一种定向诱导软骨细胞的方法 【技术领域】
本发明属生物技术领域。涉及一种定向诱导软骨细胞的方法，具体涉及一种采用人类羊膜上皮细胞定向诱导软骨细胞的方法。
背景技术
研究报道，关节外伤和退行性改变等引起的软骨损伤可导致关节长期的疼痛和功能障碍，甚至关节废用，给患者生活带来极大的痛苦和不便。关节软骨无血液供应和神经支配，损伤后几乎不能自发修复，在某些情况下可发生自发性修复反应，但新生的组织是纤维软骨组织，与正常的透明软骨在组织结构和生物化学方面有很大的不同，并且在生理负荷下会发生退行性改变，最终发展成骨性关节炎。传统的治疗方法，如微骨折、软骨下钻孔、软骨以及软骨膜移植等，只能暂时的缓解疼痛等症状，均不能成功完成透明软骨的修复，其中的软骨下钻孔亦仅适用于软骨损伤面小的病例；自体软骨组织、软骨膜移植，需要二次手术，并且可引起取材部位损伤；人工全关节假体置换花费高、并发症多，并且不适合年轻患者。随着生命科学和工程学的发展，有研究利用工程学方法和手段构建和再生各种组织和器官替代病损组织，并取得了显著的成就，为软骨疾病的治疗开辟新的途径。构建生物特性与正常关节软骨相似的组织工程软骨成为目前组织工程研究的热点之一。
现有技术公开了有关软骨组织工程3要素：一定数量的种子细胞、合适的支架材料和体外培养条件的优化。组织工程化关节软骨在很大程度上依赖于种子细胞的选择。目前研究用于组织工程软骨的种子细胞有软骨细胞、胚胎源性细胞、间充质干细胞、骨膜细胞、滑膜细胞等。
据国外研究证实胚胎源性细胞(胚胎干细胞)比成体系统的软骨细胞有更强的增殖能力，并且没有引起明显的异体排斥反应，以其作为种子细胞修复关节软骨缺损获得良好的效果，修复组织也未见明显退变，但其来源及其伴随的伦理问题是限制其应用的最大问题。人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，HAECs)来源于正常剖宫产后废弃的胎膜，不破坏正常胚胎，无需在胚胎早期终止胚胎发育，不存在引起医学伦理争议，同时人羊膜上皮细胞具有前期胚胎干细胞的多向分化潜能，羊膜上皮细胞也很少表达HLA-A、B、C或DR等抗原，移植后不易产生免疫排斥反应，有希望成为构建软骨组织工程的种子细胞源。与本方法相关的现有技术及软骨组织工程的实验原理有如下参考文献：
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发明内容：
本发明的目的是提供一种定向诱导软骨细胞的方法，具体涉及一种采用人类羊膜上皮细胞定向诱导软骨细胞的方法。
本发明利用组织工程学方法，采用人类羊膜上皮细胞(human amniotic epithelialcells，HAECs)作为软骨组织工程的种子细胞，构建和再生生物特性与正常关节软骨相似的组织工程软骨。
本发明依据组织工程基因学原理，通过体外培养人羊膜上皮细胞，进行羊膜上皮细胞的原代、传代培养，观察调整羊膜上皮细胞基因型，利用细胞因子(转化生长因子β，TGF-β)和BMP-7诱导和调控其定向诱导分化成软骨细胞，通过分子生物学方法检测诱导分化的细胞的软骨细胞特性及软骨细胞活性，明确人羊膜上皮细胞定向诱导软骨细胞的调控机制，结果表明人羊膜上皮细胞可以作为软骨细胞诱导分化的种子源。本方法为软骨组织工程的应用提供了理论和实践基础。
本发明方法包括下述步骤：
1)人羊膜上皮细胞的体外原代、传代培养；
2)调控人羊膜上皮细胞(类胚胎干细胞)基因型，利用细胞因子(转化生长因子β，TGF-β)和BMP-7干预调控定向诱导软骨细胞；
3)软骨细胞活性测定，
检测诱导分化的细胞的软骨细胞特性及抗凋亡特性；
4)诱导分化调控的通过依赖于转录因子Sox9的转录活性作用于II型胶原Col2a增强子序列，在CBP/p300的共同参与下，使Col2a1的表达上调，测试起始软骨细胞的分化信号传导通路。
诱导后的软骨细胞电镜观察结果显示，诱导后软骨细胞呈圆形或多边形，细胞膜完整，呈扇蛤样突起，细胞质均匀一致，可见大小不等空泡及溶酶体，细胞浆中线粒体较少，细胞核完整。
本发明所采用的组织工程软骨种子细胞-人羊膜上皮细胞来源于正常剖宫产后的胎膜。
本方法所述的羊膜上皮细胞在胚胎发育上起源于桑椹胚的外胚层细胞团，由于羊膜是胚胎发育的早期产物，羊膜上皮细胞具有前期胚胎干细胞的多向分化潜能，同时很少表达人类组织白细胞抗原HLA-A、B、C或DR抗原，移植后不易产生免疫排斥反应，本发明采用了特定的人类羊膜上皮细胞作为组织工程软骨种子细胞，取材方便，具有较广阔的前景，有望成为构建软骨组织工程的种子细胞源。
