一种快速检测牛羊源成分的方法 【技术领域】
本发明属于分子生物学技术领域，涉及动物源性成分的快速检测方法，更具体的说是一种快速检测牛羊源成分的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观察加入1000×SYBRGreen后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情况。
背景技术
疯牛病(Mad COW disease)最早在1985年英国的阿什福特农场出现“可疑病例”，1986年11月研究人员对病牛做了病理组织学检查，发现脑组织产生许多海绵样小孔，定名为牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathy，BSE)，并确诊此病为牛的一种新病，1987年由Wells等首次报道。疯牛病的流行给世界养牛业、饲料工业、牛肉及其产品都造成了严重影响和损失，同时此病也严重地威胁着人类的生命和健康。
BSE的病原为朊病毒，痒病和疯牛病的共同特征是潜伏期长，具有传染性的致死性中枢神经系统疾病，包括人的震颤病，雅克氏病等等。朊病毒又非常类似于健康细胞，很难被抗体识别，感染后不刺激机体产生免疫反应，所以，对它的检测很困难。尚无法分离病原，因此无法用血清学方法检测抗体，也无法检测活体是否感染。因此，BSE只能依靠流行病学、临床症状、中枢神经系统病理组织学变化进行诊断，同时辅助以电镜技术、生化技术或免疫细胞化学法等做出综合诊断。世界各国都在寻找快速检测和杀灭BSE病原的方法，但目前尚无治疗和预防的药物。目前，普遍认为疯牛病的大规模爆发，其主要原因是牛食用了含有羊痒病朊病毒的肉骨粉所致。疯牛病的发生和蔓延已给欧盟国家养牛业和经济带来重大损失，而且感染人，危害人体健康，引发社会动荡。为此，英国自1988年起就禁止使用反刍动物饲料饲喂牛，随后世界上许多国家和地区都先后颁布了法律、法规以控制动物源性成分的使用。鉴于该病的主要传播途径是使用被疯牛病和绵羊痒病病原因子污染的肉骨粉等动物性饲料饲喂反刍动物，为了彻底切断疯牛病的传播途径，防止疯牛病在我国境内发生，我国也发布了关于禁止在反刍动物饲料中添加和使用动物性饲料的通知。禁止在反刍动物饲料中添加和使用动物性饲料产品：肉骨粉、骨粉、血粉、血浆粉、动物下脚料、动物脂肪、干血浆及其他血液制品、脱水蛋白、蹄粉、角粉、鸡杂碎粉、羽毛粉、油渣、鱼粉、骨胶等。
目前，动物源性成分(动物性饲料产品)鉴定的主要方法有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法，其中尤以分子生物学方法最为快速、灵敏。关于定性PCR、复合PCR、巢式PCR及实时荧光定量PCR的检测方法都有所报道。但采用牛源正向外引物COW-F3，牛源反向外引物COW-B3，牛源正向内引物COW-FIP，牛源反向内引物COW-BIP；羊源正向外引物SHEEP-F3，羊源反向外引物SHEEP-B3，羊源正向内引物SHEEP-FIP，羊源反向内引物SHEEP-BIP恒温扩增检测牛羊源成分的方法，尚未见文献报道。
【发明内容】
本发明的目的在于公开一种快速检测动物源性成分特别是牛羊源成分的方法及根据外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。本发明采用新型、高效、高灵敏度、高特异性的恒温扩增方法，能在一个小时内准确检测出样品中是否含有动物源性成分，特别是准确检测出样品中是否含有牛羊源性成分。为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：
两套用于检测牛羊源成分的特异性引物，其特征在于，包括牛源正向外引物COW-F3，牛源反向外引物COW-B3，牛源正向内引物COW-FIP，牛源反向内引物COW-BIP；羊源正向外引物SHEEP-F3，羊源反向外引物SHEEP-B3，羊源正向内引物SHEEP-FIP，羊源反向内引物SHEEP-BIP。序列见下表：
引物名称 引物序列(5’-3’) COW-F3 GACCCTCTTTATTATCTTTCAACT COW-B3 TCGGTTTGATGTTGGGAAT COW-FIP CTTCTCAAGGGGTGTTTTGTTTTAAAAAAAACACAACTTTTATCACAATCCA COW-BIP TTGCCTCTTTTATTACCCCTGTAATAAAAGGCTGGGGAATAGTACGAT SHEEP-F3 TCGCAGTAGCTATAATCCAAG SHEEP-B3 TGAAGTGAAATCATATGATGAGG SHEEP-FIP ATGGGTTTGGTGTGTCATTATGTGAAAACCTACGTATTTACTCTCCTAGT SHEEP-BIP TATCACATAGTAAATCCAAGCCCCTAAAAGGATGTTAGTAGGAGAGCG
每条引物分别配制成浓度为100μM的母液，取外引物各1μL，内引物各8μL，灭菌去离子水2μL，充分混合，为引物混合溶液。
本发明采用上述两套引物进行快速检测牛羊源成分的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)采用2套特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；
其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-5μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；
(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
本发明所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL。
本发明所述的嵌入剂SYBR Green加入量为1-2μL，浓度为1000倍。
本发明所述的检测方法，模板DNA指的待测样品采用CTAB法提取纯化得到的DNA。
本发明所述的引物混合溶液指的是将合成的引物粉末分别配成浓度为100μM的母液，然后取外引物各1μL，内引物各8μL，加灭菌去离子水2μL，充分混合，制得引物混合溶液。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面以牛羊源成分的检测方法对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63℃-65℃对核酸进行扩增，短时间扩增效率可达到109-1010个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。
2、引物设计
本研究依据牛羊源成分特异性基因结合处序列设计了4条引物。引物由上海生物工程公司合成。
引物序列表如下：
引物名称 引物序列(5’-3’) COW-F3 GACCCTCTTTATTATCTTTCAACT COW-B3 TCGGTTTGATGTTGGGAAT COW-FIP CTTCTCAAGGGGTGTTTTGTTTTAAAAAAAACACAACTTTTATCACAATCCA COW-BIP TTGCCTCTTTTATTACCCCTGTAATAAAAGGCTGGGGAATAGTACGAT SHEEP-F3 TCGCAGTAGCTATAATCCAAG SHEEP-B3 TGAAGTGAAATCATATGATGAGG SHEEP-FIP ATGGGTTTGGTGTGTCATTATGTGAAAACCTACGTATTTACTCTCCTAGT SHEEP-BIP TATCACATAGTAAATCCAAGCCCCTAAAAGGATGTTAGTAGGAGAGCG
3、反应条件
反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、牛羊源成分特异性引物、甜菜碱、MgSO4和反应缓冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据引物的效率和模板DNA质量变化，一般为1h或更少。加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃，持续2min而终止。
这项技术的优点就是不需要热循环。由于扩增是在恒温条件下进行的，因此仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度，不需要PCR仪等昂贵的仪器。
材料与方法：
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物；甜菜碱溶液；MgSO4溶液；dNTPs；
