSVVDGKIPSYSLESKLG 183
Query 193 DCKRAATIRREALQRTTGRSLDGLPVDGFDYESILGQCREMPVGYVQIPVGIAGPLLLDG 252
DCKRAA IRREALQR T RSL+GLPV+GFDYESILGQC EMPVGYVQIPVGIAGPLLL+G
Sbjct 184 DCKRAAAIRREALQRMTRRSLEGLPVEGFDYESILGQCCEMPVGYVQIPVGIAGPLLLNG 243
Query 253 REYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIYLSGGATSVLLKDCMTRAPVVRFESVTRAADLKFF 312
REYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIYLSGGATSVLLKD MTRAPVVRF S TRAA+LKFF
Sbjct 244 REYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIYLSGGATSVLLKDGMTRAPVVRFASATRAAELKFF 303
Query 313 LENPENFDTLAVVFNRSSRFARLQGVKCAIAGKNVYVRFSCSTGDAMGMNMVSKGVQNVL 372
LE+P+NFDTLAVVFN+SSRFARLQG+KC+IAGKN+Y+RFSCSTGDAMGMNMVSKGVQNVL
Sbjct 304 LEDPDNFDTLAVVFNKSSRFARLQGIKCSIAGKNLYIRFSCSTGDAMGMNMVSKGVQNVL 363
Query 373 EFLKNDFPDMRLAGISGNYCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIIKEEVVKNVLKTNVASL 432
EFL++DF DM + GISGN+CSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIIKEEVVK VLKTNVASL
Sbjct 364 EFLQSDFSDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIIKEEVVKKVLKTNVASL 423
Query 433 VELNMLKNLAGSAIAGALGGFNAHAGNIVSAIFIATGQDPAQNIESSHCITMMEAVNDGK 492
VELNMLKNLAGSA+AGALGGFNAHAGNIVSAIFIATGQDPAQN+ESSHCITMMEAVNDGK
Sbjct 424 VELNMLKNLAGSAVAGALGGFNAHAGNIVSAIFIATGQDPAQNVESSHCITMMEAVNDGK 483
Query 493 DLHVSVSMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGASKESPGSNSRLLATIVAGSVLAG 552
DLH+SV+MPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGA+KESPGSNSRLLA IVAGSVLAG
Sbjct 484 DLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGANKESPGSNSRLLAAIVAGSVLAG 543
Query 553 ELSLMSAIAAGQLVNSHMKYNRSSKDVSRVAS 584
ELSLMSAIAAGQLV SHMKYNRSSKD+S+ AS
Sbjct 544 ELSLMSAIAAGQLVKSHMKYNRSSKDMSKAAS 575
Query：麻疯树JcHMGRs氨基酸序列
Sbjct：巴西橡胶树HbHMGRs氨基酸序列(GenBank Accession No.P29057)
实施例3
麻疯树JcHMGRs蛋白在大肠杆菌中进行原核表达及提纯
在该实施例中，将全长的麻疯树JcHMGRs蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
将麻疯树JcHMGRs蛋白多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。
原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌：根据麻疯树JcHMGRs蛋白的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pQE30载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将麻疯树JcHMGRs蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pQE30载体(QIAGEN)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌M15，筛选鉴定得到含有pQE30-JCHMGR表达载体的工程菌M15-pQE30-JCHMGR。
表达JcHMGRs重组蛋白(rJcHMGRs)的工程菌的分离鉴定：挑取单菌落的M15-pQE30-JCHMGR工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，4小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达JcHMGRs融合蛋白的工程菌。
rJcHMGRs融合蛋白的提取纯化：按上述方法诱导表达rJcHMGRs融合表达蛋白的工程菌M15-pQE30-JcHMGRs，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(QIAGEN)的说明书用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mMNaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集M15-pQE30-JCHMGR融合蛋白。
纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活力测定：按Suwanmanee等(Plantscience，2004，166：531-537)的方法对表达纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白进行酶活力的测定，研究其对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成的影响。反应体系含有0.1M Tris-HCL(pH＝8.0)，0.2mM乙酰辅酶A，0.05mM乙酰乙酰辅酶A，0.1mMEDTA及10ul酶蛋白样品，总体积为100ul。反应流程如下：首先将14C标记的乙酰辅酶A加入到没有标记的酰基(67 dps nmol-1)中稀释成混合物，30℃预培养2分钟。在加入乙酰辅酶A后的2和4分钟，取等量的40μl的混合物转移到玻璃小瓶中并加入100μl的6M HCL，然后在95℃干燥。在烘干的过程中，硫酯被羟化，未参与反应的14C标记的乙酰基被蒸发了，只有14C标记的HMG酸仍然保留在瓶子中，加入500μl的水，用液体闪烁记数器测定14C标记的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的含量。为了计算在上述程序没有去除干净的14C标记的乙酰辅酶A的残余量，实验中设计了一个平行对照。结果表明，表达的蛋白的确具有催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶活性。
实施例4
麻疯树JcHMGRs蛋白在麻疯树中进行RNA干扰
含目的基因(麻疯树JcHMGRs蛋白基因)的RNA干扰载体的构建。根据麻疯树JcHMGRs蛋白的全长序列(SEQ ID NO.1)(属于正义片段)，设计一对引物，PCR扩增后得到互补的反义片段，将正义片断和反义片断分别引入限制性内切酶位点(可视选用的载体而定)并连上载体pHANNIBAL形成茎环结构，然后通过双酶切将茎环结构的片断连入pCAMBIA1301载体，构建成RNA干扰载体，再将其转入农杆菌中，利用农杆菌转化技术或基因枪技术转化麻疯树。
