从牛初乳中工业化分离纯化免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和乳铁蛋白的方法 【技术领域】
本发明涉及从牛初乳中工业化分离纯化免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和乳铁蛋白的方法。
背景技术
牛初乳天然含有大量的具有不同生理活性的功能性组分，是自然界免疫因子最为富集的食品资源之一。其中免疫球蛋白在牛初乳中的含量最高，与人体的免疫球蛋白最相近，具有同源性，对人的保健作用也最大，免疫球蛋白主要分为以下几类：免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(SigA)、免疫球蛋白M(IgM)、乳铁蛋白(LF)等。免疫球蛋白的主要功能包括调节机体胃肠功能、提高机体免疫力和促进机体恢复等作用。几种免疫球蛋白中SigA的作用尤为重要，因为在人的母乳中主要的免疫球蛋白就是SigA，为了对婴幼儿配方奶粉进行真正的母乳化模拟，开发更适合婴儿的母乳代用品，我们必须要获得这种具有特殊意义的配料。
目前国内、外牛初乳产品制造还只停留在粗加工阶段，生产的产品主要是直接将牛初乳干燥后的产品，虽然此类产品也具有广泛的免疫功能作用，但是没有对牛初乳中富含的多种免疫物质进行精加工，一方面由于产品中个别组分的纯度问题限制了使用厂商的产品配方，另一方面没有完全发挥个别组分的应具有的免疫功能。因此将牛初乳中具有免疫作用的成分进行分离提纯，是势在必行的。
目前我国奶牛存栏数超过1000万头，每年除喂养乳牛外剩余50多万吨牛初乳。由于牛初乳在常规的牛奶加工中属于生理异常乳，并且牛初乳专业加工设备的限制，这些宝贵的牛初乳资源都没有得到很好的利用，其中大量的天然免疫活性成分都白白浪费。如果将这些天然的生物活性物质进行很好的加工利用，可以广泛的应用于功能性食品、保健食品、医药、化妆品和饲料行业，必将带来极大的商业价值，并且可以极大的促进相关产业的健康发展。
随着市场对高科技免疫产品需求的增加，目前牛初乳行业发展的趋势就是对其中丰富的免疫因子和生长因子进行分离提纯，但是分离技术和设备制约了工业化生产的进行，虽然近年来有很多关于牛初乳活性组分分离的报道，但是大多是局限于试验室中常用的一些经典方法，如盐析和凝胶层析，这些方法虽然在试验室可行，但是无法进行工业放大，没有实际的应用价值。随着科技的不断发展，工业化膜技术和工业层析技术的出现，使得工业分离蛋白成为可能，但是，各成分按照怎样的顺序分离、使用什么样的膜技术和什么样的层析技术等各个环节之间都存在着相互制约和影响，目前还没有能够高效连续地从牛初乳中工业化分离纯化免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和乳铁蛋白的方法。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种能够高效连续地从牛初乳中工业化分离纯化免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和乳铁蛋白的方法。
本发明提供的从牛初乳中工业化分离纯化免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和乳铁蛋白的方法包括以下步骤：
(1)将牛初乳进行脱脂，然后分离酪蛋白制备乳清；
(2)将所述乳清进行微滤除菌后，进行阳离子交换层析，得到第一流穿液，洗脱阳离子交换层析柱得到阳离子交换层析洗脱液，然后利用第一陶瓷膜对所述阳离子交换层析洗脱液进行超滤浓缩脱盐，再经过冷冻干燥得到乳铁蛋白；
(3)将所述第一流穿液进行阴离子交换层析，得到第二流穿液，洗脱阴离子交换层析柱得到阴离子交换层析洗脱液，然后利用第二陶瓷膜对所述阴离子交换层析洗脱液进行超滤浓缩脱盐，再经过冷冻干燥得到免疫球蛋白A；
(4)将所述第二流穿液利用第三陶瓷膜进行超滤浓缩脱盐，再利用低温喷雾干燥得到免疫球蛋白G。
较佳地，所述第一陶瓷膜的MWCO(molecular weight cutoff，即截留分子量)为1-10KD，所述第二陶瓷膜的MWCO为50-150KD，所述第三陶瓷膜的MWCO为10-100KD。
较佳地，步骤(2)、(3)和(4)中的超滤浓缩脱盐的操作条件为：压力0.3-0.5Mpa，温度20-30℃，切向流速4-6m/s。
较佳地，步骤(2)中所述微滤除菌为利用孔径为0.45um陶瓷膜进行微滤除菌，操作压力0.1-0.2Mpa，操作温度20-35℃，切向流速4-6m/s。
较佳地，步骤(2)中所述洗脱阳离子交换层析柱采用0.5-1mol/LNaCl溶液洗脱，步骤(3)中所述洗脱阴离子交换层析柱采用0.2-0.5mol/L NaCl溶液洗脱。