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：10×Buffer 2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，引物混合液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL。
(3)扩增反应过程：在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；
(4)扩增反应结束，取体系液3-25μL用不同的检测方法判断扩增与否。
4、扩增结果观察
有三种观察方法，适合不同情况下进行：
1)使用2％琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度地茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和阶梯状条带现象。结果见图1。
2)由于反应形成大量双链DNA产物，所以可直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过肉眼观察，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图2。
3)检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。在反应中，在核酸大量合成时，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。
本发明用于牛羊源成分检测的扩增方法，具有以下优点：
(1)操作简便：不需要复杂的仪器，只需一恒定温度就能反应。
(2)高特异性：该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高度特异性。
(3)快速高效：整个扩增不到1h即可完成，产量可达到109-1010个拷贝；
(4)鉴定简便：可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过SYBR Green颜色变化判断扩增与否。
附图说明：
图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、牛源性阴性对照、羊源性阴性对照、牛源性阳性对照和羊源性阳性对照。
图2为扩增产物加入SYBR Green结果图。自左向右依次为牛源性阴性对照、牛源性阳性对照、羊源性阳性对照和羊源性阴性对照。
图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为牛源性阴性对照、羊源性阴性对照、牛源性阳性对照、羊源性阳性对照和待测样品。
图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左至右为牛源性阴性对照、牛源性阳性对照、羊源性阳性对照、羊源性阴性对照和待测样品。
图5为扩增产物的电泳分析图谱。由左至右为Marker、牛源性阴性对照、羊源性阴性对照、牛源性阳性对照、羊源性阳性对照和待测样品。
具体实施方式：
为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明试验的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用到的试剂及原料均有市售。另外特需加以说明的是：1.本发明所述的引物序列见表1。2.牛羊源模板DNA的提取：常规CTAB法提取(见附件)。
实施例1
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0.2M MgSO4溶液；
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；
(3)扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；
(4)扩增反应结束，取体系液15μL，直接向扩增管中加入嵌入剂1μL 1000×SYBRGreen，振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图3，由图可见，待测样品为牛源性阳性样品，羊源性阴性样品，待测样品中含有牛源成分的反刍动物饲料(肉骨粉)。
实施例2
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0.2M MgSO4溶液；
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4，混合引物0.25μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水 补齐到25μL，混合均匀后离心；
(3)扩增反应程序：在65℃进行45min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；
(4)扩增反应结束，取体系液15μL，直接向扩增管中加入嵌入剂2μL 1000×SYBRGreen，振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图4，由图可以看出，待测样品为阳性样品。待测样品中含有牛羊源成分的反刍动物饲料(肉骨粉)。
实施例3
(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0.2M MgSO4溶液；
(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO4，混合引物0.25μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 5μL，用灭菌去离子水 补齐到25μL，混合均匀后离心；
(3)扩增反应程序：在63℃进行45min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；
(4)扩增反应结束，取体系液25μL经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶梯状条带。结果见图5，待测样品中含有牛羊源成分的反刍动物饲料(肉骨粉)。
附件：常规CTAB法提取DNA的方法
(1)取饲料样品约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止；
(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；
(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。
(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。
(7)干燥DNA沉淀，加100μL水或TE缓冲液溶解DNA。
【序列表】
<110>天津市农业科学院中心实验室
<120>一种牛羊源成分的快速检测方法
<160>8
<210>1
<211>24bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gaccctcttt attatctttc aact 24
<210>2
<211>19bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tcggtttgat gttgggaat 19
<210>3
<211>52bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cttctcaagg ggtgttttgt tttaaaaaaa acacaacttt tatcacaatc ca 52
<210>4
<211>48bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ttgcctcttt tattacccct gtaataaaag gctggggaat agtacgat 48
<210>5
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tcgcagtagc tataatccaa g 21
<210>6
<211>23bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tgaagtgaaa tcatatgatg agg 23
<210>7
<211>50bp
<2l2>DNA
<213>人工序列
<400>7
atgggttt ggtgtgtcat tatgtgaaaacc tacgtatttac tctcctagt 50
<210>8
<211>48bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
tatcacatag taaatccaag cccctaaaag gatgttagta ggagagcg 48