一株纤维素分解复合菌系及其产物用于培养硫酸盐还原菌的方法.pdf

本发明提供一株纤维素分解复合菌系及其产物用于培养硫酸盐还原菌的方法，一株纤维素分解复合菌系的名称为Clostridium?sp.Lwy-1，保藏登记号为CCTCC?NO：M208160，保藏日：2008年10月17日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，该菌种对滤纸具有很强的分解能力，对稻草亦表现了较强的分解能力。可利用其分解稻草产生的小分子产物作为碳源培养硫酸盐还原菌(SRB)。本发明的优点是：可充分利用我国最丰富的生物物质资源，使硫酸盐还原菌(SRB)处理酸性矿山废水的方法得到更大的发展。

1.  一株纤维素分解复合菌系，其特征在于：名称为Clostridium sp.Lwy-1，保藏登记号为CCTCC NO：M208160，保藏日：2008年10月17日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内。

2.  一种纤维素分解复合菌系降解稻草的方法，其特征在于：它包括：在分离培养基中，用3％(w/v)预处理后的稻草代替滤纸条配置培养基，接入10％(v/v)培养好的菌种，40-50℃条件下静置培养。

3.  根据权利要求2所述的一种纤维素分解复合菌系降解稻草的方法，其特征在于：所述的稻草预处理方法是将稻草切成1cm的小段，加入1％NaOH溶液浸泡24小时后用0.5％的HCl清洗3次。

4.  一株纤维素分解复合菌系产物用于培养硫酸盐还原菌的方法，其特征在于：本发明使用的SRB培养基为：CaCl₂·H₂O，0.5-2.5g；NaHCO₃，0.2-1.5g；K₂HPO₄，0.1-3g；MgSO₄·7H₂O，0.1-3g；NaCl，0.1-5g；NH₄Cl，0.1-3g；KH₂PO₄；微量元素，10-15ml；维生素，10-15ml；(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H2O，0.1-2g；分解产物，10-20ml；蒸馏水，1L；pH为6.8-8.0，30-40℃培养箱中静置培养SRB，接种量为5-20％(V/V)接种量接种。