较佳地，步骤(1)中所述分离酪蛋白制备乳清包括分离酪蛋白前将所述脱脂乳地pH调节为4-5，分离酪蛋白后将得到的乳清的pH调节为5-7；步骤(2)中所述进行阳离子交换层析包括将微滤除菌后乳清的pH调节到7.5-8.0后上样；步骤(3)中所述进行阴离子交换层析包括将第一流穿液的pH调节到4.5-5.0后上样。更佳地，步骤(2)中所述进行阳离子交换层析包括在上样前用pH7.5-8.0、0.01-0.02mol/L的PB为平衡溶液对阳离子交换层析柱进行平衡，步骤(3)中所述进行阴离子交换层析包括在上样前用PH4.5-5.0，0.05-0.1mol/L的PB为平衡溶液对阴离子交换层析柱进行平衡。
较佳地，步骤(1)中所述牛初乳为母牛产后48小时内的产乳；所述脱脂为连续碟片式离心机脱脂，温度30-50℃，转速4000-8000rpm；所述分离酪蛋白制备乳清为利用醋酸调节脱脂乳pH至4-6，20-40℃保温10-30分钟，利用卧式离心机对酪蛋白进行分离，然后再经过连续碟片式澄清离心机进行酪蛋白微粒的去除，澄清后的乳清pH调节到5-7。
利用本发明提供的方法能够高效连续地从牛初乳中工业化分离纯化免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和乳铁蛋白，所述高效不仅指该方法的生产效率高、能耗较低，而且还包括该方法生产的产品的生物活性和纯度都比较高。另外由于本发明所使用的工艺步骤(包括陶瓷膜超滤、离子层析等)的自身环保性使得本方法减少了对环境的污染。
【附图说明】
图1本发明一实施例的工艺流程示意图；
图2为利用本发明的方法得到的乳铁蛋白产品SDS-PAGE电泳图；
图3为利用本发明的方法得到的乳铁蛋白的HPLC标准曲线；
图4为利用本发明的方法得到的乳清、SigA洗脱液和SigA产品中的SigA的Western blot检测结果图。
【具体实施方式】
下面通过实施例多本发明进行进一步的描述。
实施例1从牛初乳中工业化分离纯化免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和乳铁蛋白
(1)制备乳清
牛初乳原料选取：选取母牛产后48小时内的产乳；
脱脂：连续碟片式离心机脱脂，温度45℃，转速5500rpm；
乳清制备：利用醋酸调节脱脂乳PH至4.6，40℃保温20分钟，利用卧式离心机对酪蛋白进行分离，然后再经过连续碟片式澄清离心机进行酪蛋白微粒的去除，澄清后的乳清PH调节到6.0。
(2)制得乳铁蛋白
微滤除菌：选用法国TAMI陶瓷膜，孔径0.45um，进行微滤除菌，操作压力0.1-0.2Mpa，操作温度20-35℃，切向流速4-6m/s，除菌率100％；
阳离子交换层析：选用Toyopearl GigaCap S-650M阳离子交换树脂，用PH为7.5-8.0，0.01-0.02mol/L的PB为平衡溶液对色谱柱进行平衡后，将微滤除菌后乳清PH调节到PH7.5-8.0后上样，洗脱采用1mol/LNaCl溶液洗脱，洗脱液利用MWCO 10KD陶瓷膜进行超滤浓缩脱盐，操作压力0.3-0.5Mpa，操作温度20-30℃，切向流速4-6m/s，浓缩液再经过冷冻干燥制得乳铁蛋白产品。
(3)制得免疫球蛋白A
阴离子交换层析：选用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换树脂，用PH4.5-5.0，0.05-0.1mol/L的PB为平衡溶液对色谱色谱柱进行平衡后，将经过阳离子交换层析的乳清调节PH4.5-5.0后上样，洗脱采用0.2-0.5mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱液利用MWCO 150KD陶瓷膜进行超滤浓缩脱盐，操作压力0.3-0.5Mpa，操作温度20-30℃，切向流速4-6m/s，浓缩液再经过冷冻干燥制得SigA产品。
(4)制得免疫球蛋白G
经过阴离子交换层析后的流穿液利用MWCO 100KD陶瓷膜进行浓缩脱盐，操作压力0.3-0.5Mpa，操作温度20-30℃，切向流速4-6m/s，浓缩液利用低温喷雾干燥，制得IgG产品。
图1更直观地表示了以上主要工艺流程。
实施例2本发明的方法得到的乳铁蛋白产品的鉴定
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定
将实施例1得到的乳铁蛋白产品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，所得的乳铁蛋白为单一条带，如图2所示，纵列1上的单一条即为乳铁蛋白条带，相对分子量为80000Da。
HPLC(高效液相色谱)测定
HPLC的使用条件：选用TSK-G3000PWxl凝胶色谱柱，流动相：0.02mol/L，pH 6.8的磷酸盐缓冲液，配制的流动相需要使用纯水，流动相使用前用0.22μm的微孔滤膜抽滤，以防止盐中的不溶颗粒损伤设备，并超声脱气20min。流速：1.0ml/min，检测波长：280nm，进样量：10.0μL，在室温中操作。
标准液的配制：精密称取标准品1.0mg，配制浓度分别为10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL的标准品溶液。