【附图说明】
图1是人羊膜上皮细胞的体外原代/传代培养相差显微镜观察MSCs黏附、生长、增殖情况，
其中，A：培养第2代的人类羊膜上皮细胞，B：培养第4代地人类羊膜上皮细胞。
图2是倒置显微镜下观察诱导软骨细胞形态。
图3是1％甲苯胺蓝染色观察诱导软骨细胞形态。
图4是免疫组化荧光试验观察诱导软骨细胞活性。
图5是诱导后软骨细胞电镜观察结果。
【具体实施方式】
实施例1
(一)人羊膜上皮细胞的体外原代、传代培养
采用经剖腹产手术废弃后的胎膜标本12例，按常规方法将羊膜与绒毛层钝性分离，置于含有双抗(100μ/ml青霉素、100μg/ml链霉素)的PBS中反复冲洗。将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm×1mm小块，加入0.2％的胶原酶在37℃孵箱静置消化2h，1000r/min离心5min，吸出胶原酶消化液，再加入0.25％的胰蛋白酶消化液在室温下消化15min，用含血清的培养基终止消化，再用200目的筛网过滤，收集细胞悬液，1000r/min离心5min，以1×105个/ml密度的羊膜上皮细胞2ml细胞接种于培养瓶中，置5％CO2、37℃培养箱内培养，隔天换液1次，一般5～7d以1∶3传代1次。细胞生长增殖到80％融合时要及时传代。吸尽培养基，培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化5min。相差显微镜下见胞质回缩，细胞间隙增大后终止消化，吸除消化液，加入含血清的培养基中止消化，轻轻吹打，制成细胞悬液，细胞计数后按1∶2～3比例接种培养，培养条件同上，隔天换液。
细胞生长曲线结果显示：
原代接种后的2～6d为人羊膜上皮细胞(HAECs)生长的潜伏期，此期主要为HAECs的贴壁生长阶段，培养细胞的增殖不甚活跃；第7天开始，倒置显微镜下可见贴壁细胞形成大小不一的多个细胞克隆，表明此时细胞的增殖开始活跃；第7～9天该些细胞克隆进一步扩大，许多细胞克隆彼此相连，细胞生长曲线显示此阶段细胞数目呈指数级递增，此期为HAECs原代培养生长的对数增殖期；第10～14天，细胞克隆相连并铺满培养孔底面的大部分，细胞生长曲线显示HAECs生长进入一个平台期；传代培养潜伏期约为24～36h；传代培养对数增殖期约为4～6d；对数增殖期结束后至接种后第8-9d，HAECs生长逐渐缓慢，进入平台期。
如图1所示，人类羊膜上皮细胞经体外培养原代/传代培养后光镜200倍摄片，如图示见传代第4代细胞生育周期繁殖潜力较好，具有较好的贴壁生长能力，贴壁细胞体积较大，均为一致的梭形细胞。经三周无血清培养液诱导培养，部分细胞开始变为宽阔、平坦的多边形及多伪足伸展形细胞，继之部分细胞转变为圆形或椭圆形，细胞周围分泌了大量的基质。
(二)调控人羊膜上皮细胞(类胚胎干细胞)基因型，定向诱导软骨细胞
调整人羊膜上皮细胞(类胚胎干细胞)基因型，诱导和控制其向成软骨细胞方向分化，所述人羊膜上皮细胞转染特定的蛋白或生长因子，特别是影响成软骨分化的转录因子，如Sox家族(SRY-type high mobility group box family)：Sox5，Sox6，Sox8，Sox9；Lc-Maf(long form of the c-Maf transcription factor)，CREB结合蛋白[CREB-binding protein(CBP/p300)]，Nkx3.2，Pax9(paired-box containing protein)以及Smad家族的一些成员可引发软骨发生。由TGF-β等信号介导的诱导途径，其分子机制涉及Sox-9转录调控信号传导通路，并通过依赖于转录因子Sox9的转录活性作用于II型胶原Col2a1增强子序列，在CBP/p300的共同参与下，使Col2a1的表达上调，起始软骨细胞的分化。