利用农杆菌转化技术转化麻疯树
1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；
2.室温下4，000g离心10min；
3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；
4.取生长一个月左右的麻疯树的无菌外植体，将其剪成约1平方厘米见方的小片或小段；
5.将步骤(4)的小片或小段放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；
6.把经浸染的小片或小段放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；
7.将小片或小段转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；
8.约40天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，10天左右生根；
9.待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
利用Northern blotting检测JcHMGRs蛋白在转基因麻疯树植株中的表达
1.RNA的提取：待转基因麻疯树叶片长到2-3片叶时抽取麻疯树叶的RNA。以正常生长的植株作为对照(条件同上)，利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算：1 OD260＝40μg/ml。
3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：①取6ml 25(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。②称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。③于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。④迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。⑤将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。⑥在样品中加入2ul 10×上样缓冲液，混匀。⑦在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。
4.RNA尼龙膜上转移：①转移之前，将尼龙膜用10×SSC浸泡。②将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。③滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。④转移后，将膜于80℃烘烤2小时。
5.膜上杂交信号的检出：①将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA，65℃下预杂交2小时。②将用Gene ImagesTM Contents CDP-StarTM labellingmodule标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入(1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。③取出膜，置于洗膜液I(1×SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1×SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。④用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；转基因麻疯树的jc-HMGS转录水平比未转基因的对照材料的表达水平显著低。
本发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1950bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：584
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii).分子类型：多肽
(iii).序列描述：SEQ ID NO.2
(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii).分子类型：寡核苷酸
(iii).序列描述：SEQ ID NO.3
ACGCGGGCCAACTACTACTGTACGCCCTG
(4)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.4
TTATGATGCAACTCTCGATACATCTTTGC
【序列表】
<110>复旦大学
<120>麻疯树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白编码序列
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1950
<212>DNA
<213>麻疯树(Jatrophga curcas)
<220>
<221>CDS
<222>(81)..(1832)
<223>
<400>1
acgcgggcca actactactg tacgccctgt ggaataaaac tactctctcc ctgtttctat 60
ttttcgccgg aatattttaa atg gac ccc aac cgc cgg cca act aaa cca ccg 113
Met Asp Pro Asn Arg Arg Pro Thr Lys Pro Pro
1 5 10
cgt tcc ccc tcc gcg caa ggt ggc ctc cac caa agg caa gct gta gcc gac 164
Arg Ser Pro Ser Ala Gln Gly Gly Leu His Gln Arg Gln Ala Val Ala Asp
15 20 25
gac cgc tct cca tct ccc act ccg aaa gcg tcg gac gcc ctt ccg ctg cca 215
Asp Arg Ser Pro Ser Pro Thr Pro Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro
30 35 40 45
ctg tat ctt act aat gca att ttc ttc acg ctg ttc ttc tcg gtg gca tat 266
Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Ile Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr
50 55 60
tac ctt ctc cac cgg tgg cgt gac aag atc cgc aac tct act ccc ctc cac 317
Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu His
65 70 75
atc gtt acc ctc tct gag att gcc gcc att gtc tcc ctc att gct tcc ttc 368
Ile Val Thr Leu Ser Glu Ile Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile Ala Ser Phe
80 85 90 95
att tat ctc ctc gga ttc ttt gga atc gat ttt gtt caa tca ttt att gca 419
Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser Phe Ile Ala
100 105 110
cgc gcc tcc cat gat gcg tgg gac ctc gac gat acg gat ccc gcc tac ctt 470
Arg Aal Ser His Asp Ala Trp Asp Leu Asp Asp Thr Asp Pro Ala Tyr Leu