标准曲线：精密吸取浓度分别为10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL的标准品溶液10.0μL，注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积，绘制标准曲线。
可以利用HPLC所得的色谱图形，结合标准品保留时间，按照目的蛋白的出峰时间及峰面积积分比例得到纯度；回收率计算方法，将原料乳清和最终产品分别利用HPLC检测，结合标准品保留时间，确定目标峰，将峰面积和样品体积相乘，将最终产品的数值比上原料乳清的乘积数，得到回收率。
图3表示了根据实施例1制得的乳铁蛋白标准品建立的标准曲线。检测出的产品纯度为95％，回收率为80％。
实施例3本发明的方法得到的免疫球蛋白A产品的鉴定
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定
将实施例1得到的免疫球蛋白A(SigA)产品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，所得的SigA条带清晰，相对分子量为390000Da。
Western blot检测
Western blot检测方法：剪2块3MM超厚滤纸和一块硝酸纤维素膜(NC膜)，其大小约为胶＞滤纸≥NC膜。将NC膜用去离子水平衡30min，将剪好的3MM超厚滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡平衡5min。SDS-PAGE结束后，将凝胶取下，在去离子水中预平衡5min，在半干电转仪上，按照由上向下阴极-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-阳极的顺序将转移系统放置好。用干净的吸管赶走凝胶、滤纸和NC膜之间的气泡，并对齐边缘防止短路，接通电源(恒流1.5mA/cm2，4h)。转移结束后，将NC膜置于平皿中，用丽春红染色液染色5min，然后用去离子水冲洗，直至看到红色的蛋白条带，用铅笔标记好蛋白质的位置。用去离子水将NC膜上的蛋白条带洗脱干净，期间换水数次，用TBS洗NC膜10min，在25ml封闭缓冲液中室温下孵育NC膜1h，然后用15ml TBS/T洗NC膜3次，每次10min，将一抗(兔抗牛SigA，美国Accurate chemical& scientific corporation)；用一抗稀释缓冲液(根据抗体说明书配置，tris-HCl加tween)以1∶2000的比例稀释，用10ml一抗稀释液孵育NC膜，4℃过夜，用15ml TBS/T洗NC膜3次，每次10min，HRP-连接的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，北京索来宝生物技术公司)用封闭缓冲液以1∶5000的比例稀释，再用10ml二抗稀释液(根据抗体说明书配置，tris-HCl加tween)在室温下孵育NC膜1h，并轻轻摇动。用15ml TBS/T洗NC膜3次，每次10min，用5ml ECL Plus(2.5ml A液+2.5ml B液，混匀，静止1min)，在暗室中室温下孵育NC膜5min，吸干NC膜上多余的液体，将NC膜用自封袋装好，在暗室中用X-光片曝光，然后将曝光后的X-光片分别置于显影液和定影液中显影、定影，最后将结果扫描后保存。
按照上述方法分别对实施例1中得到的乳清、SigA洗脱液和SigA产品中的SigA进行Western blot检测，结果如图4所示，从左至右(即1到3)依次表示乳清、SigA洗脱液和SigA产品的Western blot结果，检测证明实施例1得到的SigA产品为纯度较高的SigA。
按照与实施例1相同的HPLC检测方法，利用SEC凝胶柱检测，测得产品纯度为20％，回收率为85％。
实施例4本发明的方法得到的免疫球蛋白G(IgG)产品的鉴定
Hitrap亲和层析检测
所需溶液如下：
结合液：pH7.00.02mol/L的磷酸盐缓冲液；
洗脱液：pH2.70.1mol/L的甘氨酸盐酸缓冲液；
IgG标准贮备液：称取实施例制得的IgG产品10mg，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至10ml，浓度为1.0mg/ml。
IgG标准系列溶液：用磷酸盐缓冲液稀释IgG标准贮备液分别为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml。
选用Pharmacia HI-Trap Protein G柱，流速为0.4ml/min，注入20μl样品，检测波长为280nm，分别用结合液和洗脱液进行洗脱。先测定0.2～1.0mg/ml的IgG标准溶液，其浓度和封面积相关，作标准曲线。然后称取样品，用结合液稀释，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进样。从标准曲线中即可读出样品中IgG的浓度。
RID检测方法：选用VMRD公司的IgG定量检测试剂盒。
以上两种方法的检测结果一致，产品纯度为80％，回收率为85％。