本方法优选利用转化生长因子TGF-β和骨形成发生蛋白-7(bone morphogeneticproteins-7，BMP-7)作为诱导因子，II型胶原固定成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactors，FGF)及胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，IGF)形成培养支架材料进行人类羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，HAECs)体外培养诱导软骨细胞。
将传代的人羊膜上皮细胞(HAECs)悬液以1/ml接种于预先置入盖玻片的6孔培养板，直径3.5cm，各孔加入2mlH-DMEM完全培养液，次日换为2mlH-DMEM无血清诱导培养液，其中分别含转化生长因子TGF-β10ng/ml、骨形成发生蛋白-7(bonemorphogenetic proteins-7，BMP-7)1μg/ml、地塞米松100nMol/L、维生素C50μg/ml、胰岛素10U/ml、甲状腺素50ng/ml、β-甘油磷酸钠20mMol/L和牛血清白蛋白1.25mg/ml；对照孔内只加入2ml完全H-DMEM培养液培养，隔日换液一次。分别在诱导后第7、14、21天，取出盖玻片，进行相应检测-倒置显微镜下观察细胞形态(见图2)、1％甲苯胺蓝染色(见图3)、免疫组化染色(见图4)、电镜观察细胞外形及基质(见图5)。
结果显示，所述的TGF-β1体外分别在1、10、50、100mg/L时都可诱导MSCs向软骨方向分化，但是在10mg/L时作用最佳；所述的生长因子的作用在一定范围内具有剂量依赖性，超出该所述范围作用则不明显；软骨细胞具有多种生长因子的受体，不同的生长因子作用于不同的生长周期，一种生长因子可以调节其他生长因子的表达和活性，如BMP-7或IGF-1单独应用不能诱导MSCs向软骨方向分化，但与TGF-β3合用时，较单用TGF-β3能更有效的诱导MSCs向软骨方向分化。
(三)检测诱导分化的细胞的软骨细胞特性、软骨细胞增殖活性、抗凋亡能力
分别采用下述检测方法与指标：
采用相差显微镜观察MSCs黏附、生长、增殖情况；
采用扫描电子显微镜下观察软骨细胞组织学形态、增殖情况；
采用MTT比色法检测活性软骨细胞存活和增殖能力；
采用3H-Proline测定软骨细胞活性，定性判定并定量检测；
采用TUNEL染色法进行软骨组织中软骨细胞凋亡的检测；
采用RT-PCR检测Caspase-3mRNA序列的表达；
采用ELISA分析Caspase-3蛋白酶活性；
采用RT-PCR检测MMP-1和MMP-13的表达；
检测Bcl-2蛋白表达。
所述RT-PCR反应通过下述步骤：
(1)总RNA的提取：取股骨内髁内侧软骨组织置1ml Trizol液中匀浆，按说明书的步骤提取总RNA；
(2)逆转录：反应体积为50μl：总RNA 1μg，70℃变性5min后转冰盒，加入50mg/L随机引物1μl，RNasin 1μl，10mmol/L dNTP 2μl，5×buffer 10μl，RTase1μl，无RNA酶水补至50μl，42℃ 60min后，95℃ 5min终止反应；
(3)PCR扩增：反应体积50μl，10mmol/L dNTP 1μl，25mmol/L MgCl2 4μl，10×buffer 5μl，3’premier 0.5μl，5’premier 0.5μl，cDNA 4μl，Taq酶2U，去离子水补足至50μl，95℃预变性5min，95℃变性45s，在MMP-1：55℃，MMP-3：57℃，TIMP-1：60℃，GAPDH：57℃的温度退火45s，72℃延伸45s的条件下循环扩增，其中GAPDH行30个循环，MMP-1，-3和TIMP-1行35个循环，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外透射仪下观察扩增产物特异条带；
(4)产物经法国VL凝胶成像及分析系统进行图像分析，测定条带的吸光度(A)值，以GAPDH作内参照，用MMP-1，-3和TIMP-1条带的A值分别与GAPDH的A值的比值表示其表达的相对水平。
(四)诱导分化调控Sox-9转录调控信号传导通路研究
免疫酶联试验、Western bolt蛋白检测Sox-9蛋白表达，明确其表达水平在诱导分化后细胞的变化，明确TGF-β、Sox-9调控作用于II型胶原Col2a1增强子序列，在CBP/p300的共同参与下，使Col2a1的表达上调，起始软骨细胞的分化信号传导通路的作用机制。