食源性致病菌核酸高效提取方法 技术领域：
本发明涉及一种食源性致病菌核酸高效提取方法。
背景技术：
PCR技术目前已被广泛用于病原微生物的检测。PCR检测技术的第一步就是模板核酸的制备，即样本中核酸的提取，这直接影响着PCR反应的结果。长期以来，样本中核酸的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。因此，许多学者一直在探索各种核酸的提取方法。
样品中核酸的提取分为两个步骤：裂解细胞和提取核酸。从样品中提取核酸首先要通过物理、化学或酶解作用裂解细胞，使核酸释放出来。常用方法包括物理法(煮沸、冻融、微波、超声、研磨等)、化学方法(高盐、表面活性剂SDS、热酚等)和酶解法(裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等)。
常用几种核酸提取方法有：酚-氯仿抽提法、螯合树脂/纯化柱法、玻璃粉吸附法、磁珠吸附法、免疫亲和法、各种试剂盒法。
几种核酸提取方法进行比较，见表1：
表1几种核酸提取方法比较
发明内容：
本发明的目的是提供一种高质量、高产量、高通量的细菌核酸高效提取方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
食源性致病菌核酸高效提取方法，其组成包括：将细菌培养液离心，向离心沉淀中加入缓冲液A，震荡并加入溶菌酶，温育后加入蛋白酶K，加入缓冲液B，剧烈振荡后，在温度65℃温育10分钟，制成裂解溶液，通过硅基质SiO2材料的吸附膜收集高质量的核酸提取核酸溶液。
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的细菌培养液离心为将1-5mL细菌培养液以8,000rpm的转速离心5分钟，吸净上清。
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的向离心沉淀中加入缓冲液A，震荡并加入溶菌酶，温育后加入蛋白酶K，加入缓冲液B，剧烈振荡后，在温度65℃温育10分钟，制成裂解溶液的过程为：向细菌沉淀中加入250μL缓冲液A：20mol/L三羟甲基氨基甲烷TrisHCI、2mol/L乙二胺四乙酸EDTA、1.2％聚乙二醇辛基苯基醚Triton，振荡至菌体彻底悬浮，加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶，在温度为37℃温育30分钟，向管中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200μL缓冲液B：0.05moL/L三羟甲基氨基甲烷TrisHCI、pH为7.6的0.1mol/L氯化钠NaCI、0.05mol/L乙二胺四乙酸EDTA、2％十二烷基硫酸钠SDS，剧烈振荡后，在温度65℃温育10分钟。
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的通过硅基质SiO2材料的吸附膜收集高质量的核酸提取核酸溶液过程包括：在裂解液中加入220μL无水乙醇，充分振荡后，转入一个具有吸附膜的吸附管内(吸附管放入收集管中)，以12000rpm转速离心1分钟，弃滤液，再向吸附管中加入500μL缓冲液C：0.3M醋酸钠NaAc、300μL无水乙醇，以12000rpm的转速离心1分钟，弃滤液，再向吸附管中加入500μL漂洗液D：70％的乙醇溶液，以12000rpm的转速离心1分钟，弃滤液，如此重复1次，最后以12000rpm转速离心2分钟，弃滤液；
将吸附管转入一个干净的收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL的TE缓冲液：10mM三羟甲基氨基甲烷Tris、1mM乙二胺四乙酸EDTA室温放置2分钟，以12000rpm转速离心2分钟，滤液即为核酸溶液，再温度-20℃时保存备用。
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的65℃温育10min后，溶液将由乳浊液变成液，如果未变成透明，说明细菌没有彻底裂解。
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，洗脱缓冲液体积不应少于50μL，用水做洗脱液时pH值在7.0-8.5范围内，核酸产物应保存在温度-20℃。
这个技术方案有以下有益效果：
1.本发明不但能消除食品和培养基成分的干扰，得到高纯度、高浓度的核酸，而且能同时提取8种菌，包括G+菌和G-菌，并满足PCR-DHPLC检测条件的要求。
2.本发明按照核酸提取的2个步骤：裂解和提取，本着简便、有效、适合、环保和经济原则，进行菌体细胞的裂解方法的选择，菌体核酸提取方法的选择，最后组合与筛选了4种提取方法。通过实验，分析了4种提取方法所得核酸的质量，进行了PCR扩增效果验证和DHPLC检测效果验证，优选出高效、适合、环保和经济的提取方法：酶解吸附膜法。
3.本发明方法提取核酸的纯度高、产量大，可同时提取8种致病菌，不仅包括G+菌，还包括G-菌，能满足PCR-DHPLC检测的色谱级要求。其它的提取方法不能同时具备本方法的特点，尤其不能同时提取G+菌和G-菌，或提取后质量也不高，影响核酸的使用。
本发明的具体实施方式：
实施例1：
食源性致病菌核酸高效提取方法，其组成包括：将细菌培养液离心，向离心沉淀中加入缓冲液A，震荡并加入溶菌酶，温育后加入蛋白酶K，加入缓冲液B，剧烈振荡后，在温度65℃温育10分钟，制成裂解溶液，通过硅基质SiO2材料的吸附膜收集高质量的核酸提取核酸溶液。
实施例2：
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的细菌培养液离心为将1-5mL细菌培养液以8,000rpm的转速离心5分钟，吸净上清。
实施例3：
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的向离心沉淀中加入缓冲液A，震荡并加入溶菌酶，温育后加入蛋白酶K，加入缓冲液B，剧烈振荡后，在温度65℃温育10分钟，制成裂解溶液地过程为：向细菌沉淀中加入250μL缓冲液A：20mol/L三羟甲基氨基甲烷TrisHCI、2mol/L乙二胺四乙酸EDTA、1.2％聚乙二醇辛基苯基醚Triton，振荡至菌体彻底悬浮，加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶，在温度为37℃温育30分钟，向管中加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200μL缓冲液B：0.05moL/L三羟甲基氨基甲烷TrisHCI、pH为7.6的0.1mol/L氯化钠NaCI、0.05mol/L乙二胺四乙酸EDTA、2％十二烷基硫酸钠SDS，剧烈振荡后，在温度65℃温育10分钟。
实施例4：
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的通过硅基质SiO2材料的吸附膜收集高质量的核酸提取核酸溶液过程包括：在裂解液中加入220μL无水乙醇，充分振荡后，转入一个具有吸附膜的吸附管内(吸附管放入收集管中)，以12000rpm转速离心1分钟，弃滤液，再向吸附管中加入500μL缓冲液C：0.3M醋酸钠NaAc、300μL无水乙醇，以12000rpm的转速离心1分钟，弃滤液，再向吸附管中加入500μL漂洗液D：70％的乙醇溶液，以12000rpm的转速离心1分钟，弃滤液，如此重复1次，最后以12000rpm转速离心2分钟，弃滤液；
将吸附管转入一个干净的收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL的TE缓冲液：10mM三羟甲基氨基甲烷Tris、1mM乙二胺四乙酸EDTA室温放置2分钟，以12000rpm转速离心2分钟，滤液即为核酸溶液，再温度-20℃时保存备用。
实施例5：
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的65℃温育10min后，溶液将由乳浊液变成液，如果未变成透明，说明细菌没有彻底裂解。
实施例6：
所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，洗脱缓冲液体积不应少于50μL，用水做洗脱液时pH值在7.0-8.5范围内，核酸产物应保存在温度-20℃。