115 120 125 130
atc aac gaa gat cac cgt ctc gtt acg tgc cct ccc gca act atc gct acc 52l
Ile Asn Glu Asp His Arg Leu Val Thr Cys Pro Pro Ala Thr Ile Ala Thr
135 140 145
att acc acc gga cct ccc aaa ttg ccg cct ccg gat ctc ata gtc gca cct 572
Ile Thr Thr Gly Pro Pro Lys Leu Pro Pro Pro Asp Leu Ile Val Ala Pro
150 155 160
tta gcc tcg gag gat gac gaa aac atc gtc aaa tcc gtc gtg aat gga acg 623
Leu Ala Ser Glu Asp Asp Glu Asn Ile Val Lys Ser Val Val Asn Gly Thr
165 170 175 180
att cct tcc tat tct ctg gaa tca aag ctc ggg gat tgc aaa cga gcg gca 674
Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala
185 190 195
aca att cga cgc gag gct ttg caa agg acg aca gga agg tcg ctg gat ggt 725
Thr Ile Arg Arg Glu Ala Leu Gln Arg Thr Thr Gly Arg Ser Leu Asp Gly
200 205 210 215
tta cca gtg gat ggg ttc gat tac gag tcg att cta ggg cag tgc cgt gaa 776
Leu Pro Val Asp Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Arg Glu
220 225 230
atg cca gtc gga tac gtg cag att cca gta gga att gcg gga ccg cta ttg 827
Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu
235 240 245
cta gac gga cgc gag tac tct gtt ccg atg gcc acc act gag ggt tgt ttg 878
Leu Asp Gly Arg Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu
250 255 260 265
gtg gcg agc acc aat aga ggg tgt aag gcg atc tac ctg tca ggt ggg gct 929
Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Leu Ser Gly Gly Ala
270 275 280
acc agc gtg ttg ttg aaa gat tgc atg aca aga gcg cct gtt gtt cgt ttt 980
Thr Ser Val Leu Leu Lys Asp Cys Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe
285 290 295 300
gaa tca gtg aca aga gct gca gat ttg aag ttc ttt ttg gag aat cct gaa 103l
Glu Ser Val Thr Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu
305 310 315
aat ttt gac acc ttg gcc gtt gtc ttt aac agg tca agt aga ttt gcg agg 1082
Asn Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg
320 325 330
ctc caa ggc gtt aaa tgt gct att gcc ggc aag aat gtt tat gta aga ttt 1133
Leu Gln Gly Val Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Val Tyr Val Arg Phe
335 340 345 350
agt tgc agc act ggt gat gca atg ggg atg aac atg gtt tcc aaa ggg gtg 1184
Ser Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val
355 360 365
caa aac gtt ctt gaa ttc ctt aag aat gat ttc cct gac atg cgt ctt gct 1235
Gln Asn Val Leu Glu Phe Leu Lys Asn Asp Phe Pro Asp Met Arg Leu Ala
370 375 380 385
ggc atc tca gga aat tat tgt tcg gac aag aaa cct gct gct gta aac tgg 1286
Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp
390 395 400
atc gaa ggg cgg ggc aaa tca gtt gtt tgt gag gca att atc aag gaa gag 1337
Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile Ile Lys Glu Glu
405 410 415
gtg gtg aaa aat gta tta aaa acc aat gtt gct tcc cta gtg gag ctc aac 1388
Val Val Lys Asn Val Leu Lys Thr Asn Val Ala Ser Leu Val Glu Leu Asn
420 425 430 435
atg cta aaa aat ctt gct ggt tct gct att gct ggt gct ctg ggt ggg ttt 1439
Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Ile Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe
440 445 450
aat gct cat gca gga aac att gtc tct gca atc ttt att gca act ggc cag 1490
Asn Ala His Ala Gly Asn Ile Val Ser Ala Ile Phe Ile Ala Thr Gly Gln
455 460 465 470
gat cca gca cag aat att gag agt tct cac tgc att acg atg atg gaa gct 1541
Asp Pro Ala Gln Asn Ile Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala
475 480 485
gtt aat gat gga aag gat ctc cat gtc tca gtg tca atg cct tcc att gag 1592
Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Val Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu
490 495 500
gtg ggt aca gtt gga gga gga act caa ctt gca tct cag tct gct tgt cta 1643
Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu
505 510 515 520