一株纤维素分解复合菌系及其产物用于培养硫酸盐还原菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域。特别是涉及具有分解纤维素能力的厌氧细菌复合菌系及其培养方法以及该菌系对稻草分解的产物作为碳源培养SRB(Sulfate-reducing Bcteria)的方法。
背景技术
利用硫酸盐还原菌(SRB)处理酸性矿山废水的方法具有成本低、适用性强、无二次污染、可以回收酸性矿山废水中的重金属等特点。SRB的生长需要外加碳源才能完成，目前国内外开展了一些选择廉价的、甚至于作为废弃物的有机质，如生活废水、玉米芯等作为支持SRB生长的碳源的研究。
木质纤维素是我国最丰富的生物质资源，包括大量的农作物秸秆，工业与林业废弃物以及城市固体废弃物等。尤其是农作物秸秆，是我国最丰富的资源之一，它具有产量大，分布广，品种多的特点，应用潜力巨大。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三种成分组成，它们相互结合形成复杂的超分子复合物。由于其结构复杂难于分解，目前这类资源大部分未能被充分利用。
本发明通过富集分离能够分解纤维素的厌氧细菌复合菌系，并利用其分解稻草产生的小分子产物作为碳源培养硫酸盐还原菌(SRB)。
发明内容
本发明的目的是提供一株纤维素分解复合菌系及其产物用于培养硫酸盐还原菌的方法，该菌种对滤纸具有很强的分解能力，对稻草亦表现了较强的分解能力，并利用其分解稻草产生的小分子产物作为碳源培养硫酸盐还原菌(SRB)。
为达到上述发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一株纤维素分解复合菌系(菌种名称为Clostridium sp.Lwy-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日：2008年10月17日，保藏登记号：CCTCCNO：M208160)，
本发明提供一种可以富集、分离、培养纤维素分解菌的培养基。
本发明所用的富集分离纤维素分解菌的样品为活性污泥。
本发明使用的菌种富集分离培养基为：
蛋白胨              1-5.00     g
CaCl₂×2H₂O        0.5-2.5     g
酵母粉               0.5-2     g
滤纸条             12×120    mm
蒸馏水             1000.00    ml
pH                 6.8-8.0
培养基制作：称取相应药品倒入事先装有部分蒸馏水的烧杯中，药品充分溶解后用蒸馏水定容至990ml，调pH到7.2，最后定容到1000ml。将20ml培养基分装到18×150mm的螺口厌氧管(预先放置12×120mm的滤纸条)中，并用真空抽换气装置除氧，121℃高压蒸汽灭菌。
纤维素分解菌的富集培养：将0.2-0.6g活性污泥接种到装有培养基的试管中。接种后在40-50℃条件下静置培养。滤纸分解后，用相同的培养基转接驯化，接种量为5％。转接4-5次后-4℃保存。
菌种形态观察：滤纸分解后用相差显微镜观察菌体形态。
分解稻草：在分离培养基中，用3％(w/v)预处理后的稻草代替滤纸条配置培养基。接入10％(v/v)培养好的菌种，40-50℃条件下静置培养。观察分解情况。
稻草的预处理：稻草切成1cm长的小段，加入1％的NaOH溶液浸泡24小时。使用前用0.5％的HCl清洗3次。
复合菌系微生物种群组成分析：本发明采用16S rDNA克隆文库技术对纤维素分解复合菌系中微生物种群组成进行分析。
纤维素分解复合菌系分解稻草的产物作为碳源培养SRB：本发明使用的SRB培养基为：CaCl₂·H₂O，0.5-2.5g；NaHCO₃，0.2-1.5g；K₂HPO₄，0.1-3g；MgSO₄·7H₂O，0.1-3g；NaCl，0.1-5g；NH₄Cl，0.1-3g；KH₂PO₄；微量元素，10-15ml；维生素，10-15ml；(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H2O，0.1-2g；分解产物，10-20ml；蒸馏水，1L；pH为6.8-8.0。
培养温度为30-40℃，检测SRB生长情况以及黑色沉淀FeS的形成情况。
本发明的优点是：可充分利用我国最丰富的生物物质资源，使硫酸盐还原菌(SRB)处理酸性矿山废水的方法得到更大的发展。
附图说明
图1为本发明菌种的相差显微镜照片
图2为复合菌系对滤纸和稻草的分解情况
图3SRB的生长情况(大量FeS黑色沉淀形成)
图2中，1为对照组，2为滤纸，3为稻草。图3中，4为对照组，5为SRB，6为SRB。
具体实施方式
实施例：
首先配制富集培养纤维素分解菌的培养基。将培养基分装到装有滤纸条(12×120mm)的厌氧螺口试管中。经过真空抽气除氧后，高压蒸汽灭菌(121℃)。将0.5g厌氧活性污泥接入到灭好菌的培养基中，放入45℃培养箱中静置培养。滤纸分解后用相同培养条件逐次转接培养。在转接过程中，菌系对滤纸的分解能力不断加强，最终在48小时之内即可将滤纸条完全泥化。将富集分离到的纤维素分解菌系保藏(该菌名称为Clostridium sp.Lwy-1，保藏单位：中国国家典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日：2008年10月17日，保藏登记号：CCTCC NO：M208160)。
用相差显微镜观察菌体形态。
用16S rDNA克隆文库技术分析纤维素分解菌系中微生物种群组成。将1ml菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16S rDNA片段。PCR产物纯化后与Promega的T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取的白色菌落通过菌落PCR确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经Blast比较表明，该菌系由Clostridium cellulolyticum，Clostridium sp.和uncultured bacterium3种不同的细菌组成，所占比例分别为77.77％，0.06％和16.66％。该菌种是厌氧细菌复合菌系。
将稻草切成1cm的小段，加入1％NaOH溶液浸泡24小时后用0.5％的HCl清洗3次。将3％(w/v)装入厌氧管中替代滤纸条。用3g蛋白胨，1.5g CaCl₂×2H₂O，1g酵母粉，1L蒸馏水，pH为7.2配制成培养基并分装、除氧、灭菌。以5％(v/v)的量接种，45℃培养箱中静置培养。2-3周后大部分稻草被分解。
配制培养SRB的培养基(CaCl2·H2O，2g；NaHCO3，1g；K2HPO4，1.2g；MgSO4·7H2O，0.9g；NaCl，2g；NH4Cl，0.8g；KH2PO4，1g；微量元素，10-15ml；维生素，10-15ml；(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，0.5g；稻草分解产物，10-20ml；蒸馏水，1L；pH为7.2)，该培养基是利用纤维素分解菌系对稻草的降解产物作为SRB生长的碳源。按10％(V/V)接种量接种SRB菌，30-40℃条件下静置培养3天，有大量FeS黑色沉淀产生(SRB生长产生大量H₂S，H₂S与Fe²⁺反应形成FeS黑色沉淀)。