aat ttg ctt ggg gtg aag ggg gca agc aaa gag tca cca gga tca aac tca 1694
Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala Ser Lys Glu Ser Pro Gly Ser Asn Ser
525 530 535
agg ctc ctt gcc acc ata gta gct ggt tca gtt ttg gcc ggt gag ctg tct 1745
Arg Leu Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser
540 545 550 555
ctg atg tct gcc att gca gct ggg cag ctt gtc aac agc cac atg aaa tac 1796
Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr
560 565 570
aat aga tcc agc aaa gat gta tcg aga gtt gca tca taa gtggaaagaa agtgg 1850
Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Ser Arg Val Ala Ser
575 580
tccca gcaatgaaaa gggtttagaa ataagaagtg gaggagactg gttgtgggaa ggtaa 1910
aaaag acaaatgggg atcagagaga aaaaaaaaaa aaaaa 1950
<210>2
<211>584
<212>PRT
<213>麻疯树(jatropha curcas)
<400>2
Met Asp Pro Asn Arg Arg Pro Thr Lys Pro Pro Arg Ser Pro Ser Ala
5 10 15
Gln Gly Gly Leu His Gln Arg Gln Ala Val Ala Asp Asp Arg Ser Pro
20 25 30
Ser Pro Thr Pro Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu
35 40 45
Thr Asn Ala Ile Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu
50 55 60
Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu His Ile
65 70 75 80
Val Thr Leu Ser Glu Ile Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile Ala Ser Phe
85 90 95
Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser Phe Ile
100 105 110
Ala Arg Ala Ser His Asp Ala Trp Asp Leu Asp Asp Thr Asp Pro Ala
115 120 125
Tyr Leu Ile Asn Glu Asp His Arg Leu Val Thr Cys Pro Pro Ala Thr
130 135 140
Ile Ala Thr Ile Thr Thr Gly Pro Pro Lys Leu Pro Pro Pro Asp Leu
145 150 155 160
Ile Val Ala Pro Leu Ala Ser Glu Asp Asp Glu Asn Ile Val Lys Ser
165 170 175
Val Val Asn Gly Thr Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly
180 185 190
Asp Cys Lys Arg Ala Ala Thr Ile Arg Arg Glu Ala Leu Gln Arg Thr
195 200 205
Thr Gly Arg Ser Leu Asp Gly Leu Pro Val Asp Gly Phe Asp Tyr Glu
210 215 220
Ser Ile Leu Gly Gln Cys Arg Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile
225 230 235 240
Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Arg Glu Tyr Ser
245 250 255
Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg
260 265 270
Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Leu Ser Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu
275 280 285
Lys Asp Cys Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Glu Ser Val Thr
290 295 300
Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu Asn Phe Asp
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln
325 330 335
Gly Val Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Val Tyr Val Arg Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val
355 360 365
Gln Asn Val Leu Glu Phe Leu Lys Asn Asp Phe Pro Asp Met Arg Leu
370 375 380
Ala Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val
385 390 395 400
Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile Ile
405 410 415
Lys Glu Glu Val Val Lys Asn Val Leu Lys Thr Asn Val Ala Ser Leu
420 425 430
Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Ile Ala Gly
435 440 445
Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Gly Asn Ile Val Ser Ala Ile
450 455 460
Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Ile Glu Ser Ser His
465 470 475 480
Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Val
485 490 495
Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr
500 505 510
Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly
515 520 525
Ala Ser Lys Glu Ser Pro Gly Ser Asn Ser Arg Leu Leu Ala Thr Ile
530 535 540
Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile
545 550 555 560
Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser
565 570 575
Lys Asp Val Ser Arg Val Ala Ser
580